一、纳豆激酶分离纯化及性质研究（论文文献综述）
张轩[1]（2021）在《产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用》文中认为枯草芽孢杆菌广泛存在于传统发酵食品内,可产生多种对人体有益的生物活性物质。枯草芽孢杆菌发酵的纳豆因其富含具有抗血栓功能的纳豆激酶（Nattokinase）,作为一种风味食品受到部分消费者的青睐。枯草芽孢杆菌液体发酵生产的纳豆激酶也已被用于抗血栓功能食品或药品的制备。另外,也有报道,口服枯草芽孢杆菌可调节机体肠道菌群和免疫功能,发挥抗炎、抗肿瘤以及延缓衰老等作用。目前,纳豆激酶口服产品的剂型单一,且耐胃酸和肠道缓释能力较差;枯草芽孢杆菌益生菌制剂主要为冻干菌粉,食用人群局限。上述产品的局限性,限制了其应用范围。本研究针对上述产品的不足,利用筛选的同时产生纳豆激酶和凝乳酶的枯草芽孢杆菌菌株,研制了一种新型的枯草芽孢杆菌功能发酵乳和一种纳豆激酶口服缓释制剂,对其制备工艺和相关功能进行了系统研究。主要研究内容和结果如下:首先,用从自然界采集的稻草作为发酵菌种的来源制作纳豆,从自制纳豆浸出液中分离、筛选出产双酶（纤维蛋白溶解酶和凝乳酶）的菌株。通过对菌株形态观察和生化特性检测,结合16S rDNA基因序列测定结果,确定此菌株为枯草芽孢杆菌,命名为B.subtilis JNFE0126。在优化后的培养条件下,该菌株产纳豆激酶活性最高达14512.4IU/mL,产凝乳酶活性最高达875.5 SU/mL,可以满足中性条件下制备凝固型发酵乳的要求。酶抑制剂试验结果表明,发酵液纤溶活性来源于丝氨酸蛋白酶,凝乳活性来源于金属蛋白酶。提取该菌株的DNA,根据基因库中已经报道的纳豆激酶和凝乳酶（金属蛋白酶M4）的基因序列设计引物进行PCR基因调取扩增后测序,结果表明该菌株具有上述两种酶的基因,其序列分别与已经报道的纳豆激酶和金属蛋白酶M4具有高度相似性（同源性分别为99.1%和97.6%）。其次,分别收集B.subtilis JNFE0126纳豆激酶和凝乳酶最高产酶期的发酵液,采用硫酸铵沉淀、离子交换色谱及凝胶过滤色谱分别对纳豆激酶和凝乳酶进行分离纯化,然后用SDS-PAGE检验样品纯度及测定其相对分子质量。结果表明,纯化的纳豆激酶和凝乳酶的相对分子质量分别为27 KD和42 KD左右。纳豆激酶最适温度为40℃,最适pH为7.0,pH 6.0-9.0条件下具有较高的酶活和较好的稳定性。凝乳酶的最适作用温度为55℃,最适pH值为6.5,在pH 6.0-8.0条件下具有较高的酶活,在pH 5-10条件下有较好的的稳定性。在此基础上,研究并优化了B.subtilis JNFE0126发酵鲜牛乳制作凝固型发酵乳的配方和发酵条件,评价了所得产品的品质特性和抗血栓功能。优化的配方和发酵条件为:鲜牛乳,大豆蛋白2%,蔗糖4%,羟丙基二淀粉磷酸酯1.5%,果胶0.1%,藻酸丙二醇酯（PGA）0.1%,发酵温度41℃,发酵时间8 h。得到发酵乳为软嫩的乳白色凝乳块,奶香浓郁,口感爽滑,无明显不良风味。扫描电镜观察表明,凝乳块内部呈现海绵状微观结构,酪蛋白胶束及亚胶束相互交联形成整体的三维结构,胶束间仍然存在大量微细孔隙,这些孔隙起着保持水分的作用。发酵乳的纤溶活性达215.1 U/mL,4℃储藏14天酶活性可保留66%,储藏60天活性仍保留43%;小鼠黑尾试验表明,口服该发酵乳具有显着的体内抗血栓效果。应用Dextran sulfate sodium salt（DSS）诱导性炎症性肠病动物模型评价了上述发酵乳对肠道菌群的调节作用和对炎症性肠病的防治效果,并探讨了其作用机制和实际应用前景。动物疾病症状观察和肠道组织病理分析结果表明,口服B.subtilis JNFE0126发酵乳可明显减轻DSS诱导性炎症性肠病动物的疾病严重程度,减轻动物的肠道粘膜的出血、炎症和溃疡等病理损伤;动物肠道菌群的检测分析和和肠粘膜内炎症相关因子和上皮再生相关蛋白表达水平的测定结果表明,口服B.subtilis JNFE0126菌株发酵乳可调节动物的肠道菌群,增加菌群的多样性,抑制有害菌生长;该发酵乳可抑制肠道粘膜内炎症因子表达水平,提高炎症抑制因子表达水平,因而减轻肠粘膜的炎症性损伤。与此同时,B.subtilis JNFE0126发酵乳可促进肠粘膜上皮干细胞的增殖分化,促进粘膜细胞的粘液蛋白和上皮连接蛋白的表达,加速肠粘膜屏障和上皮屏障的修复,从而抵御有害菌和炎症因子的侵入。最后,研制了一种具有双层壳-核结构（壳聚糖核-纳豆激酶-酪蛋白）的纳豆激酶口服缓释颗粒,并通过动物试验评价其在体内抗血栓作用。采用壳聚糖为核心,京尼平为壳聚糖核-纳豆激酶交联剂,牛乳酪蛋白为颗粒外层保护材料,TG酶为保护层的交联剂,按照分步交联的程序制备纳豆激酶缓释颗粒。用扫描电子显微镜对获得的缓释颗粒进行形态学分析,并使用纳米金交联的IgG作为模型药物验证了酪蛋白保护层的包埋效果,确定其形成了双层壳-核结构。通过体外模拟胃、肠液消化试验测定了该缓释颗粒的释放动力学特征,结果表明该颗粒在胃酸中能有效保护纳豆激酶活性,并在肠液中缓释达12小时。最终对该缓释颗粒进行动物口服试验,动态观察颗粒内纳豆激酶的体内缓释过程及其抗血栓效果。结果表明,上述纳豆激酶口服缓释颗粒具有很强的抗胃酸能力,并在肠道内可缓慢释放出纳豆激酶及其不同大小相对分子质量的具有纤维蛋白溶解活性的降解产物,缓释过程超过12小时。小鼠黑尾模型动物口服该颗粒,可明显抑制小鼠尾部血管内的血栓形成并促进血栓溶解,效果显着优于口服游离纳豆激酶。综上所述,本研究利用筛选的B.subtilis JNFE0126制备的发酵乳具有抗血栓和调节肠道功能的作用,有良好的应用前景。本研究开发的纳豆激酶口服缓释颗粒具有耐胃酸能力和肠道缓释功能,可提高纳豆激酶的口服利用度,有望作为功能食品添加剂用于研制抗血栓功能食品。
王玉雪[2]（2021）在《高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌的诱变选育及组学分析》文中研究说明纳豆激酶（nattokinase,NK）是由枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）产生的一种丝氨酸蛋白酶,具有溶栓活性强和作用时间长等优点,其作为一种新型的溶栓剂和保健食品受到广泛关注。纳豆激酶一般由枯草芽孢杆菌发酵生产,但其仍存在酶活和产量不高等问题。本论文拟以实验室前期筛选的Bacillus subtilis JNFE0126为出发菌株,通过紫外和60Co-γ射线组合诱变获得高产纳豆激酶菌株,并对诱变菌株发酵条件进行优化进一步提高酶活。最后采用二代测序技术和三代测序平台对原始菌株和诱变菌株进行基因组和转录组测序,从组学角度探究诱变菌株高产纳豆激酶分子机制。主要研究结果如下:（1）以原始菌株Bacillus subtilis JNFE0126为研究对象,在紫外灯功率15 W/m2,处理时间为120 s诱变条件下,得到UV-4突变菌株的酶活最高,在24 h发酵条件下可达1282.47 IU/m L。以UV-4突变株为60Co-γ射线诱变出发菌株,在400 Gy处理剂量诱变条件下,获得一株遗传性状稳定且高产纳豆激酶的诱变菌株,并且命名为Bacillus subtilis JNFE1126。在摇瓶发酵培养60 h后,其酶活达到12656.46 IU/m L,比原始菌株提高l.27倍。（2）对Bacillus Subtilis JNFE1126诱变菌株从碳源,氮源,表面活性剂方面进行发酵条件优化,确定发酵培养基配方为10 g/L葡萄糖,30 g/L豆粕粉,2 g/L磷酸氢二钠,1 g/L磷酸二氢钠,0.2 g/L氯化钙,0.5 g/L氯化镁,1 m L/L吐温80,发酵培养60 h,纳豆激酶酶活为15030.31 IU/m L。对诱变菌纳豆激酶酶学性质进行研究,温度低于20℃时,酶活性相对稳定,在p H 8-p H 12范围内酶活性较稳定。（3）采用Illumina Hi Seq二代测序系统和Pac Bio三代测序系统对原始菌株Bacillus subtilis JNFE0126和诱变菌株Bacillus subtilis JNFE1126进行全基因组测序。结合全基因组数据,进行GO、COG、KEGG代谢通路、同源基因及SNP分析,发现原始菌比诱变菌多了6个CDS,在JNFE1126基因组中检测到13个插入,2个缺失和28个SNP。突变基因功能主要集中在氨基酸转运代谢,碳水化合物转运代谢,转录,能量产生和转化。（4）对原始菌株JNFE0126和诱变菌株JNFE1126发酵24 h的时间点进行转录组测序,筛选差异表达基因1425个,对差异基因进行GO,KEGG功能注释和代谢通路富集分析,探讨诱变菌株高产纳豆激酶的可能机理。结果表明,诱变菌中参与氨基酸代谢,能量产生相关的Nad B（L-天冬氨酸氧化酶）,Ndh F（NADH脱氢酶）等基因表达上调,促进能量的产生,生物量的增加;纳豆激酶转录水平调控相关的Com P（组氨酸激酶）基因表达上调和Cod Y（转录因子）等基因表达下调以及分泌相关的Sec Y（内膜蛋白转座酶成分）等基因上调分别促进纳豆激酶的产生与分泌,酶活增加。利用实时荧光定量PCR验证基因的差异表达情况,结果与转录组测序结果一致。
