一、凝血因子IX基因剔除小鼠的遗传及血液学指标检测（论文文献综述）
李杰[1]（2020）在《腺病毒介导的血友病基因治疗实验研究》文中提出目的1通过将携带有B区缺失的凝血因子FVIII（B-domain-deleted human coagulant factor VIII,BDDh FVIII）的重组腺病毒载体（Ad-BDDh FVIII-GFP）及携带人凝血因子IX（human Coagulation Factor IX,h FIX）的重组腺病毒载体（AdFIX-GFP）转染的脂肪干细胞（adipose-derived stem cell,ADSC）进行传代培养,观察h FVIII、h FIX的表达情况,探讨BDDh FVIII及h FIX是否可以在ADSC内稳定表达;2通过将BDDh FVIII经过直接途径（in-vivo）和间接途径（ex-vivo）注射入血友病A（hemophilia A,HA）鼠体内,观察h FVIII在体内表达情况,探讨ADSC是否可以作为HA基因治疗的靶细胞载体。方法1 BDDh FVIII在ADSC内的稳定表达:实验分为4组,P0组:正常ADSC;P1组:Ad-BDDh FVIII-GFP首次转染ADSC;P2组:Ad-BDDh FVIII-GFP转染ADSC细胞传代后1代;P3组:Ad-BDDh FVIII-GFP转染ADSC细胞传代后2代。2 BDDh FVIII在体内表达情况:将Ad-GFP转染的ADSC（A组）、AdBDDh FVIII-GFP转染的ADSC（B组）、Ad-BDDh FVIII-GFP（C组）及Ad-GFP（D组）,经尾静脉注射入HA鼠体内,在注射前1周、注射后第1、7、14、21、28天采集血液标本,注射后第28天采集肝脏组织标本。3 h FIX在ADSC内稳定表达:实验分为4组,A组:Ad-FIX-GFP首次转染ADSC;B组:Ad-FIXGFP转染ADSC细胞传代后1代;C组:Ad-FIX-GFP转染ADSC细胞传代后2代;D组:正常ADSC。通过逆转录聚合酶链反应（Reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR）检测ADSC内及肝脏内基因转录,酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测ADSC上清液及血浆中凝血因子抗原及免疫印迹试验（Western blot,WB）检测ADSC内及肝脏内携带凝血因子蛋白。结果1 BDDh FVIII在ADSC内的稳定表达:与P0组相比,P1组、P2组及P3组均可见到BDDh FVIII基因表达条带。h FVIII:Ag检测结果P1组（140.260±2.290ng/m L）、P2组（118.140±21.050ng/m L）、P3组（107.730±4.530ng/m L）水平高于P0组（80.02±0.21 ng/m L）,差异具有显着性（P<0.05）。h FVIII蛋白表达灰度值与P0组比较,P1组（0.630±0.070）、P2组（0.450±0.040）、P3组（0.250±0.020）明显升高,差异具有显着性（P<0.05）。2BDDh FVIII在体内表达:B组及C组血浆中均可见到h FVIII:Ag的升高,肝脏组织中BDDh FVIII基因转录及h FVIII蛋白结果显示,B组及C组结果为阳性。与A组及D组比较,差异具有显着性（P<0.05）。3 h FIX在ADSC内稳定表达:与D组相比,A、B、C组可检测到h FIX基因转录。h FIX:Ag结果显示A组（81.620±8.820ng/m L）、B组（52.496±3.246ng/m L）、C组（47.407±4.002ng/m L）明显高于D组（0.751±0.426ng/m L）,差异具有显着性（P<0.05）。h FIX蛋白表达灰度值与D组相比,A组（0.680±0.100）、B组（0.490±0.150）、C组（0.180±0.050）明显升高,差异具有显着性（P<0.05）。结论1 BDDh FVIII可以在ADSC内稳定表达,并可在HA鼠体内分泌凝血因子VIII,腺病毒介导的血友病A基因治疗在动物体内可以成功表达。2 Ad-h FIX-GFP转染后的ADSC可以稳定表达h FIX。3 ADSC可以作为血友病基因治疗的靶细胞载体。图13幅;表13个;参135篇。
王馨[2]（2019）在《腺病毒介导人凝血因子Ⅸ基因在ADSCs中的表达》文中进行了进一步梳理目的观察腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ（hFⅨ）基因在小鼠脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）中的表达情况。方法1细胞分离培养及鉴定准备4只34周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠,采用颈椎脱臼法将小鼠处死,在超净台中操作,提取位于两侧腹股沟处的脂肪组织,用1%胶原酶充分消化,获得单细胞悬液,接种在培养瓶,进行原代小鼠脂肪干细胞及传代培养。对细胞形态进行观察,用CCK-8试剂法测定细胞生长曲线,采用流式细胞术对细胞表型进行鉴定,成脂成骨诱导对细胞分化潜能进行鉴定。2细胞分组及转染选取生长旺盛的第3代ADSCs,随机分成3组:空白组:将DMEM作为对照加入ADSCs培养瓶,空载组:以空病毒Ad-GFP转染ADSCs,实验组:以重组腺病毒Ad-hFⅨ转染ADSCs。将携带hⅨ基因的腺病毒转染小鼠脂肪干细胞,将转染后的ADSCs与未转染时细胞形态及生长曲线进行对比,观察两组之间有无变化。3转染后细胞检测采用RT-PCR检测细胞中hFⅨ基因的表达情况,应用Western blot检测细胞内以及培养细胞上清液中hFⅨ蛋白的表达。采用ELISA法测定细胞上清中的hFⅨ蛋白量（FⅨ:Ag）,一期法检测培养细胞上清液中hFⅨ蛋白活性（FⅨ:C）。结果1细胞形态及生长曲线小鼠ADSCs离体培养最初几小时呈体积较小的圆球形,具有很强的折光性,贴壁生长时间为种瓶后46小时,细胞变为长梭形纤维状为种瓶后72 h,漩涡状排列;第3代ADSCs体外培养12天生长速度较缓慢,35天增殖速度增快,呈指数倍扩增,67天生长速度逐渐缓慢,总体生长趋势呈S型;2成脂成骨诱导油红O对诱导后细胞进行染色,用倒置显微镜观察,可见红色脂滴形成。茜素红对诱导后细胞进行染色,用倒置相差显微镜观察,可见橙红色钙化骨节。3流式细胞表型鉴定第3代ADSCs高表达CD29（99.91%）,CD90（99.02%）,几乎不表达CD45（0.94%）。4病毒转染取MOI=300,病毒转染后24h、48h、72h后,观察细胞表达GFP强度,发现细胞表达GFP最强时间在转染后72h,转染效率可达80%以上。观察ADSCs与未转染时形态无明显改变。5细胞mRNA的表达RT-PCR结果显示hFⅨ基因可以在小鼠脂肪干细胞内表达。6细胞内及上清中hFⅨ蛋白表达Western blot结果显示小鼠脂肪干细胞内及培养细胞上清液中均可表达hFⅨ蛋白。7转染细胞FⅨ:Ag检测ELISA测定转染ADSCs培养上清FⅨ:Ag:第1d为21.33±3.93 g/（106cells·24h）,第3d为12.63±0.86ng/（106cells·24h）,第9d为12.63±2.36 ng/106cells·24h)。8 FⅨ:C检测一期法检测培养细胞上清液中FⅨ:C为8.5%。说明腺病毒能够成功转染小鼠脂肪干细胞使其分泌hFⅨ蛋白,为后续细胞疗法治疗血友病B奠定了基础。结论1携带hFⅨ基因的腺病毒能有效转染ADSCs;2 hFⅨ基因修饰的ADSCs可以分泌具有凝血活性的hFⅨ蛋白。图10幅;表4个;参68篇。
