一、辐射敏感综合症——AT病研究进展(论文文献综述)
林天烨[1](2020)在《磁共振动脉自旋标记及其拓展技术在颈动脉狭窄中的应用研究》文中提出第一部分 构建基于54例健康人供血区选择性动脉自旋标记的按照Willis环分类的正常脑血管灰质灌注范围模板目的脑供血动脉的灌注范围是脑血管病影像学研究常需要用到的感兴趣区。现有的脑供血动脉的灌注范围多是手绘的解剖图谱,目前开源可用的脑供血范围模板很少。本研究旨在以供血区选择性动脉自旋标记成像(territory ASL,tASL)的方法,制作基于国人正常人群的灰质脑动脉灌注范围模板。方法研究纳入54例无脑血管病变的健康志愿者,扫描三维时间飞跃法磁共振血管造影(3DTOFMRA),tASL,3DASL和三维等体素T1加权像。根据3DTOFMRA的Willis环类型将志愿者分为Willis环无变异型、单侧A1段缺如型、单侧胚胎型大脑后动脉型和双侧胚胎型大脑后动脉型。因为tASL标记每支血管时标记效率不同,首先需要将tASL三支血管供血区的平均CBF调整到统一的水平。然后将经过标准化的tASL三支血管灌注范围组合到一起成为全脑CBF图,再以此图为中介将CBF值校准后的左、右颈内动脉(internal carotid artery,ICA)和椎基底动脉(vertebrobasilarartery,VBA)的供血范围配准到MNI标准空间。根据tASL图像制作不同Willis环类型的脑主要供血动脉皮层灰质脑灌注范围图谱:①单侧Al段缺如型被试的A1段缺如同侧的ICA灌注范围可以认为是大脑中动脉的供血区;②单侧A1段缺如型被试缺如对侧较大的ICA灌注范围减去刚刚计算出的大脑中动脉供血区就是双侧ACA供血区。③采用Willis环无变异的VBA取平均后可得到后循环的灌注模板。然后将各血管供血范围蒙片到标准灰质图上,得到灰质内的灌注范围。灌注范围边界的确定:因为各血管灌注区的平均CBF已经矫正到了同一水平,我们定义任意体素的血供归属为在该体素上CBF值最高的血管。深部灰质核团的灌注边界根据上述生成的灰质灌注范围由手绘补充完成。结果制作并发布tASL脑血管灰质灌注范围模板。结论基于tASL的正常脑血管灰质灌注范围模板为脑血管病影像研究的感兴趣区划分提供了新的选择。第二部分 颈动脉内膜切除术前基于动脉自旋标记信号的侧枝循环评分与术后颈动脉供血范围及认知水平变化关系的研究目的颈动脉狭窄患者各脑供血动脉的灌注范围在颈动脉内膜切除术(carotid endarterectomy,CEA)后会在一定程度上恢复正常,但恢复程度因人而异。脑侧枝循环建立不充分可能增加CEA术中脑缺血的风险。目前已明确颈动脉狭窄和认知功能损害密切相关,而CEA和认知的关系尚无统一结论。动脉自旋标记(arterial spin labeling,ASL)是一种以磁化标记的动脉血为内源性对比剂的磁共振灌注成像方法。本研究基于ASL的信号强度和特点对CEA前患者各脑区内的侧枝循环进行评分,利用供血区选择性动脉自旋标记(territory ASL,tASL)评估CEA后脑主要供血动脉灌注范围的变化,研究侧枝循环评分和灌注范围恢复之间的关系以及术后认知水平和灌注范围变化程度的关系。方法研究纳入22例接受CEA的颈动脉重度狭窄患者,和54例正常对照。所有患者在术前一个月和术后一周内接受3D ASL和tASL的头部MRI扫描。两读片人基于术前3D ASL上的动脉通过伪影(arterial transit artefact,ATA)和低灌注情况评价侧枝循环水平。按Willis环形态对正常对照组被试的tASL图像进行分类,制作正常脑供血范围参照模板。患者术后的tASL血流灌注范围如果和相同Willis环类型的健康对照组供血范围模板一致则被认为灌注范围恢复正常,并以此分为灌注范围恢复正常组和灌注范围未恢复正常组,研究两组间侧枝循环评分的差异。患者术前和术后一周内进行神经心理学测试(MMSE、MoCA等6项),研究认知水平和灌注范围恢复情况的关系。20名年龄、性别相匹配的健康受试者(对照)间隔两周进行认知量表的测评。认为患者术后认知分数增高大于对照组均数+2×标准差为认知水平显着提高。结果两读片人对ASL侧枝循环评分的一致性较好(kappa值=0.762)。术后灌注范围恢复正常组的患者基于ASL的侧枝循环评分明显高于灌注范围未恢复正常组(P<0.0001)。对于术后灌注范围恢复正常的患者,术后1周MMSE和MoCA的分值都有提高(患者分数提高与对照组均数+2×标准差比较,1.36>1.35,1.18>1.02),而灌注范围未恢复正常的患者术后MMSE和MoCA未见显着提高(0.8<1.35,0<1.02),其他单领域神经心理学测试改变不显着。结论CEA后tASL显示的脑供血动脉灌注范围恢复程度与CEA前基于ASL显示的脑侧枝循环水平相关,并且灌注范围恢复好的患者术后认知的改善更明显。第三部分 动脉自旋标记灌注特征和脑Willis环形态对颈动脉血运重建术后脑过度灌注的预测价值目的脑过度灌注是颈动脉血运重建术后需高度警惕的并发症,其虽然罕见,但可导致脑出血等严重后果。预防是脑过度灌注最重要的应对措施,术前或术后早期预警高危患者是重要的预防手段。本研究旨在探索术前临床一般情况、手术前后Willis环形态、术前ASL灌注特征(脑血流量空间变异系数、灌注容积比等)与脑过度灌注间的关系。方法连续入组48例接受颈动脉内膜切除术或颈动脉支架置入术的颈动脉狭窄患者。所有患者在术前2周内和术后3天内均采集单标记后延迟动脉自旋标记(single-PLD 3D ASL,3D ASL)灌注成像,供血区ASL(territory ASL,tASL)和磁共振血管成像(3DTOFMRA)。用 3DASL计算脑血流量(cerebralbloodflow,CBF)的空间变异系数(CBF-CoV)、正常脑灌注容积比(PV/BV),用tASL分别计算颈内动脉和后循环的灌注体积占比。根据MRA上Willis环中大脑前动脉A1段和前交通动脉是否可见将患者分为不同的Willis环类型:完整型和缺失型。使用Mann-Whitney U检验和Fisher精确检验比较出现过度灌注的患者和未出现过度灌注的患者ASL的灌注特征、Willis环类型和临床特征的差异,以寻找上述影像及临床特征中脑过度灌注的预测指标。讨论未纳入统计的两位过度灌注患者的临床及影像发现。结果术后,和脑灌注正常组相比,脑过度灌注组具有较高的脑血流量空间变异系数CBF-CoV(P=0.005),较低的正常脑灌注容积比RatioPV(P=0.012),Willis环中大脑前动脉A1段或前交通动脉缺失的比例更高(术后MRA:P=0.002,术前MRA:P=0.004),更高比例的大血管卒中史(P=0.028)。两例出现过度灌注综合症的患者因病情过重无法术后早期磁共振复查未纳入统计,他们的ASL灌注和血管影像特征符合上述统计学结果,一例患者术前ASL-CBF图像上存在明显低灌注区域,另一例患者术前MRA显示右侧大脑前动脉A1段缺如。结论单延迟时间ASL的特定灌注特征和TOF MRA显示的Willis环形态对于颈动脉血运重建后脑过度灌注的风险有一定的预测价值。第四部分 长标记准连续动脉自旋标记技术的信度和可重复性研究目的准连续动脉自旋标记(pseudo-continuous arterial spin labeling,pCASL)中一个重要的参数是标记后延迟时间(post-label delay,PLD)。当动脉通过时间(arterial transit time,ATT)小于PLD时ASL会低估脑血流量,可在老年人和脑血管病患者中采用较长的PLD。但是,延长PLD也会减低图像的信噪比,这可以通过延长标记时间,即增加被标记的水分子数量来解决,并且延长标记时间也间接延长了 PLD。本研究的目的是比较标准的标记时间(LD=1500ms)和长标记(LD=3500ms)的pCASL在全脑、脑叶和脑供血区内的信度和可重复性。方法研究纳入20例被试(13例存在颈动脉或颅内动脉不同程度的狭窄,7例健康人,年龄56.6±17.2岁),在一台3.0T磁共振上采集标记时间(labeling duration,LD)为1500ms和3500ms的pCASL,两序列除标记时间外其他参数相同,间隔一小时后重复采集。通过计算LD=1500ms和LD=3500ms的pCASL在全脑灰质、脑叶、脑血管供血区灰质内CBF的类内相关系数(intraclass correlation coefficient,ICC)、被试内变异系数(within-subject coefficient of variation,wsCV)、随机噪声和信号的变异系数,绘制相关散点图和Bland-Altman图比较不同标记时间的pCASL两侧测量的信度和可重复性。结果两种pCASL的一致性和可重复性都较好(ICC,0.88~0.98,wsCV,0.03~0.10)。所有脑区LD=3500ms pCASL两次测量的ICC均高于LD=1500ms的pCASL,wsCV、随机噪声和信号的变异系数更低。在所有的感兴趣区,LD=3500mspCASL两次采集的Pearson相关系数r都高于LD=1500ms pCASL两次采集的相关系数。在所有的感兴趣区,Bland-Altman图显示LD=3500ms pCASL的一致性界限相对于LD=1500ms pCASL更小,在一致性界限外的点更少,平均差异(mean difference%)和可重复性系数的百分数(reproducibility coefficient%,RPC%)更低,提示长标记pCASL两次测量的差异更小。两种pCASL测量CBF的可重复性在前循环都要好于后循环供血区。结论长标记pCASL测量CBF值的信度和可重复性在全脑及前循环供血区高于常规标记时间的pCASL,在后循环供血区两者差异不大。两种pCASL在大脑前循环供血区CBF定量的信度和可重复性均高于后循环供血区。第五部分流入饱和技术在多标记后延迟动脉自旋标记中的应用价值目的动脉自旋标记(arterial spin labeling,ASL)的灌注图像上有时会看到血管内的高信号,称为动脉通过伪影(arterial transit artifact,ATA),出现这种伪影提示标记后延迟时间(post-label delay,PLD)小于实际的动脉通过时间(arterial transit time,ATT),ATA对受试者的血流动力学情况有重要的提示作用。多标记后延迟动脉自旋标记(multi-PLD ASL)可以根据多个PLD的灌注信号计算出ATT和ATT矫正的CBF。多PLDASL可以通过顺序标记或更节省时间的Hadamard编码实现,并常采用single-shot FSE采集。然而,ASL灌注图像上的动脉内高信号并不都能用ATA解释。本研究的目的是证明1.single-shot的多PLD ASL各期PLD的灌注加权图像中可出现类似ATA的伪影,影响ATT和总CBF的计算;2.流入饱和技术能将该伪影抑制。方法三位健康受试者(年龄40.3±17.1岁)在3.0T磁共振扫描仪上使用32通道的头线圈进行了扫描。采集了 3个PLD的sequential-ASL(SASL)和延迟时间完全相同的Hadamard 编码的 3 个 PLD(1000ms,2000ms,3000ms)的 Hadamard-encoded ASL(HASL)。SASL和HASL都分别采集了使用流入饱和及不使用流入饱和的图像。本研究中ATT采用信号加权延迟法计算。研究者肉眼观察SASL和HASL各期PLD的灌注图像和ATT图像,比较使用流入饱和前后动脉内异常信号出现的频率。结果在各期PLD的灌注图像上可以同时看到血管内高信号和血管内低信号,在不含流入饱和的HASL中,血管内异常信号出现在12/15(80%)的图像中;在不含流入饱和的SASL中,血管内异常信号出现在14/15(93.3%)的图像中。使用流入饱和后,大部分伪影被削弱。一名年龄为60岁的受试者在PLD=1000ms的灌注图像上始终存在不被流入饱和技术抑制的血管内高信号,考虑为ATA。结论流入饱和技术可以减少或消除Hadamard编码和顺序采集多PLD ASL中的因为流入效应引起的动脉内异常信号,该信号容易与ATA混淆,故流入饱和技术有助于多PLDASL数据的临床解读。