李秀凉,李倩文,朱玉,韩晓云,孙庆申,宋永[3]（2020）在《纳豆芽孢杆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析》文中研究表明以菜用大豆为原料,直投式纳豆芽孢杆菌作为发酵剂,纳豆激酶活力作为评价指标,通过单因素和正交试验优化纳豆激酶发酵工艺条件;通过盐溶、硫酸铵分段盐析、二乙氨乙基（DEAE）阴离子交换柱分离纯化纳豆激酶,并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定其分子质量,并进行酶学性质和体外溶栓效果分析。结果表明,菜用大豆发酵生产纳豆激酶的最佳条件为:每100 g蒸煮菜用大豆接入1.15×1011CFU/g直投发酵剂,发酵温度37℃、发酵时间36 h、后熟时间18 h时,此时纳豆激酶活力可达2 326.60 IU/g。纳豆激酶的分子质量介于25～35 kDa之间,最适作用温度、pH值分别为37℃、8.0,当温度低于40℃、pH值在6.0～8.0时较稳定;体外溶栓实验表明纳豆激酶具有良好的体外溶栓效果。
朱玉[4]（2020）在《纳豆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析》文中研究指明纳豆是一种具有多种保健作用的传统发酵食品。纳豆激酶（Nattokinase,NK）是由纳豆芽孢杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶,能显着溶解体内外的血栓,被认为是一种很有研究意义的溶栓剂。本实验利用企业出口后剩余的菜用大豆等外品,使用纳豆菌发酵,以纳豆激酶活力大小作为指标,对纳豆的发酵条件进行优化,对纳豆激酶进行提取和初步纯化,并对其部分性质进行研究,为菜用大豆精深加工产品开发及企业出口后剩余等外品的处理带去一种新的方向。通过单因素和正交实验确定的最佳发酵方案为:发酵温度为37℃,接种量为0.02 g/100 g,发酵时间为36小时,后熟时间为18小时,该条件下发酵的纳豆中纳豆激酶的活性为2326.60 IU/g。后熟好的纳豆外观呈黄绿色,表面附有一层均匀的白膜,没有明显的氨臭味,经搅拌后会出现不易断裂的拉丝。分别采用20%和60%饱和度的硫酸铵分段盐析去除杂蛋白质和沉淀纳豆激酶、DEAE阴离子交换层析初步分离纯化纳豆激酶。经SDS-PAGE电泳检验,所提取的纳豆激酶的分子质量在2535 k Da之间,纯化倍数达到16.3倍,回收率为22.5%。对纳豆激酶的部分性质进行研究,结果表明,纳豆激酶最适温度是37℃,在低于40℃时稳定性较好;最适p H值为8.0,在p H 6.08.0的范围较稳定;纳豆激酶体外的溶栓实验结果表明:加入粗酶液（20 mg/m L）组试管内的血凝块,5 h后溶解率达到77.55±0.45%,比对照组高41.93%;10 h后溶解率达到90.25±1.90%,比对照组高59.11%,说明纳豆菌发酵菜用大豆等外品产生的纳豆激酶具备一定的体外溶栓功效。
郑丹妮[5]（2020）在《多菌种复合发酵低氨味纳豆工艺的研究》文中研究表明纳豆是由纳豆芽孢杆菌发酵大豆而成的一种历史悠久的发酵食品,具有极为丰富的营养价值和强大的保健功能。其独特的生理活性物质纳豆激酶,具有较强的纤溶活性,生物安全性好,有利于预防多种心血管疾病。我国市场上的大部分纳豆发酵产品其纳豆激酶活性不高,且大部分的国内研究关注单菌发酵纳豆工艺的优化,关于双菌混合发酵制备纳豆的研究暂时不多。因此深入研究探索双菌发酵纳豆的工艺,拓展提高纳豆激酶活力和纳豆风味的新思路是十分有必要的。本论文通过涂布平板划线分离、观察菌落形态和水解圈挑选,分离纯化出9株纳豆芽孢杆菌,购买菌种保藏中心的1株菌株,共10株,对这些菌株进行生理生化实验,并活化种子液选取合适梯度涂布到淀粉培养基和酪蛋白培养基上,以生理生化实验结果和培养基水解圈菌落直径比值（C/H）为指标,剔除4株菌,鉴定留下6株菌株为纳豆芽孢杆菌,分别编号为N1、N2、N3、N4、N5、N6,绘制6株菌株的生长曲线图,并使用6株菌株的活化种子液发酵纳豆并测量其纳豆激酶活力。其中菌株N3和N5的生长活力和发酵纳豆后纳豆激酶酶活较其他菌株明显更优,菌株N3发酵的纳豆酶活为218.5U/g,菌株N5发酵的纳豆酶活为352.3U/g。筛选出的生长活力高产酶能力好的两株菌株N3和N5后,进行双菌发酵纳豆实验以提高酶活,通过单因素和正交试验得到双菌株发酵纳豆的最适宜工艺条件:菌种比例（N5:N3）为4:1,接种量为8%,发酵时间为25h,发酵温度为35℃。在此条件下发酵的纳豆,挥发性盐基氮含量为205.2mg/100g,纳豆激酶酶活达481.8U/g远高于单菌发酵的纳豆。实验说明使用两株纳豆芽孢杆菌共同发酵纳豆,可在一定程度上提高纳豆的酶活。使用筛选出的菌株N5和酵母菌S1进行纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆实验以期在不降低酶活的情况下,减少发酵纳豆中挥发性盐基氮含量,并提高其感官评价评分。通过单因素和正交试验得到纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆的最适宜工艺条件:菌种比例（N5:S1）3:1,接种量为4%,发酵时间为45h,发酵温度为35℃。在此条件下发酵的纳豆,酶活为341.25U/g,挥发性盐基氮含量为198.66mg/100g,感官评价得分为85.71。与单菌发酵纳豆相比,纳豆菌-酵母菌复合发酵在不降低酶活的情况下,使纳豆的氨腥味有所降低,产品纳豆伴有微弱的香气,感官品质优良。实验说明,酵母菌对去除纳豆菌中令人不喜气味有一定的作用,但是工艺尚未完善,对于使用酵母菌或其他食品发酵菌种以去除纳豆中令人不喜气味的研究仍旧可以继续深入。
赵晨煊[6]（2019）在《文冠果油粕固态发酵制备纳豆激酶及其抗金黄色葡萄球菌活性的研究》文中指出文冠果油粕是文冠果种子经冷榨油后的副产物,营养丰富,随着文冠果栽植面积的逐年扩大,其总产量也越大,但未能高效利用,多用于饲料或肥料等粗产品,综合利用价值低。为充分开发和利用文冠果油粕,提高其附加值,本文以文冠果油粕为固态发酵培养基基质制备纳豆激酶,并对纳豆激酶的分离纯化和抗菌性进行了一系列研究,主要结果如下:（1）文冠果油粕固态发酵制备纳豆激酶的最优工艺条件组合:油粕与甘蔗渣的质量比4:1,速效碳氮源和无机盐分别是木糖、硫酸铵和硫酸镁,添加量依次为1.9%、1.3%、0.3%,初始料水比是1:2,纳豆芽孢杆菌接种量为11.63%,在37℃下发酵56h。在上述条件下,试验所得纳豆激酶的活性为1114.80U/mL,与优化前相比,所得纳豆激酶活性提高了约60.8%。（2）文冠果油粕固态发酵产物经三相分离法分离纯化纳豆激酶的工艺:在温度为23℃-37℃,体系pH为8.0的条件下,加入硫酸铵至饱和度为60%,之后将体积比为1.5:1的叔丁醇与粗酶液充分混合,在上述条件下,分离纯化得到的纳豆激酶对纤维蛋白的溶解效果显着,活性达3574.28 U/mL,纯化倍数为4.8,回收率为25.66%。这表明:文冠果油粕完全适用于作为纳豆芽孢杆菌的培养基制备纳豆激酶,其发酵产物浸提液经三相分离法可获得活性、纯化倍数和回收率高的纳豆激酶,且操作简单,成本低,这为纳豆激酶的规模化生产提供了新工艺。（3）文冠果油粕固态发酵产物经分离纯化得到的纳豆激酶抗金黄色葡萄球菌的活性:在金葡菌的生长初期,同样也是其生物膜形成的初始阶段,纳豆激酶对金葡菌的抑制效果最强。尤其与纳豆激酶单独作用时的抑菌效果相比,纳豆激酶与抗生素（万古霉素、利福平）联合作用时的抑菌效果更为显着,这表明纳豆激酶在预防金葡菌感染方面具有应用潜力。
王镭[7]（2019）在《纳豆激酶的制备与分离纯化研究进展》文中提出本研究介绍了高产纳豆激酶菌种的育种、纳豆激酶的生产方式、纳豆激酶的分离纯化和检测方法。探讨了纳豆激酶产品开发中的问题及相应的解决策略,以期为纳豆激酶产品的开发提供参考。
刘晓宇[8]（2019）在《鹰嘴豆纳豆发酵工艺优化及纳豆激酶的分离纯化研究》文中研究表明纳豆是将纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis）接种到煮熟的大豆中,在一定条件下发酵而成的传统豆类发酵食品。具有溶血栓、抗氧化、抗肿瘤、预防骨质疏松等多种保健功能。纳豆中的纳豆激酶具有良好的溶栓功能,已成为目前的研究热点。本课题选取四种豆类作为发酵原料,对鹰嘴豆纳豆固体发酵工艺进行了优化,同时对纳豆激酶提取纯化工艺进行了研究,并通过加速储存实验对鲜纳豆及纳豆激酶冻干粉的储存稳定性及储存期进行了探索。主要研究内容及结果如下:（1）以纳豆激酶和纳豆感官评价为指标,通过单因素实验及响应面实验研究豆类种类、蒸煮时间、基质含水量、接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间对纳豆发酵的影响。结果表明,鹰嘴豆发酵纳豆中纳豆激酶含量最高,达986.3 IU/g,比同水平下黄豆发酵纳豆中的纳豆激酶活性高。鹰嘴豆发酵纳豆最佳工艺条件为:接种量6%,发酵温度为34℃,发酵时间为47h,所建立模型预测纳豆激酶活性为978.2 IU/g,实验所得纳豆激酶活性为986.3 IU/g,与理论预测值接近。所建立模型能够预测鹰嘴豆发酵纳豆过程。（2）纳豆激酶的分离纯化工艺优化。采用离心、盐析、葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱层析对纳豆激酶进行提取纯化,分别对盐析及柱层析进行了工艺优化。盐析法提取纳豆激酶的最优工艺为:v硫酸铵:v粗酶液=2:1,盐析搅拌转速为600 r/min,盐析温度40℃,提取时间16 h时,此工艺下所提取纳豆激酶酶活性为350.2 IU/mL。葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱层析纯化纳豆激酶最优工艺为:纳豆激酶上样量1 mL,上样浓度为0.1 g/mL,洗脱剂用量150 mL,洗脱时间500 min,所纯化纳豆激酶酶活达到89032.6 IU/mL,纯度高达90%。（3）利用加速储存实验对鲜纳豆及纳豆激酶冻干粉的储存稳定性进行了研究。通过加速储存实验估算出鲜纳豆分别在25℃、4℃储存时,酶活损失10%的时间分别为16.6 d和1.28年;酶活损失50%的时间分别为0.26年和7.62年。纳豆激酶冻干粉分别在25℃、4℃储存时,酶活损失10%的时间分别为14.6 d和0.47年;酶活损失50%的时间分别为0.26年和3.11年。通过本课题的研究,筛选了一种适合纳豆发酵的豆类——鹰嘴豆,明确了鹰嘴豆发酵纳豆最优工艺,并对纳豆激酶的提取纯化进行了工艺优化,同时利用加速储存实验明确了鲜纳豆及纳豆激酶冻干粉的储存稳定性及储存期。课题的完成为纳豆及纳豆激酶的规模化生产提供了相关理论基础。