金佩佩[3]（2015）在《遗传性FⅫ缺陷症分子机制及血小板相关疾病研究》文中进行了进一步梳理本研究收集了5个遗传性凝血因子Ⅻ（coagulation factor Ⅻ,FⅫ）缺陷症家系,并对此开展了临床表现、家系调查、实验室检测和基因诊断等方面的研究;对所发现的3个导致CRM-遗传性FⅫ缺陷症的突变位点（c.776G>A,c.799C>G,c.1561G>A）进行了突变蛋白的结构与功能研究,以探讨三个突变导致遗传性FⅫ缺陷症的分子机制。此外,本研究探讨了血小板膜蛋白GPIbβ胞内段调控GPIbα酶切的分子机制,并应用全外显子测序方法对一例难治性ITP进行了基因诊断研究。FⅫ是内源凝血系统的启动因子,遗传性FⅫ缺陷症是由编码FⅫ蛋白的基因F12突变所引起的,是一种常染色体隐性遗传性疾病,患者无临床出血表现,多在术前凝血筛查中因APTT延长而发现。本研究对发现的5个遗传性FⅫ缺陷症进行了基因诊断和分子机制研究。5个先证者FⅫ活性（FⅫ:C）和抗原（FⅫ:Ag）均明显降低,基因诊断发现了F12基因上存在3种基因突变,分别是c.776G>A（p.G259E）、c.799C>G（p.R267G）和c.1561G>A（p.E521K）,其中c.776G>A（p.G259E）、c.799C>G（p.R267G）为国际首次报道。针对发现的基因突变,构建FⅫ突变表达质粒,在体外探讨三个突变导致遗传性FⅫ缺陷症的分子机制。转染突变质粒细胞内外的FⅫ:Ag均明显下降,细胞上清中FⅫ:C也明显下降,提示三种突变是导致FⅫ缺陷的原因;Real time PCR结果显示三个FⅫ突变体均能正常转录;进一步蛋白降解抑制实验结果显示三个FⅫ突变体通过蛋白酶体进行降解是导致FⅫ表达量下降的根本原因;FⅫ突变体和野生型共转染HEK 293T细胞结果显示FⅫR267G和FⅫG259E具有dominant negative effect,然而,这种dominant negative effect的产生并不是由于FⅫ突变体和野生型形成杂合二聚体而引起的。GPIb-IX-V复合物是引起血小板活化第一步的受体蛋白,在生理止血中起着重要作用。GPIbα是GPIb-IX-V复合物中最重要的一个亚基,其酶切在血栓形成过程中起着负调控的作用,对于血小板保存及清除也至关重要。目前对于GPIb-IX-V复合物中GPIbα酶切调控机制仍不明确。我们前期研究发现的GPIbβ胞内近膜端可以通过与某个未知蛋白相互作用抑制GPIbα酶切。为明确这个未知蛋白,我们在大肠杆菌中表达并提纯野生型以及关键部位突变（R151E/R152E或R149E/L150E）的GPIbβ胞内段蛋白,利用pull-down结合蛋白质谱（MS）的方法,筛选出多种可能与GPIbβ胞内段相互作用的蛋白,包括膜突蛋白（moesin）、血小板反应蛋白（thrombospondin）等。免疫性血小板减少性紫癜（immune thrombocytopenia purpura,ITP）是一种获得性的自身抗体介导的破坏和损害血小板及其再生的血液系统疾病。临床以皮肤粘膜或内脏出血为主要表现。本研究中我们发现一例激素治疗无效的难治性ITP患者,为明确其致病因素,我们对患者外周血DNA/骨髓DNA进行了全外显子组测序,寻找仅存在于骨髓DNA而外周血DNA中为阴性的变异。经过生物信息学分析筛选出一组候选致病基因,进一步对其进行Sanger测序验证后,最终推断Ct BP2基因存在p.S240SF突变,从而导致巨核细胞成熟障碍可能是该患者血小板减少的致病原因。
张星[4]（2012）在《睾丸注射LV载体及其安全性评定》文中研究指明慢病毒（Lentivirus）是一类逆转录病毒,含有依赖于RNA的多聚酶即逆转录酶,可侵入宿主细胞内,在自身逆转录酶的作用下,以病毒RNA为模板合成cDNA,以此cDNA为模板合成双链DNA,通过病毒整合酶作用整合到宿主细胞的基因组中。以慢病毒为基础构建而成的慢病毒载体（Lentiviral vector）具有转移效率高、免疫反应小、作用范围广等优点。睾丸注射法即将病毒包装的外源DNA直接注射到雄性动物睾丸内,感染精原细胞或精原干细胞后将外源基因转染到精子,然后利用体外授精、人工授精等技术生产转基因动物的技术。该方法操作简便,但是否安全、有效,尚待验证。本试验通过分析经睾丸注射后的牛血液和精液指标,并用PCR方法检测外源DNA在睾丸内与精子整合后是否扩散到全身组织中；应用电子显微镜镜技术研究睾丸注射LV载体对牛睾丸组织的影响,旨在探讨睾丸注射法的安全性和效果,为进一步开发转基因技术奠定基础。本课题研究内容主要包括以下两个部分：：1.睾丸注射慢病毒对精液品质的影响本试验采用多点睾丸注射,注射后对实验牛多次采精,对精液进行精液常规品质检测,主要指标为密度、活力和外观色泽。将精液制成涂片,置于400倍电子显微镜下观察精子形态及密度。实验结果表明：实验组牛精液密度、活力略低于对照组牛精液,但是相差不大。在400倍电子显微镜下观察,实验组精子密度低于对照组,精子形态正常,畸形精子率低。2.血液、精液外源DNA检测本试验通过对血液常规指标分析及外源基因的PCR扩增,来确定慢病毒载体在宿主体内是否发生基因转移扩散到其他组织中。本实验室PCR方法灵敏度可达到10个拷贝数,对外源BSD基因进行扩增,对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果表明：在血液DNA及精液DNA中均未检测到外源BSD序列。3.睾丸注射慢病毒对血液生理生化指标影响血常规检测各项指标利用Microsoft Office Excel2007进行数据初步统计,并用SAS8.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）。实验结果表明：实验组与对照组血液常规检测各指标均无显着差异（p>0.05）。上述结果表明,睾丸注射慢病毒载体对牛繁殖能力及健康不会产生损害并且在宿主体内不会发生扩散,侵染其他组织。能为慢病毒载体介导RNAi技术制备转基因牛的安全性提供支持。此外本研究还可以为睾丸注射法在转基因牛的运用上提供参考。