王晶[2](2020)在《脐血造血干细胞输注修复放射后小鼠造血系统损伤的实验研究》文中提出研究背景核放射物质与核辐射技术在人们社会生活中的应用越来广泛,但意外曝露于核辐射中或接触放射性物质,对人们的造成的危害也是巨大的。在医学治疗手段中放化疗可使患者的造血系统发生严重损害。造血干细胞对辐射尤为敏感,放射剂量为(0.7-10Gy)累及造血系统[1]造成骨髓型急性放射病(Acute radiation sickness,ARS),主要表现为贫血、出血、感染,甚至死亡。轻中度骨髓型ARS可门诊随访、使用细胞因子、输血输液等治疗可缓解达到治愈。重度及极重度骨髓型ARS致死率极高,造血干细胞移植是治疗重度及极重度骨髓型ARS的重要选择。但选择供者及处理移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)等对重度及极重度骨髓型ARS患者的治疗是不利的。及时降低或修复放射对人体造血系统的损伤,提高患者生存率,在治疗过程中尤为重要。造血微环境主要由骨髓中邻近造血干细胞的支持细胞(成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞及间充质干细胞等)构成[2-3],参与造血干细胞的自我更新、增殖和分化。研究表明:放射不仅对造血干细胞(HSCs,Hematopoietic stem cells)产生损伤,对HSCs赖以生存的造血微环境也造成一定影响[4]。目的脐血造血干细胞主要应用于恶性及非恶性血液系统疾病。脐血造血干细胞可以促进放射后造血干祖细胞的增殖分化,修复放射后骨髓造血微环境,本研究的目的探究人脐血造血干细胞在放射后造血系统损伤的小鼠模型中治疗效果。方法选取清洁的C57BL/6雄性小鼠54只,通过直线加速器照射,建立辐射损伤模型。随机分为放射未治疗组(A组)、放射脐血治疗组(B组)及放射脐血治疗加强组(C组),B组在放射后12 h后通过尾静脉注射方式输注脐血造血干细胞(输注剂量5.52-6.07×106/kg),C组小鼠分别在TBI后12h、24h进行脐血造血干细胞输注(每次输注剂量5.52-6,07×106/kg)。观察TBI后各组小鼠的存活率及观察有无脱毛、弓背、腹泻等放射损伤症状,通过病理学检查评估脐血造血干细胞治疗放射对脾脏、小肠、皮肤及骨髓损伤后的效果。同时对各组小鼠放射后在第1、3、7、11、14、17、21、28d检测外周血细胞计数分析,体外培养各组小鼠骨髓单个核细胞并计数,采用流式细胞术检测骨髓单个核中CD34+细胞的比例,并用CFU-GM克隆实验检测造血祖细胞短期的增殖能力。同时同时进行体外培养骨髓间充质干细胞,分别用油红o和茜素红s染色,并用实时定量PCR测定OCN、ALP、RUNX2、PPAR、CEBP-α以检测骨髓间充质干细胞向成骨细胞及脂肪分化的能力。使用流式细胞术分析骨髓中CD68、IL-10标记的巨噬细胞表型变化,用ELISA法检骨髓中白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)的浓度变化,同时使用ELISA法分析骨髓微环境中粒-单细胞集落刺激因子(G-CSF)、干细胞因子(SCF)的表达。结果1、实验发现在放射后输注脐血造血干细胞显着升高小鼠的放射诱导的生存率:A的小鼠28d的存活率为0%,B组小鼠的存活率78%,而C组的存活率为90%,对比三组小鼠的存活率,具有统计学意义(P<0.05)。在TBI后A组小鼠的体重持续下降,第17d死亡时平均体重(11.21±0.24g)。B、C两组在TBI后第11d达到最低值分别为(14.75±0.27)g、(14.93±0.26)g,两者对比无统计学意义(P>0.05)。TBI后第3d,三组小鼠均出现脱毛,暴躁易攻击、弓背等症状。A组小鼠症状持续加重,因腹泻等原因死亡。B、C两组小鼠在第21d基本恢复正常,但仍有脱毛等症状。2、组织病理图片可示:第A组小鼠皮肤病理切片可见基底层细胞大量变性坏死,小肠黏膜结构坏死,结构完全消失,可见大量炎性细胞浸润,脾脏病理切片仅可见皮质,未见髓质及其他结构。B组小鼠皮肤可见基底层轻度增生,小肠部分可见肠绒毛纤维素样坏死,脾脏部分髓质分布不均匀。C组小鼠皮肤仅见少量细胞坏死,可见肠绒毛结构相对完整。,脾脏可见髓质分布均匀。取小鼠胸骨进行病理切片,A组小鼠骨髓腔内造血细胞明显减少,纤维化结构增多。B组小鼠骨髓腔内造血部分减少,可见恢复趋势。而C组小鼠可见幼稚红细胞及粒细胞再生。三者可见显着性对比。3、TBI后A、B、C三组小鼠外周血检测:白细胞计数在7d降至最低,三者进行对比具有统计学意义P<0.05。第28d检测B组为(9.12±1.22)×1012/L,C组为(10.14±1.31)×1012/L,两组对比差异有统计学意义(P<0.05)。血红蛋白计数在第14d降至最低,A、B、C组分别为(54.00±1.42)g/L、(70.67±4.50)g/L、(98.66±2.08)g/L,三组两两对比(P<0.01、P<0.01、P<0.05)。B、C两组小鼠血红蛋白计数在21d,两组对比P<0.05,具有统计学意义。对比A、B、C三组小鼠血小板计数,差异有统计学意义(P<0.05),在第14天达到最低点,A、B、C组小鼠血小板计数最低值分别为(56.00±4.25)×1012/L、(141.33±22.36)×1012/L、(207.33±12.10)×1012/L。三组对比差异有统计学意义(P<0.05)。随后B、C两组在第28d基本恢复正常对比P>0.05。4、骨髓造血干/祖细胞的检测:检测骨髓单个核细胞计数,A、B、C三组进行两两对比差异均有统计学意义(P<0.01),而对比7d、14d,三组小鼠骨髓单个核细胞的数量均有增长,但A组小鼠增长缓慢,两个时间点的计数不具有统计学意义(P>0.05);B、C两组增长较快具有统计学意义(P<0.05,P<0.05)。在TBI后第7d,FCM检测CD34+细胞在骨髓单个核中所占的比例。A、B、C三组小鼠CD34+细胞在BM-MSNs中所占比例分别为0.57%、1.56%、1.90%,三者进行对比有显着差异,具有统计学意义(P<0.05)。在7d、14d,三组CFU-GM分别进行对比,差异具有显着差异(P<0.05,P<0.05)。5、TBI后第7、14d,A组小鼠BM-MSCs中的OCN、ALP、RUNX2基因表达水平分别为:(1.22±0.06)、(1.66±0.08)、(1.39±0.04)均低于B、C组两组小鼠BM-MSCs,差异有显着性意义(P<0.05),C组小鼠BM-MSCs中OCN、ALP、RUNX2基因表达水平分别为(1.61±0.05)、(3.12±0.16)、(2.71±0.09)与B组小鼠BM-MSCs中OCN基因表达水平(1.44±0.07)、ALP(2.72±0.10)、RUNX2(2.61±0.33)相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。茜素红染色后倒置显微镜下观察,A组小鼠BM-MSCs可见散在的橘红色矿化结节,而B、C组小鼠BM-MSC中橘黄色矿化结节呈片状分布,第14d,A组小鼠BM-MSC成骨矿化较差,只在部分细胞聚集处有红染现象。B、C两组可见较多均匀的红染矿化结节,未见明显差异。A组小鼠PPAR、CEBP-α基因的表达均高于B、C组中的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。7d、14d两个时间点对比,三组均具有统计学意义。油红O染色结果显示:7d,A组散布着橙红色的脂滴颗粒,B、C组可见散布较为均匀的脂滴颗粒,但C组较B组脂肪油滴数量减少。在14d,A组中红色脂肪油滴成簇状,几乎占满整个视野。B、C两组中的脂肪油滴差异较小,但对比第7d明显减少。6、分离提取BM中巨噬细胞,通过FCM检测第7、14d巨噬细胞中CD68、IL-10的表达。在相同的时间点,A、B、C三组的小鼠骨髓CD68的表达量进行对比差异具有统计学意义(P<0.05)。在相同的时间点,A、B、C三组的小鼠骨髓IL-10的表达量进行对比差异具有统计学意义(P<0.05),三组小鼠IL-10的表达两两组分别进行相比较有统计学差异(P<0.01)。对比第7d、14d,三组均有所上升,对比三组的升高率差异具有统计学意义(P<0.05)。用ELISA法进行检测骨髓中IL-4的浓度,在相同时间点,A、B、C三组进行对比P<0.05具有统计学意义。ELISA检测骨髓中IFN-γ的浓度值,对比三组小鼠IFN-γ的变化值P<0.05。7、ELISA法检测骨髓细胞中G-CSF及SCF浓度变化值。相同时间点对比小鼠骨髓中G-CSF浓度,差异具有统计学意义(P<0.05)。三组小鼠骨髓中SCF的浓度值的变化P<0.05,具有统计学意义。结论一、通过输注脐血造血干细胞可以改善TBI后小鼠腹泻、脱毛等辐射损伤症状,提高辐射后小鼠的生存率。二、病理组织切片可示:脐血造血干细胞可以改善TBI后小鼠皮肤、小肠及脾脏等组织的损伤程度。三、通过实验提示脐血造血干细胞的输注使TBI后小鼠骨髓单个核细胞计数明显增多,骨髓单个核细胞中CD34+细胞的比例升高,CFU-GM结果说明脐血造血干细胞促进造血干祖细胞的增殖分化,从而加快造血系统的恢复。四、TBI后输注脐血造血干细胞可以提高BM-MSCs向成骨转化能力,降低其诱导成脂能力,加快造血干细胞归巢,促进造血系统的恢复。五、脐血造血干细胞减少TBI后骨髓巨噬细胞促炎性因子IFN-γ的释放,增加抗炎因子IL-4的释放,增强骨髓巨噬细胞对造血系统的双向调节作用,降低炎性因子对血细胞生成的影响。同时上调TBI后G-CSF及SFC的浓度,促进早期造血恢复,从而缓解TBI对骨髓造血微环境的破坏。
孙卫芳[3](2019)在《养殖对虾五种常见病原的MNPCR检测法的构建优化》文中提出随着凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖业的规模化发展,其病害的威胁也日益增大,对其病害的防控目前主要以预防为主,防治结合。因此,在养殖生产过程中及时监测虾体携带病原的状况,并科学地运用生态防控技术,这对保障养殖生产效益,促进产业的健康发展具有重要意义。对此,本研究旨在针对养殖对虾虾红细胞虹彩病毒(SHIV)、肝肠胞虫(EHP)、副溶血性弧菌(VPAHPND)、白斑综合症病毒(WSSV)以及传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等主要的五种常见病原,优化建立一种可同时检测多种病原的多重巢氏PCR(Multiplenested PCR,MNPCR)检测方法,为后续进一步优化和集成养殖对虾病害生态防控技术提供技术支持。本研究首先采用单种病原的PCR检测技术对2017-2018年广东省茂名市和汕尾市的对虾养殖主产区的凡纳滨对虾样品开展SHIV、EHP和VPAHPND等三种病原的感染情况调查分析,结果发现养殖对虾中SHIV、EHP和VPAHPND均有检出,其中SHIV和EHP的阳性率较高,分别为23.81%、23.13%,VPAHPND检出率相对较低,为3.40%。此外,在采集的池塘水和水源水样品中亦均检出SHIV、EHP和VPAHPND,其中,SHIV阳性率为 30.43%和 44.00%,EHP 为 47.83%和 36.00%,VPAHPND 为 4.35%和 4.00%。而在所放养的虾苗中偶尔可检出一定量的VPAHPND;在幼虾饵料生物——丰年虫卵中检测发现其亦具有一定的EHP和VPAHPND阳性。针对以上结果,本研究选择SHIV、EHP和VPAHPND等三种病原,以及WSSV和IHHNV等两种传统常见的对虾病原作为检测目标。分别设计和优化针对SHIV、EHP、VPAHPND、WSSV、IHHNV的特异性巢式PCR引物,以所构建五种病原的阳性质粒为参照,建立并优化可同时检测五种病原的多重巢式PCR技术。结果显示,该多重巢式PCR方法对SHIV、EHP、VPAHPND、WSSV以及IHHNV的扩增产物片段大小分别为129 bp、176 bp、402 bp、230 bp和294 bp。其中,第一轮扩增的最佳退火温度为61℃,最佳引物浓度为0.32 μmol/L,EX Taq和dNTP最佳浓度分别为1.5 U/25 μL、1.5 mmol/L;第二轮扩增的最佳退火温度为60℃,最佳引物浓度为0.48 μmol/L,EX Taq和dNTP最佳浓度分别为1.5 U/25 μL、1.5 mmol/L。经检验,该多重巢式PCR检测技术对IHHNV的最低检测量为1 ×102copy/μL,VPAHPND、WSSV、EHP、SHIV 为 1×101copy/μL。其后,于广东省沿海养殖主产区选择未爆发病害的池塘采集凡纳滨对虾样品,采用该检测技术对其病原进行检测。结果显示,在所检测对虾样品中SHIV、EHP和WSSV的阳性率分别为8.02%、54.01%和15.51%。对汕尾养殖基地发病池塘对虾病原检测结果显示SHIV的阳性率为100%,EHP和WSSV分别为77.78%、44.44%。可见,该检测技术可有效运用于对虾养殖生产过程中的多病原高效监测。