尹梦雯[9]（2018）在《产纤溶酶乳酸菌的筛选及酶学性质研究》文中进行了进一步梳理血栓栓塞类疾病的发病率近年来不断上升。利用纤溶酶溶解是血栓栓塞类疾病治疗的重要方法,而微生物是非常重要的纤溶酶来源,且具有种类多、易于培养、繁殖快,人们的提取工艺也较为成熟的优点。乳酸菌广泛存在于发酵食品中,并且大多数乳酸菌是肠道内的有益微生物。因此,从传统发酵食品中筛选产纤溶酶的乳酸菌,并对其产生的纤溶酶进行研究,对开发预防血栓栓塞类疾病的保健食品具有重要的意义。本研究从传统发酵食品中分离筛选产溶纤酶的乳酸菌,对其进行形态特征、生理生化特征、16S rDNA基因序列综合鉴定,以确定菌株的种属;对目的菌株进行安全性的初步评估,选取安全的菌株进行后续研究。进行菌株的基本生物学特性的研究;对菌株所产的纤溶酶进行分离纯化,并对酶学性质进行研究;采用响应面的方法对该菌株进行产酶条件优化。主要研究结果如下:（1）从传统发酵食品中经初筛、纤维蛋白平板复筛,筛选出2株溶解纤维蛋白的菌株,分别命名为HYD09和HYN06。测定两株菌的发酵上清液酶活,其分别是115.3 U/mL和107.2 U/mL。根据菌株菌体特征、菌落特征、生理生化特征和16S rDNA序列比对结果,判定两株菌均为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。（2）进行安全性评估实验结果表明:菌株HYD09和HYN06溶血试验、吲哚试验、硝酸盐还原酶试验、氨基脱羧酶试验的结果均呈阴性;12种抗生素作用后,并未表现出多重耐药性;菌株HYD09无毒力基因检出,而菌株HYN06检出esp毒力基因。综合以上结果,初步推测菌株HYD09安全。因此,后续试验以菌株HYD09作为实验对象。生物学特性实验结果表明,菌株HYD09具有一定的耐酸性,且对胆盐的耐受力较好。其发酵上清液经过胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,仍具有纤溶活性且酶活无明显变化。（3）将菌株HYD09的发酵上清液进行不同硫酸铵饱和度的分级沉淀试验,选取60%为最佳硫酸铵饱和度对菌株HYD09发酵上清液进行盐析。盐析后,透析除盐,经过DEAE-Sephadex A-25交换层析等手段处理得到两个蛋白峰,将两个峰的收集液经过浓缩,采用纤维蛋白平板检测得出峰Ⅱ具有纤溶活性,峰Ⅱ经过活性电泳和SDS-PAGE电泳均显示为一个条带,分子量为31.018 kDa。整个纯化过程纤溶酶的比活力从203.2U/mg提高至1889.8 U/mg,纯化倍数为9.3,回收率为19.3%。（4）对纤溶酶HYD09酶学性质进行研究,结果表明:最适反应温度为35℃,最适pH值为7.5;抑制剂PMSF、IAM、β-巯基乙醇对该酶的抑制作用相对较弱,抑制率分别为2.3%、3.7%、5.8%;而EDTA则可以完全抑制该酶的活性,表明该酶可能为金属蛋白酶。金属离子对酶活的影响试验表明,Ca2+对纤溶酶HYD09的酶活力有明显的促进作用,酶活提高了12.2%,Fe2+和Ba2+对该酶的酶活力有轻微的促进作用,酶活分别提高了3%和1.8%,Zn2+对此酶有明显的抑制作用,酶活降低了86.8%。（5）主要采用单因素实验法确定对菌株HYD09产酶活力影响较大的因素,选用响应面法对菌株HYD09的发酵条件进行优化,最后确定出产酶量最大的发酵条件为:乳糖9 g/L,酵母提取物15 g/L,接种量为2.96%,初始pH值为7.0,此条件下,产酶量可达394.74 U/mL,酶活提高了3.4倍。本研究筛选出两株产纤溶酶的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）HYD09和HYN06,对菌株进行了安全性评估,初步判定菌株HYD09为安全。进一步研究菌株HYD09的生物学特性,并对其发酵条件进行优化。对纤溶酶HYD09进行分离纯化,并进行酶学性质的初步研究。从而为进一步开发和利用该酶提供科学的理论依据。
高泽鑫[10]（2018）在《高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学稳定性的研究》文中进行了进一步梳理纳豆激酶是一种具有潜力的溶栓药物。它能够有效减缓血栓的形成,且溶栓作用明显高于同等剂量的尿激酶,同时它也能够通过蛋白水解作用直接溶解纤维蛋白凝块。本论文从贵州本土特色食品中分离筛选出的高产纳豆激酶的菌株,通过对其进行综合性能评价,包括安全性能、益生性能和发酵性能的评价。在此基础上采用主成分析,找到综合性能最好的一株高产纳豆激酶菌株。通过丙酮沉淀法和反胶束萃取法相结合对粗酶液进行纯化得到电泳纯的纳豆激酶,最后采用多种化学修饰相结合的方法对纳豆激酶进行酶学改造,并研究其酶学稳定性。首先本实验采用酪蛋白平板法和琼脂糖—纤维蛋白原平板法从贵州本土特色食品的样品中分离出能水解酪蛋白的菌株,并得到78株菌产纳豆激酶的菌株。通过对15株高产纳豆激酶菌株的菌落形态和菌体形态观察,初步判断15株高产纳豆激酶菌株均为芽孢杆菌属（Bacillus）。最后通过紫外分光光度法对筛选得到的15株高产菌株进行纳豆激酶酶活力精确测定。测得菌株GUJN05产酶能力最高,其固态发酵36 h后的纳豆激酶活力达到141.97±0.64 FU/g。然后将15株高产纳豆激酶菌株经16S rRNA分子生物学初步鉴定,菌株GULR06、GUMN16、GUTU06、GUYZ13为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;菌株GUB01、GULC07、GUXN01、GUJN05、GUXN04、GUJZ01、GUWB03、GUBN02、GUYR02和GUWB06为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）;SN-14菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。各纳豆产品的生物胺含量在49.0973.71 mg/kg,其中GUMN16菌株产生物胺含量最高。通过主成分分析选择贝莱斯芽孢杆菌SN-14作为纳豆激酶的生产菌株,结合形态学、分子生物学和生理生化鉴定结果,最终鉴定SN-14为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。接着采用丙酮沉淀法从发酵液中初步分离提纯纳豆激酶。当发酵液和丙酮的体积比为1:5时,在0℃下沉淀6 h的效果最佳,在该条件下纳豆激酶酶活力回收率为69.7±1.3%,纯化倍数为1.89±0.05。采用反胶束法萃取丙酮沉淀后的纳豆激酶溶液,前萃取的最优条件为:当CTAB浓度为225 mM,三种助溶剂体积为70%异辛烷/20%正丁醇/10%正己醇;水相中NaCl离子浓度为0.05 M,水相pH为8.5;在25℃条件下萃取25 min,离心后得到含纳豆激酶的有机相,在该条件下前萃取效率达到了75.3±1.8%。反萃取的最优条件为:有机相来自前萃取离心后所得;水相中KCl的盐离子浓度为1.5 M,水相为pH 6;在30℃条件下萃取75 min,离心后得到含纳豆激酶的水相,在该条件下反萃效率为84.7±1.9%。丙酮沉淀后的纳豆激酶溶液经过反胶束萃取分离提纯后,总的反胶束萃取效率为63.8±1.9%,纯化倍数为2.61±0.09。发酵液中的纳豆激酶经过丙酮沉淀和反胶束萃取,整个过程的纯化倍数达到4.93。采用本研究方法分离纯化后的酶溶液经过SDS-PAGE表征发现该方法可以将目标酶提纯至电泳纯,经过NanoLC-ESI-MS/MS测定该酶的氨基酸序列,通过系统发育树分析得出纯化后的SN-14菌株所产的酶属于纳豆激酶家族,并将该酶命名为SG14。最后通过测定除去金属离子SG14 NK前后的纳豆激酶含量,得到去离子后的NK酶活力比去离子前的NK酶活力提高了9.17%。K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+和Fe2+对未修饰的SG14 NK酶活力有一定程度的促进作用,其中Fe2+对纳豆激酶酶活力的促进作用最强,酶活提高倍数达到11.3%,其它的金属离子都表现出一定程度的抑制。