陈剑芳[5]（2012）在《四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究及通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究》文中提出第一部分四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究目的：1.本研究采用PCR技术及DNA直接测序法对11例山西籍汉族无关血友病B（hemophilia B, HB）家系先证者的凝血因子Ⅸ （factor Ⅸ, FⅨ）基因进行了全部外显子及其侧翼序列的检测,以筛选HB患者FⅨ基因缺陷类型并探讨其分子发病机制；2.构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt,为实时观察FⅨ真核表达载体在HEK293细胞中的表达及FⅨ基因突变导致HB的分子发病机制的研究奠定实验基础；3.对三种新的FⅨ基因突变R116Stop（CGA→TGA）合并点突变A-38G（GCA→GGA）, C51G（TGT→GGT）,6479insert C进行研究,探讨基因型与表型的相关性。研究三种基因突变对FⅨ表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明HB的发病机制；4.对一种新的FⅨ基因小片段插入突变：FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变进行研究,探讨基因型与表型的相关性。研究该基因突变对FⅨ表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明HB的发病机制。方法：1.采集11例HB患者及家系成员的静脉抗凝血,提取基因组DNA; PCR方法对FⅨ基因8个外显子区域及其侧翼序列进行扩增,PCR产物胶回收后采用双脱氧链终止法在ABI3730测序仪上对PCR产物进行测序；2.用Chromas软件将测序结果与正常序列进行比对,寻找基因突变。对异常测序结果进行反向测序及重复测序以证实基因突变；对于检测到的错义突变,对100例正常对照相应区域的PCR扩增及序列测定进行基因多态性的排除分析；3.以pcDNA/FⅨwt质粒为模板,扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框（open reading frame, ORF）区,对pIRES2-ZsGreenl进行EcoR1和BamH1双酶切,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨ ORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；4.针对FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变,采用微卫星位点检测HB先证者及家系成员FⅨ基因5号外显子区域；5.采用基于PCR的定点突变技术构建携带相应突变位点的突变型真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ;定点突变产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；6.应用转染技术将野生型、突变型FⅨ表达载体分别转染HEK-293细胞,使用激光共聚焦显微镜观察转染效率；7.采用实时定量PCR检测不同位点突变对FⅨ基因mRNA表达水平的影响；8.采用ELISA方法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达量水平；9.采用一期法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达活性水平；10.采用细胞免疫荧光法检测野生型及各突变型FⅨ基因蛋白的表达水平。结果：1.通过对11例HB先证者FⅨ基因8个外显子及其侧翼序列的直接测序检测发现了11种基因突变,在11种突变类型中有8种为外显子区域的点突变,其中包括有1例为无义突变R116Stop（CGA→TGA）合并错义突变A-38G（GCA→GGA）,其余7例错义突变分别为V181A（GTT→GCT）, C336R（TGT→CGT）, C51G（TGT→GGT）, R-4Q（CGG→CAG）, A-21D（GCT→GAT）, F32S（TTT→TCT）, C361R（TGT→CGT）;1例为侧翼序列的剪切位点点突变G20566A（G→A）,1例为插入单个碱基突变：6479insert C,1例为小片段插入突变：17784位插入103bp的插入突变；2.经查询国际HB突变数据库及有关文献,证实其中有4种为首次发现：R116Stop（CGA→TGA）合并错义突变A-38G（GCA→GGA）, C51G（TGT→GGT）,6479insert C, FIX基因17784位插入103bp的插入突变为国际未报道的基因突变。100例健康成人对照样本FⅨ外显子及其侧翼序列直接基因测序结果未发现上述突变,表明上述突变不是FⅨ基因多态性；3.成功构建pIRES2-ZsGreenl/FⅨ wt,为构建FⅨ突变体并研究HB分子发病机制及实时监测FⅨ的转染效率奠定实验基础；4.针对FⅨ基因17784位插入103bp的插入突变,微卫星位点检测HB先证者及家系成员结果,先证者1和2微卫星位点检测结果可见130、180、233、283bp四个片段。先证者的外祖母、母亲、姨母微卫星位点检测结果可见130、180、233、283bp四个片段,表明该插入突变遗传自母系。先证者2的父亲为正常序列,没有出现233、283bp片段。先证者1的130bp的曲线下面积/233bp的曲线下面积比值为1.69,先证者2的130bp的曲线下面积/233bp的曲线下面积比值为0.29,显示先证者1相比先证者2的130bp片段比例高,验证了先证者1出血症状较先证者2轻的临床表现；5.成功构建R116Stop（CGA→TGA）合并点突变A-38G（GCA→GGA）, C51G（TGT→GGT）,6479insert C, FIX基因17784位插入103bp的插入突变对应的pIRES2-ZsGreenl/FⅨ突变体；6. R116Stop合并A-38G突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降（p<0.05）,一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ：Ag较野生型明显下降（p<0.05）,激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低（p<0.05）7.C51G突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降（p<0.05）,一期法及ELISA法检测细胞裂解液FIX:C及FlX:Ag较野生型无明显区别（p>0.05）,而细胞培养上清液FIX:C及FlX:Ag较野生型明显下降（p<0.05）激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型无明显降低（p>0.05）8.6479InsertC突