贾琳[4](2018)在《缺血性卒中病因学的3D高分辨磁共振管壁成像的研究》文中指出目的:脑卒中致死率目前在我国排名第一,而且具有高患病率、高致残性、高复发性的特点,严重危害国民健康及经济社会的发展。如何有效的预防卒中的发生以及促进卒中患者预后良好转归,是目前卒中研究亟待解决的问题,这其中,病因学研究具有重要的地位。卒中病因学研究具有重要的临床意义,是患者进行治疗的基础,影响预后,本研究以高分辨磁共振管壁成像作为关键研究方法,从头颈大动脉到脑穿支小动脉进行可视化研究及其临床应用研究,旨在识别与缺血性卒中病因学密切相关的影像学指标,为临床病因学诊断提供新方法。方法:本研究基于前期项目组开发的三维头颈联合磁共振管壁成像技术,前瞻性纳入了55例确诊为缺血性卒中的患者,对其进行了头颈部血管管壁成像,根据头颈血管节段管壁显示的清晰程度,进行了半定量的评价;同时由两名经验丰富的神经影像学专家共同对患者图像进行阅片,识别征象,对大动脉源性的缺血性卒中病因(大动脉粥样硬化,动脉夹层,血管炎及烟雾病)进行了诊断;对大动脉粥样硬化病变,识别了个体的斑块数量,头颈血管多发病变的占比,并根据强化特点进行易损性分层;本研究在对大动脉病变所致缺血性卒中研究的基础上,进一步对小动脉病变所致缺血性卒中进行了研究;研究组在两个中心纳入了确诊为单侧基底节区豆纹动脉供血区梗死的患者35例,根据梗死大小特点,分为纹状体内囊梗死和单穿支梗死(腔隙性梗死)两种类型,所有患者均进行了三维全脑高分辨管壁成像采集,通过最小密度投影技术及多平面重建技术,对所有患者基底节区豆纹动脉进行了显示,对患者豆纹动脉的数量及到达深度进行了记录,以正常侧为对照,比较了纹状体内囊梗死和单穿支梗死患者中豆纹动脉数量的变化以及到达深度;同时,根据患者梗死模式的不同,判断了患者豆纹动脉内、外侧组受累情况,比较不同受累情况下豆纹动脉数量的变化以及到达深度的变化。结果:项目组开发的三维头颈联合磁共振管壁成像技术在约8分钟的时间,能够实现覆盖头颅及颈部血管管壁的成像需求,空间分辨率为0.55mm3;在图像质量上,颅内、颅外,前循环、后循环各支血管均可以清晰成像,而且增强前与增强后图像清晰程度无统计学差异,说明在无对比剂的条件下,成像同样清晰;病因学诊断能力上,分别确诊了大动脉粥样硬化43人,动脉夹层3人,烟雾病2人,血管炎2人,余5人为其他原因。在43名大动脉粥样硬化患者中,共发现了150个斑块,其中36人(84%)存在多发斑块;122个(81%)斑块和28(19%)个斑块分别位于颅内动脉与颅外动脉,43名患者中均发现和识别了责任斑块,其中颅内动脉斑块63个和颈动脉斑块22个,在这63个颅内动脉斑块中,100%出现了强化,在这22个颈动脉斑块中,79%出现了强化。在对小动脉的研究中,发现纹状体内囊梗死与单穿支梗死(腔隙性梗死),豆纹动脉数量变化及到达深度均存在有显着统计学差异;在纹状体内囊梗死中,豆纹动脉不仅表现了减少、对称,还出现了数量增多的现象,而在单穿支病变中,主要表现为豆纹动脉数量对称,未出现数量增多的现象;而在内侧组豆纹动脉受累,外侧组豆纹动脉受累及内、外侧组豆纹动脉同时受累的比较中,豆纹动脉数量变化以及到达深度,组间均无显着性统计学差异。结论:本研究在基于三维高分辨全脑管壁成像技术创新的基础上,深化了其临床应用,针对缺血性卒中病因学诊断的难点,分别从大动脉到小动脉进行了全面的研究和分析,其具有以下几个创新性:1)使用头颈联合三维高分辨管壁成像技术进行缺血性卒中患者头颈动脉病变一站式成像及一体化评估;2)本研究对纹状体内囊梗死及单穿支梗死的病变中的豆纹动脉直接进行了可视化及对比研究;3)本研究针对纹状体内囊梗死及单穿支病变梗死两种主要的梗死类型,不仅关注了豆纹动脉的绝对数量,而且提出并发现了梗死后豆纹动脉的变化模式。
张秋叶[5](2018)在《CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平变化及其临床意义》文中研究指明背景:急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是成人常见的急性白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)亚型之一,主要分为B-ALL和T-ALL两种。其中B-ALL最为常见,其发病率约占ALL的85%。其传统的治疗手法可使78%至93%的成人B-ALL患者达到完全缓解,长期无病生存占40%,然而50%以上的成人患者会复发,而且复发之后预后极差,总生存率仅为5%-8%。对于复发难治性B-ALL患者主要采用造血干细胞移植、靶向药物治疗使患者达到再次缓解,但部分患者终会复发或耐药,而这部分患者几乎无药可救。近年来,细胞免疫治疗取得重要进展,CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)在治疗B细胞白血病和淋巴瘤方面取得较好的治疗效果,其中最具有代表性的是CD19 CAR-T治疗复发难治性B-ALL患者。因为CD19抗原在B-ALL上表达率达95%以上,且只特异性表达于正常和恶性B细胞表面,不表达于其他细胞,故CD19抗原是CAR-T治疗CD19阳性的复发难治性B-ALL的关键点并且在治疗复发/难治性B-ALL能取得很好的疗效,完全缓解率(CR)高达70-80%。在CD19 CAR-T细胞治疗过程中,除感染、输液反应、肿瘤溶解综合征等白血病治疗中常见的不良事件外,与其相关的特有的不良反应是细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome,CRS)、CAR-T细胞相关性脑病综合征(CAR?T?cell?related encephalopathy syndrome,CRES)、B细胞再生障碍(B Cell Aplasia)、经济负担(Financial Toxicity),其中以CRS最常见、最显着。细胞因子释放综合征(CRS)是由TCRs或CARs与肿瘤细胞表达的同源抗原结合后T细胞活化引发的。活化的T细胞和免疫旁细胞释放大量的细胞因子和趋化因子,导致血清中细胞因子短暂急剧上升。针对CRS的治疗,一般情况下,轻度CRS采取支持治疗可有效控制病情,但重度CRS患者可能会出现低血压、脏器功能衰竭等严重后果,对生命造成威胁。目前明确报道与CRS严重程度有关的细胞因子有IL-6、CRP,而其他与CRS严重程度有关的细胞因子报道并不多见。CD19 CAR-T细胞输注前后细胞因子IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-ɑ和CRP水平的变化,是否可作为判断CRS严重程度的实验室参考指标和指导临床靶向选择细胞因子拮抗剂,并对CD19 CAR-T细胞的疗效有预测价值进行初步探讨。目的:探索CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平的变化及其临床意义。方法:选取我院2015年8月至2018年2月到我院血液科接受CD19 CAR-T细胞治疗的复发/难治性B-ALL患者32例,其中有23例患者应用微量样本多重蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)、电化学发广发和免疫比浊法检测输注前后血清中IFN-γ、IL-10、TNF-ɑ和IL-6以及CRP水平,根据CTCAE v4.0将发生CRS的患者为轻度CRS组(12级)和重度CRS组(35级),比较两组间所测各细胞因子的差异及治疗反应。其中男16例,女7例。中位年龄22岁。CD19 CAR-T细胞回输后所有患者均发生CRS,其中轻度CRS16例(1级14例、2级2例),重度CRS 7例(3级5例、4级2例)。回输后4周后进行疗效评估,其中完全缓解患者(CR)9例,血象未完全恢复患者(CRi)9例,未缓解患者(NR)5例。所有组别患者性别、年龄均无显着性差异。结果:①CD19 CAR-T细胞输注前和输注后血清中IL-6(2.0028.5 vs 34.5112)、IFN-γ(2.133.12 vs 4.3510.07)、IL-10(1.001.80 vs 4.0139.92)、TNF-ɑ(2.914.60vs 4.9940.18)差异均具有统计学意义(P=0.000,0.000,0.001,0.002);②轻度CRS组和重度CRS组相比,血清中IL-6(28.7561.25 vs 91.001074.00)、IFN-γ(3.937.28 vs 12.5315.30)、IL-10(3.137.47 vs 39.9284.97)、TNF-ɑ(4.6015.77 vs40.1862.51)和CRP(4.9546.86 vs 37.81120.17)差异均具有统计学意义(P=0.004,0.004,0.003,0.000,0.045);③CD19 CAR-T治疗后完全缓解(包括血象未完全恢复患者)组与未缓解组间上述细胞因子与CRP水平,均无统计学差异(P=0.945,0.602,0.884,0.957,0.293);④IL-6显着升高的重度CRS患者,采用IL-6受体拮抗剂治疗后完全恢复。⑤CD19 CAR-T细胞输注前原始细胞数与输注后IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-ɑ细胞因子浓度呈正相关(P=0.023,0.012,0.011,0.035),而与CRP水平无相关(P=0.187)。结论:减少CD19 CAR-T细胞输注前原始细胞数可以减少输注后IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-ɑ细胞因子的水平,且这些细胞因子水平可作为判断CRS严重程度的实验室参考指标,并可指导临床靶向选择细胞因子拮抗剂,但对CD19 CAR-T疗效预测价值有待进一步验证。