当Fe2+浓度在10 mM时,SG14 NK酶活力达到最大,相对于原来只用5 mM去促进纳豆激酶活力又提高了16.7%,而相对于没进行化学修饰前的SG14 NK提高了3.1倍。Fe2+和mPEG化学修饰后的SG14 NK与胃蛋白酶溶液等体积混合反应时酶活力达到最高,相对只进行过Fe2+和mPEG修饰后的SG14NK,酶活力提高了1.66倍。在37℃的最佳反应温度下,依次完成Fe2+、mPEG和胃蛋白酶修饰后的SG14 NK的酶活力最高,其NK的酶活力是未经过化学修饰的SG14 NK的7.3倍。SG14 NK的最适pH为8.5,依次完成Fe2+、mPEG和胃蛋白酶修饰后的SG14 NK在pH为3和12时,NK酶活力分别损失9%和15.9%。只有Ca2+和Fe2+能对依次完成Fe2+、mPEG修饰的SG14 NK和依次完成Fe2+、mPEG和胃蛋白酶修饰的SG14 NK酶活力起到促进作用。在冻藏时间达到30天时,未化学修饰的SG14 NK的酶活力损失60.6%、Fe2+修饰后的SG14NK的酶活力损失56.6%、Fe2+和mPEG修饰后的SG14 NK的酶活力损失39.1%、Fe2+、mPEG和胃蛋白酶修饰后的SG14 NK的酶活力损失33.2%。而通过多种化学修饰后的SG14 NK的半衰期时间远高于未修饰的SG14 NK。
二、纳豆激酶分离纯化及性质研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、纳豆激酶分离纯化及性质研究（论文提纲范文）
（1）产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 简写对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 枯草芽孢杆菌简介 |
| 1.2 纳豆激酶的研究进展 |
| 1.2.1 纳豆激酶的酶学性质 |
| 1.2.2 纳豆激酶的功能及其应用前景 |
| 1.2.3 纳豆激酶与其它溶栓药物的比较及其溶栓优势 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌凝乳酶的研究进展 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌在发酵食品及益生菌制剂中的应用 |
| 1.5 枯草芽孢杆菌对肠道菌群的调节作用和在医药保健领域的应用 |
| 1.5.1 肠道菌群及肠道菌群失调相关疾病 |
| 1.5.2 炎症性肠病的发病机制及治疗方法的研究进展 |
| 1.6 立题背景和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌菌株的分离、筛选及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 主要试剂与材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基配方 |
| 2.3.2 纤维蛋白溶解酶纤溶活力测定方法 |
| 2.3.3 凝乳酶活力测定方法 |
| 2.3.4 产纳豆激酶和凝乳酶双酶菌株的筛选及鉴定 |
| 2.3.5 产双酶菌株菌株的鉴定 |
| 2.3.6 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长特征检测 |
| 2.3.7 B.subtilis JNFE0126 株菌发酵液凝乳酶和纤溶酶活性的动态检测 |
| 2.3.8 B.subtilis JNFE0126 菌株产双酶能力的遗传稳定性测定 |
| 2.3.9 B.subtilis JNFE0126 菌株保藏 |
| 2.3.10 酶抑制剂抑制试验分析纤溶酶和凝乳酶的类型 |
| 2.3.11 B.subtilis JNFE0126 菌株的两种酶基因的PCR扩增和测序 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产双酶(纳豆激酶和凝乳酶)菌株的筛选 |
| 2.4.2 B.subtilis nk1 菌株的鉴定 |
| 2.4.3 B.subtilis JNFE0126 菌株的生长和产酶特性 |
| 2.4.4 蛋白酶抑制剂实验分析纤溶酶和凝乳酶类型 |
| 2.4.5 B.subtilisJNFE0126 的纳豆激酶和M4 金属蛋白酶基因PCR扩增和测序结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 枯草芽孢杆菌产发酵液中纳豆激酶和凝乳酶的分离纯化及酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基 |
| 3.3.2 B.subtilis JNFE0126 菌株的活化 |
| 3.3.3 纳豆激酶、凝乳酶粗酶液的制备 |
| 3.3.4 蛋白质浓度的测定—Bradford检测法 |
| 3.3.5 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.3.6 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.3.7 纳豆激酶的酶学性质研究 |
| 3.3.8 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.4.2 凝乳酶的分离纯化 |
| 3.4.3 纯化酶的SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 3.4.4 纳豆激酶的酶学性质 |
| 3.4.5 凝乳酶的酶学性质研究 |
| 3.4.6 纯化凝乳酶的凝乳效果及其潜在应用价值 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 枯草芽孢杆菌发酵乳的研制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 主要试剂与材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 发酵乳制备方法 |
| 4.3.2 单因素实验和正交试验 |
| 4.3.3 发酵乳理化指标测定 |
| 4.3.4 发酵乳感官评定 |
| 4.3.5 发酵乳储藏过程中的品质变化观察 |
| 4.3.6 发酵乳的微观结构观察 |
| 4.3.7 发酵乳动物体内抗血栓作用 |
| 4.3.8 试验数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 单因素试验优化发酵乳配方和发酵条件 |
| 4.4.2 采用正交试验确定发酵乳最适发酵条件 |
| 4.4.3 正交试验确定稳定剂配方 |
| 4.4.4 发酵过程中菌量、p H和酶活的变化 |
| 4.4.5 发酵乳总蛋白和总糖含量 |
| 4.4.6 发酵乳感官评定结果 |
| 4.4.7 发酵乳的流变学特性 |
| 4.4.8 发酵乳的持水力和质构测定结果 |
| 4.4.9 发酵乳的微观凝胶结构 |
| 4.4.10 发酵乳储藏过程中的品质变化: |
| 4.4.11 小鼠黑尾模型验证发酵乳体内抗血栓效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 枯草芽孢杆菌发酵乳预防和治疗炎症性肠病 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 主要试剂与材料 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的制备及其CFU计数和革兰氏染色 |
| 5.3.2 DSS诱导性炎症性肠病动物模型的建立和动物分组 |
| 5.3.3 模型小鼠疾病活动指数(DAI)的测定 |
| 5.3.4 小肠和结肠的组织学切片观察和组织学评分 |
| 5.3.5 免疫组织化学染色 |
| 5.3.6 Western blotting检测蛋白表达水平 |
| 5.3.7 肠道菌群分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 枯草芽孢杆菌发酵乳的外观、CFU计数及其Gram’s染色 |
| 5.4.2 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对DSS诱导性炎症性肠病动物DAI的影响 |
| 5.4.3 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对小肠和结肠病理变化的影响 |
| 5.4.4 枯草芽孢杆菌发酵乳对白细胞浸润和炎症因子、抗炎因子表达的影响 |
| 5.4.5 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对Lgr-5,CDX-2,Mucin-2 表达水平的影响 |
| 5.4.6 口服枯草芽孢杆菌发酵乳对ZO1和Villin表达水平的影响 |