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型明显下降（p<0.05）,一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ:Ag较野生型明显下降（p<0.05）,激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低（p<0.05）9.FⅨ基因17784位插入103bp突变的载体在HEK-293细胞中转染后,实时定量检测结果显示FIXmRNA表达量较野生型无明显下降（p>0.05）,一期法及ELISA法检测细胞裂解液及细胞培养上清液FⅨ：C及FⅨ:Ag较野生型明显下降（p<0.05）,激光共聚焦显微镜观察FⅨ表达量较野生型明显降低（p<0.05）结论：1.FⅨ基因缺陷是HB的分子发病机制,其基因缺陷具有明显异质性,各外显子及其侧翼序列均存在基因突变,其中最常见的为外显子区域的错义突变；DNA直接测序法是诊断HB及明确其分子发病机制最直接、最精确的方法之一2. R116Stop合并A-38G突变使FⅨ基因EGF-2区产生截短型蛋白,使其蛋白质活性、含量及表达量降低,影响其蛋白质功能,导致了HB的发生,其突变遗传自母系；同时提示在HB患者基因缺陷检测过程中应检测FⅨ所有外显子及其侧翼序列；3.C51G突变导致FⅨ基因EGF-1区第1个二硫键不能正确形成,从而影响了蛋白质的正确折叠和构象形成,导致EGF-1区与EGF-2区之问不能正确形成蛋白质四级结构,其所产生的突变蛋白质受细胞内质量调控体系的调节而可能存在分泌障碍和细胞内滞留并降解,导致了HB的发牛,其为白发突变；4.6479insert C突变,位于2号外显子的GLA区,引起读码框的改变,导致其编码的FⅨ蛋白在36位氨基酸出现终止密码,36位氨基酸为12个Y-羧基谷氨酸残基之一,形成截短型蛋白,使GLA区结构失去完整性,影响FIXa与F Ⅷa结合,导致HB的发生,其突变遗传自母系；5.FⅨ基因17784位插入103bp突变考虑为逆转录转座子在FⅨ基因17784位插入了87个核苷酸的5S rRNA序列,并在其前后正向重复了16个核苷酸序列。插入突变位于FⅨ123位氨基酸后,可能是引起读码框移码,在136位氨基酸处形成截短型蛋白,也可能在翻译过程中切除插入序列时出现错误导致蛋白质翻译错误。同时其不同先证者之间正常序列及异常序列比例不同,导致了不同的临床表现,其基因突变源白于母系遗传。第二部分通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究目的：1.构建真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt,为能够实时观察FⅧ真核表达载体在HEK293细胞中的表达,并为FⅧ基因突变导致HA的分子发病机制的研究奠定实验基础；2.分别在FⅧ、FIX基因的5’端、3’端及中间序列中选择发生频率高的无义突变位点（FⅧ: W14X, R1696X, K1827X, R2307X; FIX:R29X, R116X, W194X, R333X）作为研究重点,构建相应的上述FⅧ、FⅨ无义突变体,为后续观察PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用奠定试验基础；3.进行不同浓度氨基糖苷类药物庆大霉素及非氨基糖苷类小分子化合物（PTC124）药物干预,检测药物干预前后无义突变体FⅧ/FⅨ的mRNA、蛋白表达量及活性变化,为重型血友病无义突变的体外促通读作用提供实验数据。方法：1.以pcI/FⅧwt质粒为模板,扩增出目的基因FⅧ的ORF区,对pIRES2-ZsGreen1进行EcoR1和BamH1双酶切,使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅧORF扩增产物进行连接,连接产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；2.采用基于PCR的定点突变技术构建携带相应突变位点的突变型真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧ;定点突变产物进行转化后筛选阳性克隆；对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定；3.采用CCK-8（Cell Counting kit-8）法检测PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的作用48h后增殖和毒性分析,确定PTC124及氨基糖营类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用的药物浓度；4.应用转染技术将野生型、突变型FⅧ、FⅨ表达载体分别转染HEK-293细胞,使用激光共聚焦显微镜观察转染效率,并给与不同浓度氨基糖苷类药物庆大霉素及PTC124药物干预48h；5.采用实时定量PCR检测无义突变型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素干预前后mRNA表达；6.采用ELISA方法检测无义突变型FⅧ、FIX在PTC124及氨基糖营类药物庆大霉素干预前后FⅧ、FIX基因蛋白的表达量水平；7.采用一期法检测无义突变型FⅧ、FⅨ在PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素干预前后FⅧ、FⅨ基因蛋白的表达活性水平。结果：1.成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅧwt,为构建FⅧ突变体并研究HA分子发病机制及实时监测FⅧ的转染效率奠定实验基础；2.成功构建FⅧ:W14X, R1696X, K1827X, R2307X; FIX:R29X, R116X, W194X, R333X相应的上述FⅧ、FⅨ无义突变体,为后续观察PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对重型血友病无义突变的体外促通读作用奠定试验基础；3.采用CCK-8法检测PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的作用48h后增殖和毒性分析,其IC50（half maximal inhibitory concentration of a substance）值,分别为庆大霉素：4.23±0.32mM, PTC124:111.585±9.597μM。结合文献报道,据此各选取5个药物浓度进行PTC124（药物浓度为10μM,20μM,40μM,60μM,80μM）及氨基糖苷类药物庆大霉素（药物浓度为0.5mM,1.0mM,1.5mM,2.0mM,2.5mM）对重型血友病无义突变的体外促通读作用研究；4. FIX:R29X, R116X, W194X, R333X中：W194X,R333X无义突变并不影响FⅨ基因表达量,差异无统计学意义（p>0.05）；R29X,R116X在药物促通读作用后,FⅨ基因表达量有不同程度增加,差异具有统计学意义（p<0.05）。