张国恩[6](2011)在《隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建》文中研究说明隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)感染动物和人引起的一种寄生虫病,以自限性水样腹泻为主要症状。隐孢子虫能感染170多种动物,其中哺乳动物至少有79种。隐孢子虫卵囊在环境中普遍存在,人类可以通过多种途径获得感染。但目前隐孢子虫病还没有特效的治疗药物,因而对其进行检测与预防很重要。本实验利用酶切法从重组质粒pMD18-T-P23中获得隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)P23基因,克隆到pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX-P23。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果发现rP23可分别与兔隐孢子虫感染兔阳性血清、贝氏隐孢子虫感染鸡阳性血清、微小隐孢子虫感染牛阳性血清、隐孢子虫鼠基因型感染鼠阳性血清特异性反应,而不与兔、鸡、牛、鼠阴性血清反应,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。以纯化的重组蛋白rP23为抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,对其敏感性、特异性和重复性进行观察;利用建立的方法,对临床血清样品进行检测。结果成功地建立了隐孢子虫间接ELISA检测技术,其最适抗原包被浓度为2μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:800,酶标二抗最佳稀释倍数为1:2000,具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用建立的rP23-ELISA检测方法,对23份临床血清样品进行了检测,并与Sheather’s蔗糖漂浮法、nested PCR法检测结果进行比较。结果显示,建立的rP23-ELISA方法检出率高于Sheather’s蔗糖漂浮法和nested PCR法。表明该方法具有敏感性高、特异性强,重复性好、价格低廉、操作简单、能批量检测等特点,可用来对临床样品进行检测,为研制隐孢子虫病ELISA检测试剂盒打下了基础。为建立微小隐孢子虫体外感染模型,并对其在细胞内的生长发育过程进行观察,利用人回盲肠癌细胞(HCT-8细胞)作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养。结果,在6孔培养板中接种1×106、5×105、1×105个细胞后,在24 h、48 h、72 h后长成7080%单细胞层,可以用来接种1×105个微小隐孢子虫。用含有1%血清浓度的培养基来培养微小隐孢子虫,培养72 h后,通过Crypt-a-Glo?和Sporo-Glo?抗体荧光染色,成功观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。为探索绿色荧光蛋白(EGFP)在隐孢子虫中的瞬时表达情况,分别扩增了微小隐孢子虫自身蛋白子孢子表面抗原CP15、热激蛋白70、组蛋白H4、肌动蛋白、微管素蛋白和ATP酶的启动子序列,并将外源蛋白EGFP基因置于其启动子中,共构建了30个穿梭转染质粒。通过电转染导入微小隐孢子卵囊中,培养72 h后,用流式细胞仪、荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP表达情况。结果pSEI和pAET两个质粒转染组流式细胞仪和荧光显微镜检测均观察到EGFP荧光,RT-PCR检测扩增出了特异性条带,表明本研究建立了隐孢子虫体内瞬时转染系统,可以在隐孢子虫体内表达绿色荧光,为下一步稳定表达外源蛋白打下了基础。
于晶晶[7](2011)在《刺参肠道微生态区系及致病菌防治的研究》文中指出海参(sea cucumber)属于棘皮动物门,据今已有六亿多年的历史。海参因具有极高的食用和药用价值位居“八珍”之首。刺参(Apostichpus japonicus)是海参中营养价值最高的一种,辽宁、山东海域是我国刺参温带区的重要产地。由于刺参极具营养价值,经济效益显着,近年来,刺参增养殖业在环渤海海域迅速发展,已成为继海带、对虾、扇贝、海水鱼养殖之后新兴的水产养殖支柱产业。但由于刺参养殖业过速发展和不规范操作,导致刺参体内滋生大量致病菌,刺参成活率严重下降,经济效益损失巨大。在水产疾病防治方面,抗生素仍作为主要手段。但随着抗生素的大量用药,其副作用日益凸显,食品安全问题引起全面重视,为此开发新的无毒、无残留、无污染的中草药制剂,达到增强刺参机体免疫力、预防及治疗刺参疾病、促进刺参生长的目的,对刺参养殖业的可持续发展具有重要意义。刺参“腐皮综合症”因其传染性高、死亡率高而成为刺参养殖病害的研究重点。本文通过对健康刺参肠道和患病刺参肠道菌群进行分离鉴定,探索“腐皮综合症”的发病原因。分别对健康刺参肠道、患“腐皮综合症”刺参肠道、病灶处的细菌进行分离鉴定,结果表明在刺参肠道中的细菌具有多样性,健康肠道中细菌经16S rDNA鉴定得到15种细菌,以芽孢杆菌属为主,结合形态学、生理生化确定优势菌LNUB417为枯草芽孢杆菌,LNUB419为地衣芽孢杆菌。患“腐皮综合症”的刺参肠道菌群结构发生明显变化,分离到16种细菌,优势菌LNUB415为蜡样芽胞杆菌。在患病刺参肠道和病灶处均分离得到一株优势菌LNUB416,经鉴定为动性球菌。由此推测“腐皮综合症”主要是由于病原菌大肆繁殖,改变正常菌群平衡,导致刺参抵抗力下降所致。采用黄芪、连翘、大青叶、鱼腥草、板蓝根、黄连、大黄、黄芩、川芎、金银花、甘草、五倍子和生产中常用抗生素对分离的细菌进行体外抑菌试验,结果显示黄连对LNUB415、LNUB416具有明显抑制作用,并且这2株菌对诺氟沙星、头孢哌酮、呋喃妥因敏感。将LNUB415和LNUB416制成菌悬液,稀释梯度对刺参进行皮下注射试验,结果表明:LNUB415是刺参“腐皮综合症”的条件致病菌之一,致死率随菌悬液浓度增加而增加,高浓度致死率达100%,分别选用黄连(B1组)和诺氟沙星(B2组)喂投患病刺参,B1组死亡率下降至30%,B2组死亡率下降至20%。LNUB416也能够引起刺参患“腐皮综合症”,但该菌致死率并未随浓度增加而有大幅提升,死亡率为60%到70%,皮下注射7d后开始出现症状,发病潜伏期较长,投喂黄连(D1组)对该病疗效显着,死亡水平同投喂诺氟沙星(D2组)基本持平,为20%。黄连对刺参“腐皮综合症”具有防止作用,因其具有无抗药性、无残留、无污染等优点,建议在刺参养殖和疾病治疗中选择中草药代替抗生素。
梁廷明[8](2011)在《中华绒螯蟹螺原体重要功能基因的筛选和研究及螺原体与WSSV的多重PCR检测技术》文中指出中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是首次在水生甲壳动物中发现的螺原体类病原微生物,是一种新型的水生甲壳动物病原体,归属于柔膜体纲(Mollicutes)、虫原体目(Entomoplasmatales)、螺原体科(Spiroplasmataceae)、螺原体属(Spiroplasma);在螺原体属内属于第XLⅢ血清族。它无细胞壁,具典型的螺旋形态,能透过0.22μm的滤膜,具运动性,还能在R2或M1D培养基中生长。该病原具有广泛的宿主范围,能引起中华绒螯蟹颤抖病,也能侵染克氏原螯虾、南美白对虾和罗氏沼虾并引发大规模的死亡,给水产养殖业造成重大经济损失。本课题组前期已经对其生理生化性质、分类地位、病原检测、敏感药物的筛选和有效治疗药物的药代动力学进行了研究并且完成了全基因组的测序和注释,但是其分子生物学研究还有待于深入,尤其是那些与该病原感染宿主相关的重要功能基因的研究。因此,本博士学位论文在前期中华绒螯蟹螺原体研究的基础上,开展了中华绒螯蟹血细胞的原代培养,并运用选择性捕获转录序列(SCOTS)技术在中华绒螯蟹整体水平和细胞水平上开展了螺原体感染宿主过程中的重要功能基因的筛选和研究,开展了中华绒螯蟹螺原体诱导刺激后,原代培养的血细胞的病变效应和免疫相关基因表达分析的研究。此外,还选取中华绒螯蟹螺原体特异性的重要功能蛋白类螺旋蛋白SLP31进行了基因的克隆表达分析。最后构建了利用多重PCR技术同时快速检测克氏原螯虾体内中华绒螯蟹螺原体和白斑综合症病毒的方法。本论文的主要研究结果包括以下4个方面:1.中华绒螯蟹血细胞原代培养体系的建立为研究中华绒螯蟹螺原体与中华绒螯蟹在细胞水平上的相互作用,更好地阐述中华绒螯蟹颤抖病的病理以及螺原体的分子致病机理,本文建立了一种体外培养中华绒螯蟹血细胞的方法。在实验中选用抗凝剂anticoagulant citrate dextrose solution B (ACD-B)和phosphate buffered saline (PBS),结果显示ACD-B的抗凝效果优于PBS。实验中选择了在甲壳动物组织培养中最常用到的两种培养基(改良的L-15培养基和M199培养基)。结果显示,改良的L-15培养基能更有效地促进河蟹血细胞的生长和细胞的存活。中华绒螯蟹血细胞培养的合适生长温度是25-28℃高于其它水生无脊椎动物细胞的合适生长温度(16-20℃)。优化的血细胞原代培养体系最佳条件为:改良的L-15培养基(15%胎牛血清,青霉素和链霉素均为100 U ml-1, pH 7.2-7.4),5%CO2,28℃孵育。血细胞在培养箱中生长良好,存活且保持完整形态可达5周以上。此外,所培养细胞的细胞膜完整性和细胞大小也得到了荧光染色实验的证实。2.中华绒螯蟹螺原体诱导刺激下中华绒螯蟹血细胞数量的变化及原代培养血细胞的免疫反应分析根据以前建立的中华绒螯蟹颤抖病模型,本文研究了中华绒螯蟹颤抖病发病过程中血细胞数量的变化。从症状上来看,在回感前期没有明显的变化,有的中华绒螯蟹在回感前期的活力甚至还要比对照组强。在回感中期,实验组的中华绒螯蟹活力明显下降;到了回感后期,中华绒螫蟹的活力下降更加明显,绝大多数都趴在原地,少有活动,基本都表现出了明显的颤抖症状,有些实验组开始出现集中死亡的现象。在血细胞的变化上,阴性对照组中血细胞的数量基本保持稳定在1.13×107m1-1。回感2天时,血细胞的数量出现了一定的下降(3.65×106m1-1)。回感4天时,血细胞的数量出现了显着的上升(10.8×106m1-1)。回感8天时,血细胞的数量又出现了一定程度的下降(8.75×106m1-1)。回感10天时,血细胞的数量出现了大幅下降(6.25×105ml-1)。回感12天时,血细胞的数量继续下降(5.0×105ml-1),此时实验组中出现了明显的颤抖症状和集中性的死亡本文用中华绒螯蟹螺原体诱导刺激原代培养的中华绒螫蟹血细胞,探讨了中华绒螯蟹免疫相关因子表达的影响。当中华绒螯蟹螺原体诱导刺激原代培养的血细胞之后,anti-lipopolysaccharide factor (ALF) mRNA的相对表达丰度在2-6 h时上调,并且在12h的时候达到峰值(10-fold, P< 0.05); Peroxinectin (Pox) mRNA的相对表达丰度在2-12h之间逐渐下调,随后迅速上升并在24h的时候达到峰值(36-fold, P<0.05),24 h之后又开始了下调。而对于clip domain serine protease (cSP) mRNA的相对表达丰度变化,首先在2h的时候出现下调,然后开始逐渐上调并且在48h的时候达到峰值(2.4-fold, P<0.05),随后在72 h的时候出现了明显的下调。实时定量PCR结果显示ALF, Pox和cSP的表达量都发生了不同程度的变化,特别是Pox基因的变化最为显着,我们推测在中华绒螯蟹螺原体感染血细胞的过程中Pox基因起到了比ALF和cSP更为重要的作用。3.基于选择性捕获转录序列技术的中华绒螯蟹螺原体重要功能基因的筛选及类螺旋蛋白SLP31的原核表达通过利用SCOTS技术,从中华绒螯蟹螺原体感染的不同样品中(整体水平和细胞水平)捕获到了57条有效序列,经过比对在基因组中找到了27个有功能注释的基因。在这些基因编码的蛋白中,有一些是与代谢相关的蛋白,如各种酶类等参与细菌的脂代谢,糖代谢以及核酸代谢。有一些蛋白是与病原的致病性相关的,如类黏附蛋白和EF-Tu与病原的粘附侵染相关。硫醇过氧化物酶、铁蛋白、甘油吸收促进蛋白、核酸内切酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、NAD依赖的甘油三磷酸脱氢酶、N-乙酰葡糖糖胺酶等与病原的代谢相关并通过相关的代谢调控实现毒力效应。