| 5.4.7 口服发酵乳对DSS诱导的IBD模型小鼠肠道菌群的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 纳豆激酶缓释颗粒的研制 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料和设备 |
| 6.2.1 主要试剂与材料 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 缓释颗粒原材料的各种反应体系内纳豆激酶纤溶活性测定 |
| 6.3.2 双层壳-核结构的纳豆激酶缓释颗粒的设计和构建 |
| 6.3.3 纳豆激酶缓释颗粒的粒径和zeta电位测定 |
| 6.3.4 装载纳豆激酶和模型药物的缓释颗粒微观结构的显微镜观察 |
| 6.3.5 纳豆激酶缓释颗粒在储藏过程中的纤溶活性的动态测定 |
| 6.3.6 模拟消化液对缓释颗粒纤溶活性的影响 |
| 6.3.7 模拟消化液对缓释颗粒粒径、ζ-电位和表面结构的影响 |
| 6.3.8 荧光标记模拟药物(Ig G)缓释颗粒口服后在小鼠消化道内分布情况分析 |
| 6.3.9 口服纳豆激酶缓释颗粒后小鼠肠道内的活性酶的释放和吸收试验 |
| 6.3.10 口服纳豆激酶缓释颗粒对模型小鼠血栓治疗效果的评价 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 纳豆激酶缓释颗粒的设计与构建 |
| 6.4.2 颗粒双层壳-核结构的鉴定与验证 |
| 6.4.3 纳豆激酶缓释颗粒保藏过程中酶活的变化 |
| 6.4.4 缓释颗粒中纳豆激酶的体外释放特性 |
| 6.4.5 双层壳-核结构缓释颗粒所装载模型药物口服后在体内的释放 |
| 6.4.6 口服纳豆激酶缓释颗粒对黑尾模型小鼠的血栓治疗效果 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（2）高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌的诱变选育及组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 纳豆激酶简介 |
| 1.1.1 纳豆激酶的结构与理化性质 |
| 1.1.2 纳豆激酶的生理功能 |
| 1.1.3 纳豆激酶的应用 |
| 1.2 发酵生产纳豆激酶研究现状 |
| 1.2.1 枯草芽孢杆菌简介 |
| 1.2.2 发酵生产纳豆激酶研究现状 |
| 1.2.3 枯草芽孢杆菌产纳豆激酶机制与代谢调控研究 |
| 1.3 基因组与转录组学分析 |
| 1.3.1 基因组学与转录组学简介 |
| 1.3.2 基因组与转录组学在芽孢杆菌中的应用 |
| 1.4 立题意义及主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 培养基的配制 |
| 2.4 仪器设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 菌种培养方法 |
| 2.5.2 JNFE0126 生长曲线测定 |
| 2.5.3 紫外线诱变 |
| 2.5.4 ~(60)Co-γ射线诱变 |
| 2.5.5 遗传稳定性实验 |
| 2.5.6 原始菌株与诱变菌株发酵比较 |
| 2.5.7 发酵培养基优化 |
| 2.5.8 纳豆激酶分离纯化 |
| 2.5.9 纳豆激酶酶学性质测定 |
| 2.6 检测方法 |
| 2.6.1 纳豆激酶活力测定方法 |
| 2.6.2 蛋白质浓度的测定 |
| 2.6.3 挥发性盐基氮的测定 |
| 2.6.4 SDS-PAGE电泳鉴定蛋白 |
| 2.7 基因组测序 |
| 2.7.1 基因测序和组装 |
| 2.7.2 基因预测和功能注释 |
| 2.7.3 比较基因组分析 |
| 2.8 转录组测序 |
| 2.8.1 RNA提取与纯化 |
| 2.8.2 lllumina测序 |
| 2.8.3 测序分析 |
| 2.8.4 实时荧光定量PCR验证 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 枯草芽孢杆菌JNFE0126 诱变 |
| 3.1.1 JNFE0126 生长曲线分析 |
| 3.1.2 JNFE0126 的紫外线诱变 |
| 3.1.3 菌株的~(60)Co-γ射线诱变 |
| 3.1.4 诱变菌株遗传稳定性实验 |
| 3.1.5 原始菌株与诱变菌株发酵性能分析 |
| 3.2 诱变菌株JNFE1126 发酵条件优化及酶学性质检测 |
| 3.2.1 碳源对纳豆激酶酶活的影响 |
| 3.2.2 氮源对纳豆激酶酶活的影响 |
| 3.2.3 表面活性剂对纳豆激酶酶活的影响 |
| 3.2.4 纳豆激酶性质测定 |
| 3.3 原始菌株与诱变菌株基因组学分析 |
| 3.3.1 基因组结构预测 |
| 3.3.2 功能注释分析 |
| 3.3.3 同源基因分析 |
| 3.3.4 SNP分析 |
| 3.4 原始菌株和诱变菌株转录组学分析 |
| 3.4.1 RNA提取与纯化 |
| 3.4.2 测序数据质控分析 |
| 3.4.3 转录组质量评估分析 |
| 3.4.4 基因差异表达分析 |
| 3.4.5 重要差异表达基因筛选分析 |
| 3.4.6 实时荧光定量PCR验证 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）纳豆芽孢杆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 纳豆的制备工艺流程 |
| 1.3.2 纳豆激酶提取液的制备 |
| 1.3.3 蛋白质含量和纳豆激酶活性分析 |
| 1.3.4 纳豆发酵条件的优化 |
| 1.3.5 纳豆激酶的纯化 |
| 1.3.6 纳豆激酶酶学性质 |
| 1.3.7 纳豆激酶体外溶栓效果的研究 |
| 1.3.8 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菜用大豆产纳豆激酶发酵条件优化的单因素试验 |
| 2.1.1 发酵时间对酶活性的影响 |
| 2.1.2 发酵温度对酶活性的影响结果 |
| 2.1.3 接种量对酶活性的影响结果 |
| 2.1.4 后熟时间对酶活性的影响结果 |
| 2.2 纳豆发酵条件优化正交试验 |
| 2.3 纳豆激酶的分离纯化 |
| 2.3.1 硫酸铵盐析结果 |
| 2.3.2 DEAE阴离子交换柱纯化纳豆激酶 |
| 2.3.3 SDS-PAGE电泳检测结果 |
| 2.3.4 纳豆激酶分离纯化效果评价 |
| 2.4 纳豆激酶的酶学性质研究 |
| 2.4.1 纳豆激酶的最适温度及热稳定性 |
| 2.4.2 纳豆激酶的最适p H值及p H值稳定性结果 |
| 2.4.3 纳豆激酶体外溶栓效果 |
| 3 结论 |
（4）纳豆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 菜用大豆概述 |
| 1.1.1 制约菜用大豆发展的因素 |
| 1.1.2 菜用大豆未来发展前景 |
| 1.2 纳豆概述 |
| 1.2.1 纳豆的生产 |
| 1.2.2 纳豆的营养价值及保健功效 |
| 1.3 纳豆激酶概述 |
| 1.3.1 溶栓类药物 |
| 1.3.2 纳豆激酶的溶栓机制 |
| 1.3.3 纳豆激酶的理化特性 |
| 1.3.4 纤溶酶纤溶活性常用的测定方法 |
| 1.3.5 纳豆激酶的分离纯化研究 |
| 1.3.6 纳豆激酶的应用及未来发展趋势 |
| 1.4 课题研究背景及目的与意义 |
| 1.4.1 课题研究背景 |
| 1.4.2 目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验菌种 |
| 2.1.2 实验材料与试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纳豆发酵工艺流程 |
| 2.2.2 纳豆激酶提取液的制备 |
| 2.2.3 纳豆激酶活力的测定 |
| 2.2.4 蛋白质含量测定 |
| 2.3 发酵纳豆最佳条件的确定 |
| 2.3.1 发酵纳豆最佳条件的单因素实验 |
| 2.3.2 发酵纳豆最佳条件的正交实验 |
| 2.4 纳豆激酶的分离纯化 |
| 2.4.1 硫酸铵分段盐析 |
| 2.4.2 DEAE阴离子交换柱纯化纳豆激酶 |
| 2.4.3 SDS—PAGE电泳检测 |
| 2.5 纳豆激酶部分性质的研究 |
| 2.5.1 纳豆激酶最适温度和温度稳定性的测定 |
| 2.5.2 纳豆激酶最适pH值和pH稳定性的测定 |
| 2.5.3 纳豆激酶体外溶栓效果的研究 |
| 2.6 数据分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 纳豆成品状态 |
| 3.2 纳豆激酶活力测定的标准曲线 |
| 3.3 发酵纳豆最佳条件的单因素实验结果 |
| 3.3.1 发酵时间对酶活性的影响结果 |
| 3.3.2 发酵温度对酶活性的影响结果 |
| 3.3.3 接种量对酶活性的影响结果 |
| 3.3.4 后熟时间对酶活性的影响结果 |
| 3.4 纳豆发酵条件优化的正交实验结果 |