FⅧ:W14X, R1696X, K1827X,R2307X中：R1696X无义突变并不影响FⅧ基因表达量,差异无统计学意义（p>0.05）W14X, K1827X, R2307X在药物促通读作用后,FⅧ基因表达量有不同程度增加,差异具有统计学意义（p<0.05）5.野生型及各突变组分别转染HEK-293细胞后,一期法进行FⅨ:C、FⅧ:C测定。分别以野生型质粒PIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、PIRES2-ZsGreen1/FⅧwt转染细胞裂解液中的FⅨ:C、FⅧ：C为100%,促通读药物作用结果与未给药组相比较。结果表明,FⅨ:R29X, W194X,R116X,R333X在庆大霉素2.5mM和PTC-124801μM作用后,FⅨ：C与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义（p<0.05）。FⅧ:W14X, R1696X, K1827X, R2307X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅧ：C与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义（p<0.05）6.野生型及各突变组分别转染HEK-293细胞后,ELISA法检测FⅨ:Ag、FⅧ:Ag测定,分别以野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt、pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt转染细胞裂解液中的FⅨ:Ag、FⅧ:Ag为100%,促通读药物作用结果与未给药组相比较。结果表明,FIX:R29X, R116X,R333X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅨ：Ag与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义（p<0.05）；W194X在药物作用后,FⅨ：Ag与未给药组相比较差异无统计学意义（p>0.05）. FⅧ:W14X, R1696X, K1827X在庆大霉素2.5mM和PTC-12480μM作用后,FⅧ：Ag与未给药组相比较增高,差异具有统计学意义（p<0.05）；R2307X在药物作用后,FⅧ：Ag与未给药组相比较差异无统计学意义（p>0.05）结论：1.无义突变主要使FⅧ、FⅨ基因的翻译过程提前终止,产生截短型凝血因子蛋白；同时凝血因子PTC-mRNA稳定性降低,通过NMD途径使其降解,致使凝血因子含量减低,从而导致血友病发生；2.PTC124及氨基糖苷类药物庆大霉素对HEK-293细胞的毒性结果提示PTC124的Ⅰ毒性大于庆大霉素,考虑可能PTC124的溶解介质为二甲基亚砜,其细胞毒性所致；3.PTC124和庆大霉素均能够起到促通读作用使得无义突变的mRNA表达量较未给药组有不同程度的增加；同时使得无义突变体的凝血因子蛋白表达量较未给药组有不同程度的增加；其促通读作用均呈一定的剂量依赖性；4.PTC124和庆大霉素在血友病无义突变的促通读作用中具有相似的通读效率。第三部分免疫相关指标检测在原发免疫性血小板减少症的诊断及治疗中的意义目的：1.检测原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia, ITP）患者及非免疫性血小板减少症患者分泌GPⅡb/Ⅲa （glycoprotein Ⅱb/Ⅲa）抗体B细胞、血小板特异性抗体（GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ）的变化,评价其对诊断ITP及非免疫性血小板减少症的作用及临床意义；2.检测ITP患者T淋巴细胞亚群的变化,以探讨细胞免疫因素在ITP发病机制中的作用及其临床意义；3.对ITP患者进行血小板生成素（thrombopoietin, TPO）含量及网织血小板百分率（the percentage of reticulated platelet, RP%）变化的检测,同时分析二者与血小板的相关性,讨论其在ITP诊断和发病中的意义。方法：1.应用酶联免疫斑点技术（Enzyme-Linked Immunospot Assay, ELISPOT）、改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术（modified Monoclonal antibody immunobilization of platelet antigens assay, MAIPA）分别检测64例ITP患者、33例非免疫性血小板减少症患者及31例正常对照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数、血.小板特异性抗体（抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPlb/Ⅸ抗体）表达的变化,并比较检测结果；2.应用流式细胞术检测64例ITP患者及31例止常对照者T淋巴细胞亚群的比值并比较检测结果；3.应用夹心酶联免疫吸附法、流式细胞术分别检测64例ITP患者和31例正常对照血小板生成素（TPO）含量及网织血小板百分率（RP%）,同时检测其血小板计数（platelet, PLT）及骨髓巨核细胞数。结果：1.新诊断的ITP患者及持续性和慢性ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数（7.6±4.6/105个PBMC,5.3±3.0/105个PBMC）明显高于非免疫性血小板减少症患者（2.2±2.0/105个PBMC, P<0.05）及正常对照组（1.3±0.5/105个PBMC,P<0.05）,同时新诊断的ITP组患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数高于持续性和慢性ITP组患者（P<0.05）,而非免疫性血小板减少症患者及正常对照组间的差异无显着性（P>0.05）。新诊断的ITP患者及持续性和慢性ITP组患者血小板特异性抗体（抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPlb/Ⅸ抗体）的OD值（0.51±0.11、0.49±0.10；0.48±0.06、0.46±0.09、）高于非免疫性血小板减少症患者（0.37±0.07、0.39±0.11,P<0.05）及正常对照组（0.33±0.06、0.41±0.03,P<0.05）,而非免疫性血小板减少症患者及正常对照组间的差异无显着性（P>0.05）。