此外还捕获到了螺原体的特有蛋白-螺旋蛋白。本论文基于选择性捕获的结果对中华绒螯蟹螺原体的独特蛋白类螺旋蛋白基因(SLP31)进行了序列分析和克隆表达。该序列全长837bp,编码一个279个氨基酸的蛋白,预测的蛋白分子量和等电点分别是31kDa和PI7.72。SLP31的氨基酸序列与其它物种螺旋蛋白的序列相似性提示它可能是螺旋蛋白家族中的一员。本文从中华绒螯蟹螺原体基因组中克隆出了SLP31蛋白基因,我们也试图利用相同的引物序列从S. mirnm的基因组中克隆到该蛋白基因,然而却没克隆出来。这些结果显示SLP31蛋白基因是一个特异的基因,可以用来区分亲缘关系很近的中华绒螯蟹螺原体和非凡螺原体。SLP31被克隆后,经过从TGA到TGG的点突变,在大肠杆菌中进行了全长基因的表达。Western blotting实验显示,纯化的重组蛋白具有一定的免疫原性。SLP31还可以在中华绒螯蟹颤抖病的免疫诊断中作为一个很好的抗原应用。4.利用多重PCR技术同时检测水生甲壳动物螺原体和白斑综合症病毒检测方法的建立中华绒螯蟹螺原体和白斑综合症病毒是重要的水生甲壳动物病原微生物,近年来这两种病原都能感染克氏原螯虾并引起严重的疾病进而造成重大经济损失。本实验的目的是建立一种利用多重PCR同时检测克氏原螯虾体内中华绒螯蟹螺原体和白斑综合症病毒的方法。在一个PCR反应体系中,3对引物按照1:3:1比例混合分别扩增中华绒螯蟹螺原体、白斑综合症病毒和克氏原螯虾的特异性DNA片段。利用两种病原体攻击实验组中的克氏原螯虾,提取DNA模板并用多重PCR进行检测,出现四种不同的结果。克氏原螯虾的特异引物扩增出1195 bp特异条带作为内部参照,衡量整个PCR体系的稳定性。(1)阴性对照组只检测到1195 bp特异条带说明没有这两种病原体感染。(2)中华绒螯蟹螺原体感染组检测到1195 bp和271 bp两条条带。(3)白斑综合症病毒感染组检测到1195 bp和530 bp两条条带。(4)两种病原体同时感染组检测到1195 bp、271 bp和530 bp三条条带。这种方法可以同时检测两种病原微生物,这对克氏原螯虾的养殖监控很重要。实验证明直接利用多重PCR对这两种病原进行同时检测是可行的。本文提供了一种同时检测中华绒螯蟹螺原体和WSSV的新颖而实用的方法,这种方法高效、快捷,可以广泛应用于水产养殖业和出入境检验检疫的检测。
张进良[9](2010)在《鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究》文中提出禽流感(AI)、新城疫(ND)、传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊(IBD)和鸡毒霉形体(MG)感染是目前危害我国养鸡业的几种主要的呼吸道传染病,可导致鸡群不同程度的死亡和生产性能的下降,给我国养禽业造成极大的经济损失。上述疫病虽均有疫苗进行免疫预防,但由于我国地域广阔,养殖模式多样,各种疫病特别是呼吸道疫病仍时有发生,因此,发病后的快速诊断或免疫后的血清抗体效价监测已经成为各地养禽场和诊断室的常规检测项目。目前常用的检测方法有血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验以及酶联免疫吸附试验等,这些常规方法有的耗时长,有的需要特殊的仪器或技术人员,因而在基层应用受到一定限制。胶体金免疫层析方法是以条状纤维层析材料为固相载体,通过毛细管作用原理,以胶体金为示踪物来显示结果的一种新型的检测方法。这种方法具有操作简单、快捷,分析结果清楚、易于判断,且不需要任何仪器、成本低廉等优点,非常适用于现场检测及自动化检测分析。因此,在医学快速检测领域得到了迅猛发展,目前已逐渐应用于动物医学领域的快速检测方面。本研究针对目前鸡的几种主要病毒性疫病抗体检测方法中存在的问题,运用胶体金免疫层析技术,采用间接法原理,建立了五种鸡的主要病毒性疾病抗体的快速检测方法,一种抗体三联检的检测方法和一种抗体效价测定的检测方法。取得了如下研究成果。1. AIV-HA1、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VlhA1.2重组蛋白的表达纯化用带有GST标签的原核表达载体,实现了AIV-HA1、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VlhA1.2重组蛋白的高效表达,通过亲核层析的方法获得了适合于制备试纸条的重组蛋白,并用Western blot对纯化的蛋白进行了分析,结果证实,这5种融合表达的蛋白均具有较好的免疫活性。2.抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备复苏抗鸡IgG Fc段单克隆抗体生产细胞株BDRPDP细胞,经小鼠腹腔接种获得的抗体效价较高的腹水,用辛酸硫酸铵法纯化腹水,并用透析法对纯化的单克隆抗体进行脱盐,获得了高活性、高纯度的单克隆抗体。3.胶体金及胶体金单抗复合物的制备成功确立了柠檬酸三钠还原法制备20 nm胶体金的条件;并利用该胶体金,对抗鸡IgG Fc段单克隆抗体进行了胶体金标记条件的摸索,成功确立了胶体金标记单克隆抗体的条件:每毫升胶体金加入7μL 0.1 mol/L K2CO3时pH最佳,每毫升胶体金加入12μg单克隆抗体为最适蛋白用量,并在该条件下制备了胶体金单抗复合物。4. AIV、NDV、IBV、IBDV和MG血清抗体快速检测试纸条的研制以胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为金标抗体,固定在检测线上的AIV-HA1或NDV-HN或IBV-N或IBDV-VP2或MG-VlhA1.2重组蛋白作为捕获抗原,采用间接法,分别成功地建立了AIV HA1蛋白血清抗体快速检测试纸条、NDV血清抗体快速检测试纸条、IBV血清抗体快速检测试纸条、IBDV血清抗体快速检测试纸条和MG血清抗体快速检测试纸条。用制成的这5种单一血清抗体快速检测试纸条对AIV H5亚型阳性血清、AIV H9亚型阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、IBDV阳性血清和MG阳性血清分别进行测试。每种试纸条均只与相应的阳性血清发生反应,与其他所有阳性血清均呈阴性反应。在此基础上,本研究又以抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为示踪物,采用三条检测线分别包被IBDV-VP2、IBV-N和AIV-HA1重组蛋白作为捕获抗原,建立了IBDV、IBV和AIV三联血清抗体快速检测试纸条。实验结果证明,本方法特异性强,灵敏度高,且操作简便、结果判定直观,可在一份样品中同时对IBDV、IBV和AIV三种抗体进行快速检测。5.IBV抗体效价快速检测试纸条的研制本研究以胶体金标记抗鸡IgG Fc段单克隆抗体作为示踪物,用固定在三条检测线上的不同浓度的IBV-N蛋白作为捕获抗原,采用间接法,成功地建立了IBV抗体效价快速检测试纸条。用制成的试纸条检测AIV H5亚型阳性血清、AIV H9亚型阳性血清、NDV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、IBDV阳性血清和MG阳性血清分别进行测试,未出现与交叉反应。对不同效价的IBV抗体进行测试,确定为血清效价大于8log2出现三条检测线,介于8log2和5log2之间的出现两条检测线,介于5log2和2log2之间的出现一条检测线,小于2log2不出现检测线。实验结果表明,本方法特异性强,且操作简便、结果判定直观,可以用于IBV抗体效价测定。
王明明[10](2004)在《AT细胞辐射敏感性的研究》文中研究说明生物有机体的辐射敏感性是影响电离辐射生物效应的一个重要因素。不同种系、不同个体、不同组织和细胞、甚至不同生物大分子,对电离辐射的敏感性差异很大,即同一剂量的同种射线在相同条件下照射不同机体、组织、细胞或生物大分子时,产生的辐射损伤效应或者刺激效应可能截然不同。研究表明,细胞辐射敏感性主要与该细胞的DNA含量、细胞种类及其生化结构、细胞所处的细胞周期时相、细胞所处内外环境、细胞增殖速率、细胞对辐射损伤的修复能力和细胞清除自由基的能力等因素有关。最近二十年,随着临床肿瘤放疗和辐射防护学科的发展,细胞辐射敏感性研究逐渐成为放射生物学领域的热点。 毛细血管扩张-运动共济失调症(ataxiaTelangiectasia,AT)是一种常染色体隐性遗传病,该病患者具有进行性小脑退化、早熟和肿瘤高发病率等多种特殊的临床表现及与临床表现相一致的高辐射敏感性、免疫缺陷、基因组不稳定性等特点。培养的AT细胞缺少正常的辐射诱发的细胞周期关卡,并出现与临床表现相一致的特征性表型。AT的缺陷性表型与AT细胞染色体11q 22-23的ATM基因功能失活有关。ATM是介导细胞对某种DNA损伤反应的信号传导系统中的关键蛋白。蛋白序列分析显示,ATM属于大真核蛋白家族,它调控细胞对DNA损伤的反应,包括DNA损伤的修复、基因重AT细胞辐射敏感性的研究中文摘要组、细胞凋亡和细胞周期关卡等。 目的:本课题通过测定AT细胞染色体畸变率、细胞周期各时相细胞的份额、细胞凋亡率、DNA双链断裂及其修复程度、细胞培养介质中超氧阴离子自由基浓度、细胞3H一TdR掺入率,与正常成纤维细胞GM作比较来研究电离辐射对AT细胞增殖、细胞周期分布、细胞凋亡、染色体畸变、细胞释放超氧阴离子自由基及细胞DNA双链断裂及其修复的影响,对 AT细胞辐射敏感性的机理进行初步探讨,进而为AT病研究提供生物学依据。 方法:(1)细胞培养:将AT和GM两种成纤维细胞接种于含15%小牛血清的DMEM或RPMI 1640培养基,37℃、5%COZ条件下传代培养。(2)细胞照射:应用60CoY源对细胞进行不同剂量照射,剂量率为IGy/min;(3)染色体畸变分析:常规染色体制片,对O,1,2,3,4Gy剂量组分别观察400一1200个中期分裂相,计数其中出现的双着丝粒和着丝粒环;(4)细胞周期:根据细胞中DNA含量,应用流式细胞仪分析G。/GI、S和G:/M细胞所占的份额;(5)细胞凋亡检测:用酚、氯仿及异戊醇法抽提DNA,琼脂糖电泳分离DNA片断,观察细胞凋亡过程中产生的DNA断片;根据细胞膜受照后磷脂酞丝氨酸外翻的特点,以AnnexinV一FITC ApoptosiS DetectionKit工处理细胞,FACS法测定细胞调亡率。(6)DNA双链断裂与修复:胰蛋白酶消化照后培养不同时间的细胞,离心清洗后与低熔点琼脂糖混合、冷却成块,置于点样户a,细胞辐射敏感性的研究中文摘要孔中,CHEF MAPPERT,型脉冲电场凝胶电泳仪进行电泳,观察DNA断裂与修复情况。(7) 3H一TdR掺入:培养开始时加入lml浓度为3.5 x 105/ml的细胞悬液2.smlRPMll64O培养液和浓度为2.22 x IOSBq/ml的3H一TdRZO pl,培养24h或48h后,以0.25%胰蛋白酶消化细胞,滤膜法制样,液体闪烁法测定各样品的cpm值(每分钟脉冲计数)(8)超氧阴离子自由基含量测定:细胞培养条件、细胞密度及培养时间同3H一TdR掺入实验,培养终止前sh,换用无色RPMll64O培养基培养细胞,同时加入浓度为160 pM的氧化型细胞色素C 60pl,细胞色素C还原法测定培养上清液光密度(OD值),根据克分子消光系数换算成。2一浓度(nmol/h/1护细胞); 结果:(l)AT和GM细胞染色体畸变率随受照剂量增加而升高,并且相同剂量照射后,AT细胞畸变率·明显高于GM细胞。(2)GM细胞随着照后时间的延长和照射剂量的增大,GZ/M期细胞比例逐步增大,发生GZ期阻滞;而AT细胞随着照后时间的延长和照射剂量增大,GZ/M期细胞比例逐步减小,未发生GZ期阻滞。(3)AT和GM两种细胞的凋亡率均随剂量增大和照后时间延长而增大,且剂量相同或时间相同时,前者凋亡率均高于后者。 (4)GM和AT两种细胞受到O一6Gy6OCoY射线照射后,其DNA双链断裂程度随剂量增大而加剧,且随照后培养时间延长,二者DNA双链断裂损伤均有不同程度恢复;同一剂量点或照后同一时刻,AT细胞的DNA断片数大于AT细胞辐射敏感性的研究中文摘要GM细胞。(5)AT和GM两种细胞的增殖程度与细胞产生O‘的量密切相关,AT和GM两种细胞向培养介质中释放仇一的量均随辐照剂量增大而减小,且相同照射剂量下,AT细胞释放仇一的量减少得比GM细胞快。与此相对应,两种细胞的存活率也均随剂量增大而减小,相同照射剂量下,AT细胞存活率下降得也比GM细胞快。表明细胞。2一释放能力的改变直接影响到该细胞的辐射敏感性。 结论: 1.AT细胞缺乏辐射诱发的细胞周期关卡及DNA双链断裂损伤修复机制存在缺陷是AT细胞高辐射敏感性的原因。 2.AT细胞的增殖和存活均与其02一释放能力密切相关。AT细胞受照后02一释放能力的改变与其高辐射敏感性之间存在紧密联系。