| 3.5 纳豆激酶分离纯化结果 |
| 3.5.1 硫酸铵分段盐析 |
| 3.5.2 DEAE阴离子交换柱纯化纳豆激酶 |
| 3.5.3 SDS—PAGE电泳检测结果 |
| 3.5.4 纳豆激酶分离纯化效果评价 |
| 3.6 纳豆激酶部分性质的研究 |
| 3.6.1 纳豆激酶的最适温度和温度稳定性 |
| 3.6.2 纳豆激酶的最适pH值和pH稳定性 |
| 3.6.3 纳豆激酶体外溶栓效果的研究 |
| 3.7 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
（5）多菌种复合发酵低氨味纳豆工艺的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳豆 |
| 1.2.1 纳豆的起源与发展 |
| 1.2.2 纳豆的营养成分 |
| 1.2.3 纳豆的保健功能 |
| 1.3 纳豆芽孢杆菌 |
| 1.4 纳豆激酶 |
| 1.4.1 纳豆激酶理化性质 |
| 1.4.2 纳豆激酶生物特性 |
| 1.4.3 纳豆激酶活力的测定方法 |
| 1.5 纳豆发酵工艺研究进展 |
| 1.6 纳豆创新型产品 |
| 1.7 纳豆中挥发性成分的研究进展 |
| 1.8 酵母菌 |
| 1.9 混合菌种发酵的纳豆研究进展 |
| 1.10 本课题的目的与意义 |
| 2 纳豆芽孢杆菌的分离纯化及筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 原料 |
| 2.1.2 试剂和培养基 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 纳豆芽孢杆菌分离纯化 |
| 2.2.2 生理生化实验筛选 |
| 2.2.3 产酶能力筛选 |
| 2.2.4 生长曲线测定 |
| 2.2.5 纳豆芽孢杆菌发酵实验 |
| 2.2.6 纳豆激酶酶活测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 纳豆芽孢杆菌初筛 |
| 2.3.2 生化实验结果 |
| 2.3.3 产酶能力筛选结果 |
| 2.3.4 生长曲线 |
| 2.3.5 酪氨酸标准曲线 |
| 2.3.6 筛选菌种发酵纳豆酶活 |
| 2.4 本章实验小结 |
| 3 双菌发酵纳豆工艺条件优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 原料 |
| 3.1.2 试剂和培养基 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 纳豆制备 |
| 3.2.2 双菌发酵纳豆的单因素实验 |
| 3.2.3 双菌发酵纳豆的正交优化试验 |
| 3.2.4 纳豆激酶酶活测定 |
| 3.2.5 挥发性盐基氮含量的测定 |
| 3.2.6 试验结果统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌种比例对发酵纳豆品质的影响 |
| 3.3.2 接种量对发酵纳豆品质的影响 |
| 3.3.3 发酵时间对发酵纳豆品质的影响 |
| 3.3.4 发酵温度对发酵纳豆品质的影响 |
| 3.3.5 正交试验优化双菌株发酵纳豆结果与分析 |
| 3.4 本章实验小结 |
| 4 纳豆芽孢杆菌和酵母菌复合发酵纳豆工艺条件优化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 原料 |
| 4.1.2 试剂和培养基 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 纳豆制备 |
| 4.2.2 纳豆芽孢杆菌和酵母菌复合发酵纳豆的单因素实验 |
| 4.2.3 纳豆芽孢杆菌和酵母菌复合发酵纳豆的正交优化试验 |
| 4.2.4 纳豆激酶酶活测定 |
| 4.2.5 挥发性盐基氮含量的测定 |
| 4.2.6 感官评价 |
| 4.2.7 试验结果统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 菌种比例对纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆品质的影响 |
| 4.3.2 接种量对纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆品质的影响 |
| 4.3.3 发酵时间对纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆品质的影响 |
| 4.3.4 发酵温度对纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆品质的影响 |
| 4.3.5 正交试验优化纳豆菌-酵母菌复合发酵纳豆结果与分析 |
| 4.4 本章实验小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）文冠果油粕固态发酵制备纳豆激酶及其抗金黄色葡萄球菌活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 文冠果 |
| 1.1.1 文冠果概述 |
| 1.1.2 文冠果研究开发进展 |
| 1.1.3 文冠果油粕生产和利用现状 |
| 1.2 纳豆激酶 |
| 1.2.1 纳豆激酶的概念 |
| 1.2.2 纳豆激酶的结构 |
| 1.2.3 纳豆激酶的溶栓机理 |
| 1.2.4 纳豆激酶的制备 |
| 1.2.4.1 纳豆激酶的生产 |
| 1.2.4.2 固态发酵技术 |
| 1.2.4.3 固态发酵技术的影响因素 |
| 1.2.4.4 纳豆激酶的分离纯化 |
| 1.2.4.5 纳豆激酶的活性测定 |
| 1.3 金黄色葡萄球菌及其生物被膜研究概述 |
| 1.3.1 金黄色葡萄球菌概述及其耐药性 |
| 1.3.2 金黄色葡萄球菌的危害 |
| 1.3.2.1 金葡菌与食品安全 |
| 1.3.2.2 金葡菌引发的临床感染 |
| 1.3.3 金黄色葡萄球菌生物被膜 |
| 1.3.3.1 金葡菌感染和抑制机理 |
| 1.3.3.2 金葡菌生物被膜的组成 |
| 1.3.3.3 金葡菌生物被膜的生成机制 |
| 1.3.4 金葡菌抑制剂的研究进展 |
| 1.3.4.1 概述 |
| 1.3.4.2 纳豆激酶对金葡菌的抑制作用 |
| 1.4 课题研究的目的和意义、内容 |
| 1.4.1 研究目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 文冠果油粕固态发酵制备纳豆激酶的条件优化 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 试验菌种 |
| 2.1.2 发酵原料与试剂 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 文冠果油粕和甘蔗渣的组分测定 |
| 2.2.2 培养基的制备 |
| 2.2.3 纳豆激酶活性的测定 |
| 2.2.3.1 标准曲线制定 |
| 2.2.3.2 样品测定 |
| 2.2.4 单因素实验 |
| 2.2.4.1 文冠果油粕和甘蔗渣的质量比 |
| 2.2.4.2 初始料水比 |
| 2.2.4.3 速效氮源种类及其添加量 |
| 2.2.4.4 速效碳源种类及其添加量 |
| 2.2.4.5 无机盐种类及其添加量 |
| 2.2.4.6 纳豆芽孢杆菌接种量 |
| 2.2.4.7 发酵时间 |
| 2.2.5 Plackett-Burman法筛选主要影响因子 |
| 2.2.6 Central Composite实验与响应面优化 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 文冠果油粕和甘蔗渣的组分分析 |
| 2.3.2 尿激酶标准曲线 |
| 2.3.3 固态发酵工艺条件对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.1 文冠果油粕与甘蔗渣的质量比对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.2 初始料水比对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.3 速效氮源种类及其添加量对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.4 速效碳源种类及其添加量对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.5 无机盐种类及其添加量对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.6 纳豆芽孢杆菌接种量对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.3.7 发酵时间对纳豆激酶活力的影响 |
| 2.3.4 Plackett-Burman法对主要影响因子的筛选结果 |