通过ELISPOT法检测分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对ITP诊断的敏感性为68.75%,特异性为90.91%,高于改良MAIPA法的敏感性（χ2=6.25,P<0.05）。根据ROC曲线,ELISPOT区分ITP患者和非免疫性血小板减少患者的鉴别效度为0.885；2.ITP组CD3+T淋巴细胞百分比（60.88±14.59）、CD4+T淋巴细胞百分比（28.41±10.55）及CD4+/CD8+的比值（1.18±0.59）均明显低于正常对照组（69.89±6.43、35.38±5.05、1.64±0.29）（P<0.05）,CD8+T淋巴细胞（27.09±9.86）则显着高于正常对照（22.08±4.54）（P<0.05）；3.ITP患者巨核细胞增多组和正常对照组TPO水平明显低于ITP患者巨核细胞正常组差异有显着性（P<0.05）,而二者之间差异无显着性（P>0.05）。ITP组RP比值明显高于对照组差异有显着性（P<0.05）。经相关分析发现,ITP组患者RP%及TPO与血小板数目呈负相关。结论：1.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞相比MAIPA法检测ITP患者血小板特异性抗体具有更高敏感性及特异性,可提高ITP的实验室诊断水平,对指导临床治疗有一定的临床意义；2.应用ELISPOT方法检测ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞对区分新诊断的及持续性和慢性ITP具有一定意义；3.T淋巴细胞亚群比例失衡和功能的紊乱参与了ITP的发病过程：调节T淋巴细胞亚群的失衡是治疗的一个新方向；4.TPO检测对探讨血小板生成的机制及辅助ITP的诊断有一定意义,可根据TPO检测结果,为ITP患者应用促血小板生成的TPO模拟物的治疗提供相应的理论依据；5.RP可作为ITP患者治疗中血小板恢复的参考指标,同时其对于鉴别血小板减少性疾病具有重要的临床意义。
王栋[6]（2012）在《小鼠B6品系自发突变白斑的遗传学研究》文中提出小鼠有多种毛色，白色（albino）、黑色（black）、鼠灰色（agouti）、黄色（yellow）、白斑（piebeld）等，关于这些毛色多样性的研究已有一个多世纪，事实证明这些毛色多样的小鼠为遗传学和胚胎发育学的发展起到了很大作用，并为一些重大科学发现提供了极有价值的研究工具。白斑突变小鼠由于其表型及突变分子机制与人类某些色素沉着紊乱疾病，比如斑驳病（Piebaldism）、瓦登伯格综合症（Waardenburg Syndrome）等相似，因而成为研究这些疾病的理想实验动物模型。本实验室白斑突变小鼠为B6遗传背景自发突变，传代试验证实该突变性状稳定且能够遗传。本研究通过交配测试试验确立了该突变性状的遗传模式，并对突变纯合子进行筛选和观察，同时对突变基因进行了定位，确定了候选基因kit，通过对kit基因克隆测序找到了碱基突变位点，从而成功从分子水平上鉴定了白斑突变发生机制，加深了对该突变小鼠的认识，为kit基因及人类斑驳病的研究提供了一种新的材料。本论文由以下几部分组成：1、白斑突变遗传模式的确立白斑突变杂合子与正常表型B6小鼠交配，获得G1代小鼠146只，通过统计G1代小鼠中突变型与正常型小鼠数目，并将其与单基因染色体遗传模式理论值进行卡方检验，最终确定突变性状的遗传模式为单基因染色体遗传。2、白斑突变纯合子筛选和观察白斑突变杂合子互交繁殖，获得16胎后代，共72只小鼠。在这些子代小鼠中除了正常B6小鼠黑色毛色表型和突变杂合子白斑表型外，未出现新表型或白斑区域显着扩大的表型。通过交配试验证实这些后代小鼠无纯合子，推测纯合子因突变基因纯合致死，观察并初步确定是在出生后1-2日龄因贫血死亡。3、白斑突变基因的定位克隆选用﹛（B6×PWK）F1×PWK﹜N2小鼠60只，提取每只小鼠DNA，逐个用38对微卫星引物扩增，分析微卫星标记与突变表型间的关系（连锁或重组），并通过计算“优势对数值（LODS）”方法将突变基因定位于小鼠第五号染色体上。繁殖扩大N2样本数量216只，选择第5号染色体42cM附近两个微卫星标记D5Mit304（41.0cM）和D5Mit359（44.0cM）进行精细定位，通过计算各微卫星标记与突变基因的重组率，根据三点测试原理将白斑突变基因定位于D5Mit304和D5Mit359之间42.20cM。对定位部位及定位置信区间内的基因逐个进行功能分析，确定候选基因kit，通过对其cDNA克隆测序，结果显示突变白斑小鼠kit基因cDNA序列第2576位碱基由G→A，导致kit基因编码区第822位密码子由GGG→AGG，甘氨酸（G）变为精氨酸（R）。
顾东生[7]（2009）在《靶向肝脏基因组位点特异性整合治疗血友病B的初步研究》文中认为第一部分靶向肝脏基因组位点特异性整合治疗血友病B的初步研究研究背景和目的：血友病B是一种由于凝血因子Ⅸ缺乏导致的严重出血性疾病,为X染色体连锁隐性遗传。主要临床表现是不可预测的、反复自发性软组织及大关节出血。临床上乙型血友病的严重程度与循环中FIX （coagulation factor IX）的水平相关。目前的替代疗法已经在很大程度上降低了出血发生的频率以及继发的关节疾病,并大大的提高了血友病病人的生存期。但是血浆浓缩FIX可能引起传染性疾病,而纯化FIX所需费用巨大。血友病B是很好的基因治疗研究模型。一般来说,hFIX （human FIX）基因可以通过病毒或非病毒载体进行输送。近年来,非病毒载体的研究越来越受到重视。噬菌体整合酶phiC31可以在哺乳动物细胞内发挥作用,被应用与基因工程包括基因治疗的研究。在哺乳动物细胞,这种酶介导带有attB位点的质粒整合入宿主基因组中的假attP位点。Aneja及其同事发现外来质粒与整合酶编码质粒共注射才能实现外源基因在肺脏持续表达,而单独注射外来质粒则不能。本研究的主要目的是通过高压尾静脉注射把携带attB和hFIX的质粒与表达phiC31的质粒共同导入肝脏细胞,检测目的质粒能否整合入小鼠基因组并持续表达。方法：首先构建表达hFIX并携带attB核心序列的真核表达载体attB-hFIX-pIRES2-EGFP并在体外验证该载体能否表达目的基因。然后用高压尾静脉注射的方法将该载体与表达phiC31的质粒CMV-int共注射血友病B小鼠,attB-hFIX-pIRES2-EGFP单独注射为对照。用ELISA的方法检测hFIX在其体内的表达；用出血时间评价血友病小鼠出血症状是否改善；用巢式PCR检测attB-hFIX-pIRES2-EGFP是否整合到基因组的整合热点mpsLl（mouse pseudo-site from liver 1）位点。结果：经鉴定,attB-hFIX-pIRES2-EGFP载体构建成功,并在体外表达hFIX。高压尾静脉注射血友病B小鼠后24小时,hFIX血清水平达到最高值,为正常水平的30%,此时小鼠的出血症状明显改善。但是不论是否与CMV-int共注射,此后hFIX水平迅速下降,在注射后10天内降到本底水平。巢式PCR的结果证实,attB-hFIX-pIRES2-EGFP整合到了小鼠肝脏基因组的mpsL1位点。