二、辐射敏感综合症——AT病研究进展(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、辐射敏感综合症——AT病研究进展(论文提纲范文)
(1)磁共振动脉自旋标记及其拓展技术在颈动脉狭窄中的应用研究(论文提纲范文)
中英文缩略词表 |
中文摘要 |
Abstract |
前言 |
参考文献 |
第一部分: 构建基于54例健康人供血区选择性动脉自旋标记的按照Willis环分类的正常脑血管灰质灌注范围模板 |
引言 |
1 方法与结果 |
1.1 健康被试 |
1.2 MRI |
1.3 图像评估 |
1.4 数据处理及结果 |
2 讨论 |
3 小结 |
4 参考文献 |
第二部分: 颈动脉内膜切除术前基于ASL信号强度及ASPECTS定位的侧枝循环评分与术后颈动脉供血范围及认知水平变化关系的研究 |
引言 |
1 材料与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 MRI图像采集 |
1.3 数据分析 |
1.4 图像评估分析 |
1.5 神经心理学测评 |
1.6 统计学分析 |
2 结果 |
2.1 基线特征比较 |
2.2 侧枝循环和灌注范围正常化的关系 |
2.3 神经心理学测评结果和脑灌注的关系 |
3 讨论 |
4 小结 |
参考文献 |
第三部分: ASL灌注特征和Willis环形态对颈动脉血运重建术后脑过度灌注的预测价值 |
引言 |
1 材料与方法 |
1.1 患者 |
1.2 MRI检查 |
1.3 图像评估 |
1.4 数据处理 |
1.5 统计分析 |
2 结果 |
2.1 患者基本资料及脑过度灌注临床危险因素 |
2.2 脑过度灌注分型 |
2.3 脑过度灌注综合症典型病例分析 |
2.4 脑过度灌注影像危险因素 |
3 讨论 |
4 小结 |
参考文献 |
第四部分: 长标记pCASL技术的可靠性和可重复性研究 |
引言 |
1 材料与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 图像采集 |
1.3 CBF定量 |
1.4 数据分析 |
1.5 统计学分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
参考文献 |
第五部分: 流入饱和技术在多延迟动脉自旋标记中的应用价值 |
引言 |
1 材料与方法 |
1.1 研究对象及图像采集 |
1.2 数据分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
参考文献 |
综述: “后白皮书时代”动脉自旋标记技术进展及应用 |
1 ASL基本原理 |
2 ASL标记方式 |
3 ASL灌注成像面临的挑战 |
4 ASL灌注成像改进方案 |
4.1 多期延迟 ASL (multi-delayASL)和长标记长延迟 ASL(丨ong-labe丨丨ong-delayASL) |
4.2 速度选择 ASL(velocity selective ASL,VS-ASL)和加速度选择ASL(acceIeration selective ASL, AccASL) |
5 ASL血管成像 |
5.1 加速度选择 ASL MRA (AccASL MRA) |
5.2 4D MRA |
6 ASL fMRI |
7 ASL的其他拓展技术及应用 |
7.1 血管选择性供血区成像 |
7.2 心动触发 pCASL (cardiac-triggered pCASL) |
7.3 ASL 指纹识别技术(fingerprinting) |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(2)脐血造血干细胞输注修复放射后小鼠造血系统损伤的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩略语 |
第一章 前言 |
第二章 实验方法 |
一、实验材料 |
二、数据处理 |
第三章 实验结果 |
第四章 讨论 |
第五章 结论与创新点 |
参考文献 |
附录 文献综述 造血干细胞治疗骨髓型急性放射病的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
(3)养殖对虾五种常见病原的MNPCR检测法的构建优化(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 引言 |
1.1 凡纳滨对虾养殖概况 |
1.2 当前对虾养殖生产中的常见病原 |
1.2.1 副溶血性弧菌 |
1.2.2 肝肠胞虫 |
1.2.3 白斑综合症病毒 |
1.2.4 传染性皮下及造血组织坏死病毒 |
1.2.5 虾血细胞虹彩病毒 |
1.2.6 桃拉综合症病毒 |
1.2.7 对虾杆状病毒 |
1.3 对虾病原微生物的检测技术 |
1.3.1 组织病理学诊断 |
1.3.2 胶体金免疫层析技术检测法 |
1.3.3 分子生物学方法 |
1.4 本研究的目的及意义 |
第二章 广东沿海地区凡纳滨对虾EHP、VP_(AHPND)和SHIV感染情况调查与分析 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 主要仪器 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 样品采集 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 DNA提取 |
2.2.2 病原检测 |
2.2.3 PCR扩增 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 EHP、VP_(AHPND)和SHIV的PCR检测结果 |
2.3.2 不同地区养殖凡纳滨对虾三种病原的感染情况 |
2.3.3 不同养殖模式下凡纳滨对虾三种病原的感染情况 |
2.3.4 各个养殖要素的病原携带情况 |
2.3.5 滞长养殖对虾的病原检测结果 |
2.4 讨论 |
2.4.1 两个养殖区EHP、VP_(AHPND)和SHIV的分布特征分析 |
2.4.2 养殖对虾出现生长相关问题的病原因素分析 |
2.5 小结 |
第三章 五种病原的多重巢式PCR检测方法的构建与优化 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 主要仪器 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 样品采集 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 五种病原的特异性引物设计 |
3.2.2 阳性质粒DNA的制备 |
3.2.3 多重巢式PCR反应条件优化 |
3.2.4 多重巢式PCR方法的灵敏度检测 |
3.2.5 以多重巢式PCR方法检测采集的样品 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 多重巢式PCR反应条件的优化结果 |
3.3.2 多重巢式PCR检测方法的灵敏度测试 |
3.3.3 凡纳滨对虾病原检测结果 |
3.4 讨论 |
3.4.1 多重巢式PCR体系优化结果分析 |
3.4.2 两种养殖模式下EHP、WSSV、IHHNV、VP_(AHPND)和SHIV的分布特征分析 |
3.4.3 养殖对虾生长问题与感染EHP的相关性分析 |
3.4.4 汕尾市高位池养殖池中对虾出现大规模死亡的原因分析 |
3.5 小结 |
第四章 结论与展望 |
4.1 结论 |
4.2 创新点 |
4.3 展望 |
参考文献 |
致谢 |
在读期间发表的学术论文及研究成果 |
(4)缺血性卒中病因学的3D高分辨磁共振管壁成像的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 引言 |
1 研究背景和意义 |
1.1 缺血性脑卒中流行病学现状 |
1.2 缺血性脑卒中危险因素、临床表现、诊断方法 |
1.3 缺血性卒中病因学研究 |
1.4 前、后循环缺血性脑卒中病因学差异 |
1.5 病因学研究的临床意义 |
1.6 缺血性卒中病因学诊断研究进展 |
1.7 三维磁共振管壁成像在斑块成像中的应用 |
2 本文的主要工作和创新点 |
2.1 研究目标和内容 |
2.2 本研究学术特色及理论依据 |
2.3 论文的主要创新点 |
3 论文的组织结构 |
第二章 磁共振病因学识别技术 |
1 总论 |
2 颅脑血管成像技术 |
2.1 超声血管成像 |
2.2 磁共振、CT及 DSA血管成像 |
3 管壁成像技术 |
3.1 CT成像技术(可关注钙化) |
3.2 磁共振黑血管壁成像技术应用及进展 |
4 技术对比,总结 |
第三章 三维高分辨头颈联合管壁成像对缺血性卒中病因学的研究 |
1 背景 |
2 材料和方法 |
2.1 磁共振扫描 |
2.2 图像评估 |
2.3 图像后处理 |
2.4 统计学方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 结论 |
第四章 脑穿支动脉病变所致缺血性卒中的高分辨磁共振研究 |
1 背景 |
2 材料与方法 |
2.1 患者 |
2.2 MR扫描 |
2.3 图像后处理 |
2.4 图像质量判断 |
2.5 高分辨管壁成像图像评估 |
2.6 统计学方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 创新性 |
6 局限性 |
7 结论 |
总结 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读博士学位期间获得的学术成果 |
个人简历 |
导师评阅表 |
(5)CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平变化及其临床意义(论文提纲范文)
英文缩写表(Abbreciation) |
中文摘要 |
Abstract |
1.引言 |
1.1 急性 B 淋巴细胞白血病(ALL)概述 |
1.2 CD19 CAR-T 细胞疗法概述 |
1.3 细胞因子释放综合症(Cytokine release syndrome,CRS) |
2.研究对象、材料与方法 |
2.1 研究对象 |
2.1.1 入组及排除标准 入组标准 |
2.1.2 研究对象基本临床资料 |
2.1.3 CD19 CAR-T 细胞的制备 |
2.1.4 CD19 CAR-T 细胞输注前预处理 |
2.1.5 CRS 的评价标准 |
2.2 研究内容 |
2.3 设备与试剂 |
2.3.1 主要的设备与耗材 |
2.3.2 主要试剂 |