| 2.3.5 响应面法对发酵条件的优化结果 |
| 2.3.6 响应面的图形分析结果 |
| 2.4 本章小结与讨论 |
| 3 文冠果油粕固态发酵产物经三相分离法制备纳豆激酶 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 微量蛋白含量的测定 |
| 3.2.2 纳豆激酶活性的测定 |
| 3.2.3 分离条件对制备纳豆激酶的影响 |
| 3.2.3.1 发酵产物浸提液的pH |
| 3.2.3.2 加入硫酸铵的饱和度 |
| 3.2.3.3 温度 |
| 3.2.3.4 发酵产物浸提液与叔丁醇体积比 |
| 3.2.4 硫酸铵分步沉淀 |
| 3.2.5 数据处理 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 微量蛋白测定标准曲线 |
| 3.3.2 分离条件对制备纳豆激酶的影响 |
| 3.3.2.1 发酵产物浸提液的pH对纳豆激酶分离的影响 |
| 3.3.2.2 加入硫酸铵的饱和度对纳豆激酶分离的影响 |
| 3.3.2.3 温度对纳豆激酶分离的影响 |
| 3.3.2.4 发酵产物浸提液与叔丁醇体积比对纳豆激酶分离的影响 |
| 3.3.3 纯化结果比较分析 |
| 3.4 本章小结与讨论 |
| 4 纳豆激酶抗金黄色葡萄球菌活性的研究 |
| 4.1 材料与设备 |
| 4.1.1 试验菌种 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 主要溶液及配置 |
| 4.2.2 不同浓度的纳豆激酶对金葡菌的处理 |
| 4.2.3 金葡菌静态生物膜的制备 |
| 4.2.4 纳豆激酶联合抗生素对金葡菌的处理 |
| 4.2.5 结晶紫染色 |
| 4.2.6 数据处理 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 纳豆激酶对甲氧基林敏感型金葡菌的抑制性 |
| 4.3.2 纳豆激酶对耐甲氧基林型金葡菌的抑制性 |
| 4.3.3 纳豆激酶对不同生长时期金葡菌的抑制性 |
| 4.3.4 纳豆激酶联合抗生素对金葡菌的抑制性 |
| 4.4 本章小结与讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（7）纳豆激酶的制备与分离纯化研究进展（论文提纲范文）
| 1 高产纳豆激酶菌种的育种 |
| 1.1 高产纳豆激酶菌种的直接分离 |
| 1.2 高产纳豆激酶菌种的诱变选种 |
| 1.3 高产纳豆激酶菌种的基因工程育种 |
| 2 纳豆激酶的制备方式 |
| 2.1 纳豆激酶的液体发酵制备 |
| 2.2 纳豆激酶的固体发酵制备 |
| 3 纳豆激酶的分离纯化及检测方法 |
| 3.1 纳豆激酶的分离纯化 |
| 3.2 纳豆激酶的检测方法 |
| 4 纳豆激酶产品开发中的问题与解决策略 |
（8）鹰嘴豆纳豆发酵工艺优化及纳豆激酶的分离纯化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 纳豆概述 |
| 1.1.1 纳豆的起源 |
| 1.1.2 纳豆的营养成分 |
| 1.1.3 纳豆的保健功能 |
| 1.1.4 纳豆的生产及现状 |
| 1.2 豆类营养成分 |
| 1.2.1 大豆 |
| 1.2.2 黑豆 |
| 1.2.3 鹰嘴豆 |
| 1.2.4 绿豆 |
| 1.3 纳豆激酶 |
| 1.3.1 纳豆激酶的基本性质 |
| 1.3.2 纳豆激酶的稳定性 |
| 1.3.3 纳豆激酶的溶栓机理 |
| 1.3.4 纳豆激酶活力的检测方法 |
| 1.4 纳豆激酶的提取纯化方法 |
| 1.5 本课题研究的目的、意义及内容 |
| 1.5.1 研究目的及意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 2 纳豆固体发酵工艺优化 |
| 2.1 实验材料及仪器 |
| 2.1.1 主要材料与试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验菌种与培养基配方 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 纳豆发酵 |
| 2.3.2 纳豆芽孢杆菌生长曲线的绘制 |
| 2.3.3 纳豆激酶活性的测定 |
| 2.3.4 纳豆感官评定 |
| 2.3.5纳豆发酵单因素工艺实验 |
| 2.3.6 响应面优化 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 纳豆杆菌生长曲线 |
| 2.4.2 尿激酶标准曲线 |
| 2.4.3 纳豆发酵单因素工艺实验结果分析 |
| 2.4.4 响应面优化实验结果分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 纳豆激酶提取纯化工艺优化 |
| 3.1 实验材料及仪器 |
| 3.1.1 主要材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 纳豆激酶活性测定方法 |
| 3.2.2 纳豆激酶粗提液的制备 |
| 3.2.3 盐析法提取分离纳豆激酶 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 绘制酪氨酸标准曲线 |
| 3.3.2 盐析法提取纳豆激酶工艺研究 |
| 3.3.3 Sephadex G-75纯化纳豆激酶工艺研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 酪氨酸标准曲线绘制 |
| 3.4.2 硫酸铵盐析提取的单因素结果 |
| 3.4.3 盐析提取纳豆激酶正交实验结果 |
| 3.4.4 Sephadex G-75纯化纳豆激酶的结果分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 纳豆激酶稳定性的研究 |
| 4.1 实验材料及仪器 |
| 4.1.1 主要材料与试剂 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 鲜纳豆的制备 |
| 4.2.2 纳豆激酶冻干粉的制备 |
| 4.2.3 温度、pH对纳豆激酶稳定性的影响 |
| 4.2.4 新鲜纳豆及纳豆冻干粉的加速储存实验及储存期的计算 |
| 4.2.5 纳豆激酶失活速率常数的测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 储存温度及pH对纳豆激酶稳定性的影响结果分析 |
| 4.3.2 新鲜纳豆及纳豆冻干粉的加速储存实验结果 |
| 4.3.3 纳豆激酶冻干粉及鲜纳豆储存期的估算结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）产纤溶酶乳酸菌的筛选及酶学性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英汉及缩略词对照 |
| 1 前言 |
| 1.1 食品中微生物源纤溶酶的简介 |
| 1.2 纤溶酶的活性测定方法 |
| 1.2.1 纤维蛋白平板法 |
| 1.2.2 纤维蛋白块溶解时间法 |
| 1.2.3 发色底物法 |
| 1.2.4 酶联免疫吸附法 |
| 1.2.5 血清平板法 |
| 1.3 食品中微生物源纤溶酶菌种筛选研究进展 |
| 1.4 食品中微生物源纤溶酶酶学性质研究进展 |
| 1.4.1 纳豆激酶(NK)酶学性质 |
| 1.4.2 豆豉纤溶酶酶学性质 |
| 1.4.3 其他食源性纤溶酶酶学性质 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 培养基与主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产纤溶酶乳酸菌的筛选及鉴定 |
| 2.2.2 产纤溶酶乳酸菌的安全性评估 |
| 2.2.3 菌株生物学性质研究 |
| 2.2.4 纤溶酶的纯化 |
| 2.2.5 纤溶酶酶学性质的研究 |
| 2.2.6 菌株产酶条件优化 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 产纤溶酶乳酸菌的分离 |
| 3.1.1 产纤溶酶乳酸菌的筛选 |
| 3.1.2 纤溶活性的测定 |
| 3.1.3 产纤溶酶乳酸菌的鉴定 |
| 3.2 产纤溶酶乳酸菌的安全性评估 |
| 3.2.1 溶血试验 |
| 3.2.2 耐药性试验 |
| 3.2.3 有毒代谢产物检测试验 |
| 3.2.4 毒力基因PCR检测 |
| 3.3 菌株HYD09生物学特性的研究 |
| 3.3.1 菌株HYD09生长曲线的测定 |
| 3.3.2 菌株HYD09酸耐受试验 |
| 3.3.3 菌株HYD09胆盐耐受试验 |
| 3.3.4 胃肠道主要蛋白酶处理对酶活的影响 |
| 3.4 菌株HYD09纤溶酶的分离纯化 |
| 3.4.1 菌株HYD09纤溶酶的盐析 |
| 3.4.2 DEAE-SephadexA-25离子交换层析 |