结论：phiC31可以将34bp的attB最短序列整合到小鼠基因组的整合热点mpsL1;由CMV启动hFIX的能够瞬间高表达并有效改善血友病小鼠的出血症状；但是外来DNA进入细胞后,无论是否整合到基因组均被迅速沉默,说明肺脏和肝脏对整合入基因组的CMV启动子表达调控的机制不尽相同,因此对用于基因治疗的裸DNA进行改进使其适合在靶器官表达是十分必要的。第二部分一种新的用于血友病B基因治疗的腺病毒-整合酶嵌合系统的构建及其体外表达鉴定研究背景和目的：目前用于血友病基因治疗的载体主要分为两大类：病毒载体和非病毒载体。这两类载体各有优缺点。病毒载体基因传递的效率高,但容易产生免疫反应和插入突变；非病毒载体制备简单,安全性好,但是基因转导的效率低。因此我们试图构建一种即可高效感染靶细胞又能实现安全定点整合入宿主基因组的腺病毒嵌合载体。方法：通过一系列DNA操作构建腺病毒-整合酶嵌合系统。该系统包含两个腺病毒载体：一个携带转基因表达框,表达框内有hFIX,红色荧光蛋白编码序列以及attB （phiC31识别位点）,表达框两侧各有一个loxp （Cre识别位点）。另一个腺病毒载体携带Cre和phiC31基因。同时构建只表达Cre和只表达phiC31的载体作为对照载体。在体外分别用脂质体转染293A细胞,用荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,用RT-PCR鉴定各个基因的表达。结果：经PCR,酶切及测序方法鉴定,该腺病毒-整合酶嵌合系统构建成功。体外分别用脂质体转染293A细胞后,可见绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白表达。经RT-PCR鉴定,该系统能够成功表达各种目的蛋白。结论：经初步鉴定,我们的腺病毒-整合酶嵌合系统构建成功,为进一步研究其治疗作用打下良好基础。第三部分Th1 （CXCL10）和Th2 （CCL2）趋化因子在原发性免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义的初步研究研究背景：原发性免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia primary,ITP）是一种以血小板破坏加速为主的器官特异性自身免疫性疾病,具体发病机制未完全清楚。Th1/Th2极化失衡在ITP的发病机制中起了非常重要的作用。Th1趋化因子CXCL10和Th2趋化因子CCL2在其他自身免疫性疾病的发病机制中发挥一定的作用,但在ITP中是否发挥作用仍然未知。目的：明确CXCL10, CCL2以及它们的受体CXCR3, CCR4和CCR2在ITP中的表达情况,对这些因子在ITP发病机制中的作用进行初步研究。方法：用ELISA方法检测49份ITP病人以及24份正常人的血浆标本中CXCL10和CCL2的浓度。用实时定量PCR的方法检测趋化因子及其受体在24例正常人和28例活动期ITP患者外周血单个核细胞以及9例ITP患者的脾细胞中的表达。用实时定量PCR的方法检测10例ITP患者和10例正常人CD4+细胞中CCR4和CXCR3的表达。结果：活动期ITP患者血浆样品中CXCL10的水平与正常人相比显着升高（p=0.007）,缓解ITP患者降至正常水平。CCL2的水平在活动组,缓解组和正常组没有统计学差异。与正常对照相比,活动期患者外周血单个核细胞的CXCL10 mRNA水平显着升高（p=0.031）,但CCR2的mRNA水平显着降低（p=0.005）。ITP患者外周血小板计数与CXCL10的水平及CXCL10/CCL2比值呈负相关。结论：活动期ITP患者的血浆CXCL10水平和CXCL10/CCL2比值与正常人相比显着升高,CXCL10可能在ITP的发病机制中发挥一定的作用。
朱顺星,孙丽,刘春,邵义祥[8]（2009）在《遗传性角膜病小鼠生物学特性观察》文中提出目的:研究通过ENU诱变手段获得的遗传性角膜病小鼠B6-Co的生物学特性。方法:观察比较遗传性角膜病小鼠与正常B6小鼠的繁殖学指标、生长发育参数,B6-Co不同表型间脏器重量、脏器指数、血常规、尿常规以及行为学方面的异同。结果:B6-Co小鼠不育率22%、平均产仔数5.62±2.55只、离乳成活率56.59±41.22显着低于正常的B6小鼠,而胎间隔29.50±10.50天比正常B6小鼠短。B6-Co小鼠出生后2周内生长发育与正常B6小鼠基本一致,2周后,其生长发育慢于正常B6小鼠。B6-Co小鼠雌雄间的眼球、肺、胸腺、肾上腺的脏器指数差异有统计学意义。B6-Co表型异常小鼠与B6-Co表型正常小鼠相比,肺、肾上腺、子宫、睾丸的脏器系数差异有统计学意义。B6-Co小鼠表型异常小鼠在血红蛋白和红细胞数量上异于B6-Co表型正常小鼠。平衡木的成绩得分:B6-Co表型正常小鼠3.50±0.69、B6-Co单眼小鼠2.17±0.78、B6-Co双眼小鼠1.87±0.80依次降低,且与角膜病变的程度呈负相关。在抓绳和筑巢实验中,三组成绩差异无统计学意义。结论:由于基因突变导致遗传性角膜病小鼠的繁殖性能下降,生长发育受到影响。B6-Co小鼠各表型间脏器系数有差异,血常规的多项指标有差异。B6-Co表型异常小鼠运动协调能力、探索能力受到一定的影响。
陈懿建[9]（2008）在《脂联素对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响及机制研究》文中研究表明研究背景脂联素（adiponectin,Adp）作为一种脂肪源性的细胞因子,具有改善胰岛素敏感性、保护内皮细胞功能、抗炎、抗动脉粥样硬化的作用。流行病学研究显示脂联素水平与胰岛素抵抗及血栓性疾病发病呈负相关。脂联素可以抑制单核细胞黏附分子及炎症因子的表达、抑制巨噬细胞转化为泡沫细胞、抑制血管平滑肌细胞增殖及迁移,还可以增加内皮细胞一氧化氮产生及减少氧自由基的产生。脂联素可通过胰岛素增敏、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗增殖和抗氧化等多重机制来保护内皮细胞功能。由于血栓性疾病与凝血系统活性密切相关,而内皮细胞功能障碍可以引起凝血活性异常。但是对于脂联素对凝血系统活性有无影响,目前仍不清楚。组织因子（tissue factor,TF）是凝血系统启动的关键因子,TF介导的凝血激活在动脉粥样硬化、冠心病等血栓形成性疾病的发病中起了非常重要的作用。组织因子途径抑制物（tissue factorpathway inhibitor,TFPI）是TF直接的生理性抑制物,在调节血栓形成过程中有重要作用。然而,脂联素对内皮细胞的保护作用是否会影响在血栓形成过程中有重要作用的凝血因子TF及TFPI的表达,国内外尚无文献报道。因此研究脂联素对凝血活性的影响有着重要的意义,可以进一步阐明血栓形成的部分机制,并能为防治血栓形成提供重要的理论依据。正是基于上述原因,本研究对脂联素对内皮细胞TF及TFPI表达的影响及机制进行探讨。