2.4 实验步骤 |
2.4.1 标本的采集 |
2.4.2 标本检测 |
2.5 统计学分析 |
3.结果 |
3.1 一般临床资料 |
3.2 CD19 CAR-T输注前后血清中细胞因子与CRP水平 |
3.3 CD19 CRA-T细胞输注后轻度CRS、重度 CRS细胞因子与CRP水平表达差异 |
3.4 重度CRS患者使用IL-6 受体拮抗剂后IL-6 水平变化 |
3.5 CD19 CAR-T细胞不同疗效间的细胞因子和CRP水平差异 |
3.6 CD19 CAR-T细胞输注负患者肿瘤前荷与输注后细胞因子和CRP水平关系 |
4.讨论 |
5.结论 |
6.参考文献 |
附录 |
致谢 |
综述 |
参考文献 |
(6)隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 隐孢子虫病研究概况 |
1.1 隐孢子虫病原学与分类学研究进展 |
1.2 隐孢子虫病的分子流行病学研究进展 |
1.3 隐孢子虫检测方法的研究进展 |
1.4 隐孢子虫体外培养研究进展 |
1.5 隐孢子虫转基因技术研究进展 |
1.6 隐孢子虫病的治疗与预防 |
1.7 展望 |
第二章 隐孢子虫P23 基因的原核表达 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 质粒与菌株 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 血清 |
2.1.4 主要溶液的配制 |
2.1.5 主要仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 重组质粒pMD18-T-P23 的鉴定 |
2.2.2 原核表达质粒pGEX-P23 的构建与鉴定 |
2.2.3 重组质粒pGEX-P23 的表达与表达产物的纯化 |
2.2.4 rP23 的Western blot分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 重组质粒pMD18-T-P23 的鉴定 |
2.3.2 原核表达质粒pGEX-P23 的鉴定 |
2.3.3 重组质粒 pGEX-P23 转化菌的表达及表达产物的纯化 |
2.3.4 rP23 的 Western blot 分析结果 |
2.4 讨论 |
第三章 隐孢子虫抗体间接ELISA检测方法的建立 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 质粒与菌株 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 血清及粪便样品 |
3.1.4 主要溶液的配制 |
3.1.5 主要仪器 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 rP23-ELISA间接诊断方法的建立 |
3.2.2 田间样品检测 |
3.3 结果 |
3.3.1 间接ELISA检测方法的建立 |
3.3.2 田间样品检测及敏感性、特异性试验 |
3.4 讨论 |
第四章 微小隐孢子虫在HCT-8 细胞上的培养研究 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 细胞与菌株 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要溶液的配制 |
4.1.4 主要仪器 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 HCT-8 细胞的培养 |
4.2.2 HCT-8 细胞培养方法的优化 |
4.2.3 微小隐孢子虫卵囊收集与纯化 |
4.2.4 微小隐孢子虫的体外培养 |
4.2.5 微小隐孢子虫体外培养各阶段形态的免疫荧光观察 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 HCT-8 细胞培养方法的优化 |
4.3.2 微小隐孢子虫收集与纯化 |
4.3.3 微小隐孢子虫卵囊活力检测 |
4.3.4 微小隐孢子虫体外培养各阶段形态的免疫荧光观察 |
4.4 讨论 |
第五章 微小隐孢子虫体内瞬时转染系统的初步研究 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 细胞与菌株 |
5.1.2 主要试剂 |
5.1.3 主要溶液的配制 |
5.1.4 主要仪器 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 启动子序列的克隆 |
5.2.2 EGFP表达盒转染质粒(含有TUB-3'UTR)的构建 |
5.2.3 EGFP表达盒转染载体(除TUB-3'UTR)的构建 |
5.2.4 电穿孔转染 |
5.2.5 转染隐孢子虫EGFP表达检测 |
5.3 结果 |
5.3.1 启动子序列的克隆 |
5.3.2 EGFP表达盒转染载体的构建 |
5.3.3 转染隐孢子虫EGFP表达检测 |
5.4 讨论 |
第六章 全文结论 |
1.隐孢子虫 P23 基因的原核表达 |
2.隐孢子虫抗体间接 ELISA 诊断方法的建立 |
3.微小隐孢子虫在 HCT-8 细胞上的培养研究 |
4.微小隐孢子虫体内瞬时转染系统的初步研究 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(7)刺参肠道微生态区系及致病菌防治的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
引言 |
0.1 刺参简介 |
0.2 我国刺参养殖现状及问题 |
0.2.1 我国刺参养殖现状 |
0.2.2 我国刺参养殖业存在问题 |
0.3 养殖刺参疾病研究 |
0.3.1 养殖刺参幼体浮游期疾病 |
0.3.2 稚参附着期疾病 |
0.3.3 幼参及养成期疾病 |
0.3.4 寄生虫性疾病 |
0.3.5 其他敌害生物 |
0.4 中草药研究进展 |
0.4.1 水产养殖治疗性药物的使用 |
0.4.2 中草药在水产养殖中应用 |
0.4.3 中草药在水产养殖中存在问题及发展趋势 |
0.5 本实验的目的和意义 |
第1章 刺参肠道可培养细菌的分离鉴定 |
1.1 材料与方法 |
1.1.1 实验材料 |
1.1.2 实验方法 |
1.2 结果与分析 |
1.2.1 健康刺参肠道细菌 |
1.2.2 患病刺参肠道细菌 |
1.2.3 患病刺参病灶细菌 |
1.2.4 LNUB415 菌株鉴定 |
1.2.5 LNUB416 菌株鉴定 |
1.2.6 细菌生理生化指标测定 |
1.3 小结 |
第2章 体外抑菌实验及药物筛选 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 材料 |
2.1.2 实验方法 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 体外抑菌试验结果 |
2.2.2 人工感染实验结果 |
2.3 小结 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
(8)中华绒螯蟹螺原体重要功能基因的筛选和研究及螺原体与WSSV的多重PCR检测技术(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第1章 绪论 |
1.1 螺原体的分类现状及生物学特性的研究进展 |
1.1.1 螺原体的分类现状 |
1.1.2 螺原体的生物学特性研究进展 |
1.2 柔膜体纲细菌基因组及致病相关基因的研究进展 |
1.2.1 柔膜体纲基因组研究进展 |
1.2.2 柔膜体纲微生物致病性研究概况 |
1.3 河蟹颤抖病的研究及中华绒螯蟹螺原体的科学命名 |
1.4 水生甲壳动物细胞培养研究进展 |
1.5 甲壳动物先天免疫系统研究进展 |
1.6 水生螺原体的诊断和防治技术集成 |
1.6.1 水生螺原体的诊断技术 |
1.6.2 水生螺原体的防治技术集成 |
1.7 本论文的研究目的、内容、意义和技术路线 |
第2章 中华绒螯蟹血细胞原代培养体系的建立和优化 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 实验动物 |
2.1.2 主要试剂和仪器 |
2.1.3 实验方法 |
2.2 实验结果 |
2.2.1 抗凝剂的选择 |
2.2.2 河蟹血细胞合适的细胞培养温度 |
2.2.3 细胞培养过程中的细胞生长状态 |
2.2.4 中华绒螯蟹血细胞存活能力的鉴定 |
2.3 讨论 |
第3章 中华绒螯蟹螺原体诱导刺激下中华绒螯蟹血细胞数量的变化及原代培养血细胞的免疫反应 |
3.1 材料 |
3.1.1 主要设备 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 引物设计与合成 |
3.2 实验动物和中华绒螯蟹螺原体的培养 |
3.2.1 实验动物 |
3.2.2 中华绒螯蟹螺原体的培养 |
3.2.3 中华绒螯蟹血细胞的培养 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 中华绒螯蟹螺原体诱导刺激下中华绒螫蟹的血细胞数量变化趋势 |
3.3.2 中华绒螯蟹螺原体诱导刺激下中华绒螯蟹原代培养血细胞的形态变化和免疫反应 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 中华绒螯蟹螺原体诱导刺激后血细胞数量的变化 |
3.4.2 螺原体刺激中华绒螯蟹原代培养血细胞后细胞形态的变化规律 |
3.4.3 螺原体刺激中华绒螯蟹原代培养血细胞后总RNA的提取 |
3.4.4 Real-Time RT-PCR结果 |
3.5 讨论 |
第4章 基于选择性捕获转录序列技术的中华绒螯蟹螺原体重要功能基因的筛选研究 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 主要实验仪器和试剂 |
4.1.2 实验动物、中华绒螯蟹螺原体的培养和血细胞的原代培养 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 中华绒螯蟹螺原体rDNA的克隆 |
4.2.2 中华绒螯蟹螺原体基因组的光敏生物素化 |
4.2.3 中华绒螯蟹螺原体回感后宿主总RNA的提取和捕获样品的制备 |
4.2.4 选择性捕获转录序列实验(SCOTS) |
4.2.5 SCOTS捕获序列的基因组定位和序列分析 |
4.3 实验结果和讨论 |
4.3.1 中华绒螯蟹螺原体rDNA的克隆 |
4.3.2 中华绒螯蟹螺原体全基因组的提取和浓度测定 |
4.3.3 中华绒螯蟹螺原体基因组的光敏生物素化结果 |
4.3.4 S.eriocheiris回感中华绒螫蟹后血细胞的电镜观察 |
4.3.5 S.eriocheiris回感中华绒螯蟹和原代培养血细胞后总RNA的提取与含量测定 |
4.3.6 选择性捕获转录序列结果 |
4.3.7 SCOTS技术在本实验中的应用 |
4.3.8 中华绒螯蟹螺原体与肺炎支原体致病性的比较分析 |
4.3.9 SCOTS捕获部分重要功能蛋白的分析 |
4.3.10 小结 |
第5章 中华绒螯蟹螺原体类螺旋蛋白(SLP31)的序列分析、克隆和原核表达 |
5.1 材料 |
5.1.1 主要设备 |
5.1.2 主要试剂 |
5.1.3 引物设计与合成 |
5.2 方法 |
5.2.1 中华绒螯蟹螺原体和S.mirum的基因组DNA提取 |
5.2.2 SLP31基因PCR扩增 |
5.2.3 SLP31基因与pUC19载体的连接 |
5.2.4 pUC-SLP31连接产物的转化 |