| 3.4.3 纤溶酶HYD09纯化效果评价 |
| 3.5 纤溶酶HYD09酶学性质 |
| 3.5.1 纤溶酶HYD09最适反应温度的测定 |
| 3.5.2 纤溶酶HYD09最适pH的测定 |
| 3.5.3 纤溶酶HYD09不同抑制剂对纤溶活性的抑制作用 |
| 3.5.4 纤溶酶HYD09不同金属离子对酶活性影响测定 |
| 3.6 菌株产酶条件优化 |
| 3.6.1 不同培养基对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.2 不同碳源对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.3 不同氮源对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.4 不同接种量对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.5 不同装液量对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.6 不同初始pH值对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.7 不同培养温度对菌株HYD09产酶的影响 |
| 3.6.8 响应面优化结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 产纤溶酶乳酸菌的筛选 |
| 4.2 菌株HYD09安全性评估及生物学特性的研究 |
| 4.3 纤溶酶HYD09酶学性质研究 |
| 4.4 菌株HYD09发酵条件优化 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 一、个人基本情况 |
| 二、教育及工作经历 |
| 三、获奖情况 |
| 四、攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学稳定性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪言 |
| 1.1 纳豆 |
| 1.1.1 纳豆的概述 |
| 1.1.2 纳豆的生产 |
| 1.1.3 纳豆的安全性 |
| 1.2 血栓性疾病 |
| 1.2.1 血栓疾病的概述 |
| 1.2.2 血栓疾病的形成机理 |
| 1.2.3 抗血栓药物 |
| 1.3 纳豆激酶 |
| 1.3.1 纳豆激酶的发现 |
| 1.3.2 纳豆激酶的溶栓功效 |
| 1.3.3 纳豆激酶的酶学特性 |
| 1.3.4 纳豆激酶的活性测定 |
| 1.4 纳豆激酶的发酵工艺 |
| 1.5 纳豆激酶的分离纯化 |
| 1.5.1 分离纯化技术的种类 |
| 1.5.2 分离纯化技术的比较 |
| 1.5.3 纳豆激酶分离纯化的现状 |
| 1.6 纳豆激酶的稳定性与改性 |
| 1.7 纳豆激酶类产品 |
| 1.7.1 纳豆激酶药品 |
| 1.7.2 纳豆激酶保健品 |
| 1.7.3 功能性食品 |
| 1.8 研究背景与意义 |
| 1.9 主要研究内容 |
| 第二章 高产纳豆激酶菌株的分离初筛 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产纳豆激酶菌株的分离与筛选 |
| 2.2.2 原料预处理与固态发酵粗酶液的制备 |
| 2.2.3 琼脂糖—纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶 |
| 2.2.4 菌落形态及菌体形态观察 |
| 2.2.5 紫外分光光度法测定纳豆激酶 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 菌株分离与筛选的结果 |
| 2.3.2 纤维蛋白原平板法测定纳豆激酶结果 |
| 2.3.3 菌落形态及菌体形态观察的结果 |
| 2.3.4 紫外分光光度法测定纳豆激酶结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 高产纳豆激酶菌株的鉴定及复筛 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 菌株分子鉴定 |
| 3.2.2 固态发酵感官评价 |
| 3.2.3 纳豆产品中生物胺测定 |
| 3.2.4 不同纳豆产品主成分分析 |
| 3.2.5 菌株生理生化鉴定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 分子生物学鉴定结果 |
| 3.3.2 固态发酵感官评价结果 |
| 3.3.3 固态发酵产品中生物胺测定结果 |
| 3.3.4 主成分分析的结果 |
| 3.3.5 生理生化鉴定结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 纳豆激酶的纯化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 菌种来源 |
| 4.1.4 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 纳豆激酶粗酶液的制备 |
| 4.2.2 丙酮沉淀初步提纯纳豆激酶 |
| 4.2.3 反胶束萃取分离纯化纳豆激酶 |
| 4.2.4 蛋白质含量及纳豆激酶酶活力的测定 |
| 4.2.5 反胶束中增溶水量W_0测定 |
| 4.2.6 测量指标及公式 |
| 4.2.7 纳豆激酶的浓缩及脱盐 |
| 4.2.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 4.2.9 NanoLC-ESI-MS/MS测序 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 蛋白质含量标准曲线 |
| 4.3.2 丙酮沉淀纳豆激酶的条件优化 |
| 4.3.3 反胶束前萃取纳豆激酶的条件优化 |
| 4.3.4 反胶束反萃取纳豆激酶的条件优化 |
| 4.3.5 SDS-PAGE结果 |
| 4.3.6 NanoLC-ESI-MS/MS测序结果及亲缘关系比对 |
| 4.4 本章小节 |
| 第五章 SG14纳豆激酶的酶学稳定性 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 实验材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SG14纳豆激酶的酶学性质研究 |
| 5.2.2 去除SG14纳豆激酶中的金属离子 |
| 5.2.3 金属离子对SG14 NK的化学修饰 |
| 5.2.4 聚乙二醇对SG14 NK的化学修饰 |
| 5.2.5 胃蛋白酶对SG14 NK的化学修饰 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 去除金属离子对SG14 NK的影响 |
| 5.3.2 不同金属离子对SG14 NK的影响 |
| 5.3.3 不同Fe~(2+)浓度对SG14 NK的影响 |
| 5.3.4 不同浓度胃蛋白酶对SG14 NK的影响 |
| 5.3.5 化学修饰后的热稳定性比较 |
| 5.3.6 化学修饰后的酸碱稳定性比较 |
| 5.3.7 化学修饰后的金属离子对稳定性比较 |
| 5.3.8 化学修饰后的半衰期性稳定性比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 图版 |
四、纳豆激酶分离纯化及性质研究（论文参考文献）
- [1]产纳豆激酶和凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选及其在发酵乳中的应用[D]. 张轩. 江南大学, 2021(01)
- [2]高产纳豆激酶枯草芽孢杆菌的诱变选育及组学分析[D]. 王玉雪. 江南大学, 2021(01)
- [3]纳豆芽孢杆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析[J]. 李秀凉,李倩文,朱玉,韩晓云,孙庆申,宋永. 中国酿造, 2020(12)
- [4]纳豆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析[D]. 朱玉. 黑龙江大学, 2020(05)
- [5]多菌种复合发酵低氨味纳豆工艺的研究[D]. 郑丹妮. 武汉轻工大学, 2020(06)
- [6]文冠果油粕固态发酵制备纳豆激酶及其抗金黄色葡萄球菌活性的研究[D]. 赵晨煊. 北京林业大学, 2019(01)
- [7]纳豆激酶的制备与分离纯化研究进展[J]. 王镭. 黑龙江科学, 2019(08)
- [8]鹰嘴豆纳豆发酵工艺优化及纳豆激酶的分离纯化研究[D]. 刘晓宇. 陕西科技大学, 2019(09)
- [9]产纤溶酶乳酸菌的筛选及酶学性质研究[D]. 尹梦雯. 四川农业大学, 2018(01)
- [10]高产纳豆激酶菌株的筛选及其酶学稳定性的研究[D]. 高泽鑫. 贵州大学, 2018(05)