5.2.5 菌液PCR鉴定阳性克隆、测序分析 |
5.2.6 点突变实验 |
5.2.7 表达载体的构建 |
5.2.8 重组蛋白的表达与鉴定 |
5.2.9 Western blot分析蛋白表达结果 |
5.2.10 重组蛋白的纯化 |
5.2.11 数据分析处理 |
5.3 结果 |
5.3.1 中华绒螯蟹螺原体基因组DNA的提取、SLP31基因PCR扩增及序列分析 |
5.3.2 中华绒螯蟹螺原体SLP31基因的点突变 |
5.3.3 原核表达载体的构建 |
5.3.4 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 |
5.4 讨论 |
第6章 利用多重PCR技术同时检测水生甲壳动物螺原体和白斑综合症病毒检测方法的建立 |
6.1 材料 |
6.1.1 主要仪器和试剂 |
6.1.2 实验动物 |
6.1.3 中华绒螯蟹螺原体和白斑综合症病毒的准备 |
6.1.4 引物设计与合成 |
6.2 实验方法 |
6.2.1 基于两种病原的克氏原螯虾回感实验 |
6.2.2 总DNA的提取 |
6.2.3 引物混合的比例 |
6.2.4 多重PCR检测 |
6.2.5 利用积分光密度integral ptiealdensity(IoD)分析评价克氏原鳌虾的病 原相对感染程度 |
6.3 实验结果 |
6.3.1 最佳引物混合比例 |
6.3.2 多重PCR扩增结果 |
6.3.3 相对感染程度的分析 |
6.4 讨论 |
第7章 结论 |
附录A |
参考文献 |
在读期间发表的学术论文及研究成果 |
致谢 |
(9)鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究(论文提纲范文)
摘要 ABSTRACT 缩略词(Abbreviation) 第1章 文献综述 |
1 禽流感的研究进展 |
1.1 病原 |
1.2 流行病学 |
1.2.1 宿主范围 |
1.2.2 禽流感的流行病学特点 |
1.3 AIV凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白 |
1.4 禽流感检测方法的研究进展 |
1.4.1 病原学的诊断方法 |
1.4.2 血清学诊断方法 |
1.4.3 分子生物学诊断技术 |
2 新城疫的研究进展 |
2.1 病原 |
2.1.1 病原的分类 |
2.1.2 血清型 |
2.2 血凝素神经氨酸酶蛋白结构与功能 |
2.3 新城疫的传播与危害 |
2.4 新城疫检测方法的研究进展 |
2.4.1 病毒的分离与鉴定 |
2.4.2 清学诊断技术 |
2.4.3 分子生物学诊断技术 |
3 鸡传染性支气管炎的研究进展 |
3.1 病原 |
3.1.1 病原的分类 |
3.1.2 清型 |
3.2 IBV的N蛋白研究 |
3.3 流行病学 |
3.4 鸡传染性支气管炎检测方法 |
3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
3.4.2 IBV血清学检测技术 |
3.4.3 分子生物学检测技术 |
4 鸡传染性法氏囊的研究进展 |
4.1 病原 |
4.1.1 病毒学分类、形态及理化特性 |
4.1.2 病毒培养特性 |
4.1.3 病毒血清型 |
4.1.4 IBDV的基因组结构和编码的蛋白 |
4.2 流行病学 |
4.2.1 自然宿主与传播媒介 |
4.2.2 流行特点 |
4.3 鸡传染性法氏囊检测方法的研究进展 |
4.3.1 病毒分离 |
4.3.2 清学方法 |
4.3.3 分子生物学方法 |
5 鸡毒霉形体的研究进展 |
5.1 病原 |
5.1.1 病原及发病特点 |
5.1.2 MG的基因组结构和结构蛋白的研究 |
5.2 流行病学 |
5.3 鸡毒霉形体的检测方法 |
5.3.1 病原的分离鉴定 |
5.3.2 清学方法 |
5.3.3 分子生物学方法 |
6 胶体金免疫层析技术的研究进展 |
6.1 胶体金的特性及其制备 |
6.1.1 胶体金的特性 |
6.1.2 胶体金的制备方法 |
6.2 免疫胶体金的制备及其应用 |
6.2.1 免疫胶体金的制备原理 |
6.2.2 免疫胶体金的应用 |
6.4 胶体金免疫层析技术的原理及其优势 |
6.4.1 胶体金免疫层析技术的原理 |
6.4.2 胶体金免疫层析技术的优势 |
6.5 胶体金免疫层析技术的研究趋势 |
6.5.1 提高胶体金免疫层析产品的性能 |
6.5.2 实现多元检测 |
6.5.3 实现半定量或定量测定 |
7 研究目的与意义 第2章 AIV-HA1 NDV-HN IBV-N IBDV-VP2 MG-V1hA1.2重组蛋白的表达与纯化 |
1 研究目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 质粒、菌株及试剂 |
2.1.2 相关溶液的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
2.2.2 重组表达质粒的转化 |
2.2.3 诱导表达 |
2.2.4 包涵体的纯化与复性 |
2.2.5 蛋白浓度的测定 |
2.2.6 SDS-PAGE电泳 |
2.2.7 Western blot |
3 结果与分析 |
3.1 重组菌诱导条件及目标蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果 |
3.2 Western blot分析 |
3.3 纯化蛋白浓度测定 |
4 讨论 |
4.1 表达载体与表达菌的选择 |
4.2 诱导条件和纯化方法 |
4.3 对HN、N蛋白表达形式的分析 |
4.4 对HN、VP2、VlhA1.2蛋白表达量和表达状态的分析 |
5 结论 第3章 AIV、NDV、IBV、IBDV、MG血清抗体快速检测试纸条的研制 |
1 研究的目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 仪器 |
2.1.2 生物材料、化学试剂及其它 |
2.1.3 溶液的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的制备与纯化 |
2.2.2 胶体金的制备 |
2.2.3 胶体金颗粒的鉴定 |
2.2.4 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值的确定 |
2.2.5 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定 |
2.2.6 金标单抗复合物的制备与纯化 |
2.2.7 封闭液的选择 |
2.2.8 样品垫、金标垫的制备 |
2.2.9 质控线与检测线的包被 |
2.2.10 试纸条的组装及结果判定标准 |
2.2.11 样品稀释液与样品稀释倍数的确定 |
2.2.12 试纸条交叉反应试验 |
2.2.13 试纸条检测下限的确定 |
2.2.14 快速检测血清抗体试剂盒组装及初步应用 |
3 结果与分析 |
3.1 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的纯化 |
3.2 胶体金的制备 |
3.3 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记胶体金pH值的确定 |
3.4 抗鸡IgG Fc段单克隆抗体的最适标记量的确定 |
3.5 金标单抗复合物的鉴定 |
3.6 封闭液的选择 |
3.7 检测线和质控线的包被条件 |
3.8 样品稀释液与样品稀释倍数的确定 |
3.9 试纸条交叉反应试验 |
3.10 试纸条检测下限的确定 |
3.11 试剂盒的重复性试验和保存期试验 |
3.12 几种试剂盒的临床应用 |
4 讨论 |
4.1 胶体金颗粒制备及鉴定 |
4.2 胶体金标记的单克隆抗体的制备 |
4.3 胶体金标记物抗鸡IgG Fc段单克隆抗体 |
4.4 封闭液的选择 |
4.5 检测线和质控线包被条件 |
4.6 样品稀释液与稀释倍数的确定 |
4.7 试纸条检测下限的确定 |
4.8 几种试剂盒的临床应用 |
5 结论 第4章 AIV、IBV、IBDV抗体快速联检试纸条的研制 |
1 研究的目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 仪器 |
2.1.2 生物材料、化学试剂及其它 |
2.1.3 溶液的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 试纸条的构建 |
2.2.2 最佳反应条件的选择 |
2.2.3 试纸条的特异性试验 |
2.2.4 试纸条的敏感性试验 |
3 结果与分析 |
3.1 最佳反应条件的选择 |
3.2 试纸条的特异性试验 |
3.3 试纸条的敏感性试验 |
4 讨论 |
4.1 最佳反应条件的选择 |
5 结论 第5章 IBV抗体效价快速检测试纸条的研制 |
1 研究的目的与意义 |
2 材料与方法 |
2.1 材料 |
2.1.1 仪器 |
2.1.2 生物材料、化学试剂及其它 |
2.1.3 溶液的配制 |
2.2 方法 |
2.2.1 试纸条的构建 |
2.2.2 最佳反应条件的选择 |
2.2.3 试纸条的特异性试验 |
2.2.4 试纸条的敏感性试验 |
3 结果与分析 |
3.1 最佳反应条件的选择 |
3.2 试纸条的特异性试验 |
3.3 试纸条的敏感性试验 |
4 讨论 |
4.1 最佳反应条件的选择 |
4.2 试纸条测定界限的选择 |
5 结论 参考文献 研究生期间发表的主要论文和专利申请 致谢 |
(10)AT细胞辐射敏感性的研究(论文提纲范文)
一、 引言 |
二、 正文 |
第一部分 用常规染色体分析法研究AT细胞辐射敏感性 |
第二部分 ~(60)Coγ射线照射对AT细胞周期进程的影响 |
第三部分 ~(60)Coγ射线照射对AT细胞凋亡的影响 |
第四部分 用PFGE法检测~(60)Coγ射线诱发AT细胞DNA双链断裂与损伤修复效应 |
第五部分 AT细胞辐射敏感性与O_2~-的关系 |
第Ⅰ部分: O_2~-对AT细胞增殖能力的影响 |
第Ⅱ部分: AT细胞辐射敏感性与O_2~-之间的关系 |
三、 结论 |
四、 参考文献 |
五、 综述 |
六、 发表论文及其它(硕士期间) |
七、 致谢 |
四、辐射敏感综合症——AT病研究进展(论文参考文献)
- [1]磁共振动脉自旋标记及其拓展技术在颈动脉狭窄中的应用研究[D]. 林天烨. 北京协和医学院, 2020(05)
- [2]脐血造血干细胞输注修复放射后小鼠造血系统损伤的实验研究[D]. 王晶. 锦州医科大学, 2020(05)
- [3]养殖对虾五种常见病原的MNPCR检测法的构建优化[D]. 孙卫芳. 浙江海洋大学, 2019
- [4]缺血性卒中病因学的3D高分辨磁共振管壁成像的研究[D]. 贾琳. 新疆医科大学, 2018(07)
- [5]CD19 CAR-T细胞治疗复发/难治性B-ALL后细胞因子水平变化及其临床意义[D]. 张秋叶. 安徽医科大学, 2018(08)
- [6]隐孢子虫rP23间接ELISA诊断方法及体内瞬时转染系统的构建[D]. 张国恩. 中国农业科学院, 2011(10)
- [7]刺参肠道微生态区系及致病菌防治的研究[D]. 于晶晶. 辽宁大学, 2011(06)
- [8]中华绒螯蟹螺原体重要功能基因的筛选和研究及螺原体与WSSV的多重PCR检测技术[D]. 梁廷明. 南京师范大学, 2011(06)
- [9]鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究[D]. 张进良. 华中农业大学, 2010(05)
- [10]AT细胞辐射敏感性的研究[D]. 王明明. 苏州大学, 2004(01)