本研究由以下三部分组成:第一章TNF-α对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响目的:观察在肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激下对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达TF及TFPI的影响。方法:HUVECs培养采用RPMI 1640完全培养基;台盼蓝染色法观察细胞活力;酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunoabsordent assay,ELISA）法测定TF抗原和TFPI抗原的表达;逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测TF及TFPI基因的表达。结果:各浓度的TNF-α对HUVECs的细胞活力无明显影响;TNF-α促进TF抗原的表达,并呈剂量和时间依赖关系,在TNF-α10 ng╱ml作用6h时最明显（p＜0.01）;TNF-α促进TF mRNA的表达,并呈剂量和时间依赖关系,在TNF-α10ng╱ml作用3h时已非常明显（p＜0.01）,6h时达到高峰（p＜0.01）;TNF-α对HUVECs表达TFPI抗原及TFPI mRNA无明显影响。结论:TNF-α可以诱导HUVECs细胞表达TF;TNF-α对HUVEC细胞TFPI的表达无明显影响。第二章脂联素对TNF-α诱导内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响目的:观察脂联素对TNF-α诱导HUVECs细胞表达TF和TFPI的影响。方法:HUVECs培养采用RPMI 1640完全培养基;台盼蓝染色法观察细胞活力;ELISA法测定TF抗原和TFPI抗原的表达;发色底物法测定TF及TFPI活性;RT-PCR检测TF mRNA及TFPI mRNA的表达。结果:各浓度的脂联素对HUVECs的细胞活力无明显影响;脂联素可以在转录水平、蛋白水平上抑制由TNF-α诱导的人脐静脉血管内皮细胞TF的表达（p＜0.01）,同时TF活性水平也明显减低（p＜0.01）;单纯脂联素对内皮细胞表达TF表达无影响;脂联素可以上调TFPI的抗原水平及活性水平（p＜0.01）,但脂联素不影响TFPI mRNA的表达水平。结论:脂联素可以在转录及蛋白水平上明显抑制TNF-α诱导HUVECs细胞TF的表达;脂联素上调TFPI抗原表达可能是在转录后水平进行的。第三章脂联素调节内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的机制研究目的:前文已经报道脂联素能抑制TNF-α诱导的HUVECs表达TF,并能在转录后水平上调TFPI的表达。本实验详细探讨脂联素抑制TNF-α诱导的HUVECs表达TF及上调TFPI表达的信号传导通路。方法:HUVECs培养采用RPMI 1640完全培养基;台盼蓝染色法观察细胞活力;ELISA法测定TF抗原和TFPI抗原的表达;发色底物法测定TF及TFPI活性;ELISA法检测NF-κB结合活性;酶免疫分析（enzyme immunoassay,EIA）法检测cAMP含量;PepTag法分析PKA活性水平;蛋白印迹（western blot）法检测p38MAPK、p44/42MAPK、SAPK/JNK、Akt、IκB-α的蛋白磷酸化水平。结果:脂联素使IκB-α磷酸化水平减少,但对p38MAPK、p44/42MAPK及SAPK/JNK的磷酸化水平无影响;脂联素呈剂量依赖性的增加cAMP含量和PKA活性水平;脂联素抑制TNF-α诱导的TF表达可以被PKA的特异性抑制剂Rp-cAMPs逆转,并不影响脂联素上调TFPI抗原的水平;脂联素使Akt的磷酸化水平增加;脂联素可明显抑制TNF-α诱导的IκB-α的磷酸化水平及NF-κB结合活性水平;PI3K的特异性抑制剂LY294002也能部分逆转脂联素对TF表达的抑制作用,预先联合Rp-cAMPs和LY294002处理细胞能使脂联素的抑制作用被逆转约95%,脂联素对TFPI抗原的上调作用不被这两种抑制剂影响。结论:PI3K-Akt和cAMP-PKA信号途径的活化介导了脂联素抑制TNF-α诱导内皮细胞表达TF的作用;NF-κB信号途径活性受抑在脂联素抑制TNF-α诱导的内皮细胞表达TF起了非常重要的作用;PI3K-Akt和cAMP-PKA是NF-κB上游重要的信号通路。
郑昌成[10]（2008）在《遗传性易栓症的基础与临床研究》文中研究指明背景近年来,血栓性疾病如缺血性心脑血管病、静脉血栓栓塞症（Venous thromboembolism,VTE）等在年轻患者中的发病率逐年升高。研究表明,血栓的发生除了与获得性危险因素如手术、骨折、肿瘤等有关外,遗传性抗凝蛋白缺陷如蛋白C （PC）、蛋白S（PS）或抗凝血酶（AT）缺陷等与血栓形成具有密切的关系。FV Leiden导致的血浆活化蛋白C抵抗（APCR）和凝血酶原G20210A突变已被证实是西方人群血栓性疾病最为相关的危险因素。然而,我国APCR的发病率并不像国外那样高,且FV Leiden和凝血酶原G20210A突变罕见。为了进一步研究国内血栓性疾病发生的病因及高危因素,探讨抗凝蛋白缺陷在其发生中的作用,我们对85例“原因不明”（即排除可能存在的获得性因素）的血栓性疾病患者和50例健康对照者的蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗凝血酶（AT）活性水平进行了检测和分析。遗传性蛋白C （protein C, PC）缺陷症是VTE的主要遗传性危险因素之一,特点主要表现为自幼反复发生动静脉血栓,属常染色体显性遗传病,多数伴有血栓家族史。迄今我国尚缺乏PC缺陷症的大规模人群调查研究,仅有个案报道。本研究发现一个遗传性PC缺陷症家系,通过分子生物学研究发现了新的PC基因杂合错义突变和杂合缺失突变。目的1.探讨蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、和抗凝血酶（AT）活性水平在中国人“原因不明”血栓性疾病患者中的发生情况并评价其引起血栓的危险性。2.对一例静脉血栓患者进行临床诊断、家系调查及表型研究,并对该遗传性PC缺陷症患者及家系成员的PC基因进行测序分析,分析遗传规律,对其分子发病机制进行初步研究。方法PC活性（PC:A）、蛋白S活性（PS:A）和抗凝血酶活性（AT:A）采用发色底物法测定;PC抗原（PC:Ag）采用ELISA法检测。检测85例血栓性疾病患者与50例正常健康对照者血浆PC、PS、AT活性水平并作比较分析。所有实验结果以均数±标准差（χ±s）表示,组间样本资料采用t检验;危险度采用多变量logistic回归分析;P<0.05具有统计学差异。对一例先证者及家系成员PC基因的9个外显子序列PCR扩增,PCR产物回收、纯化后进行测序,用Chromas软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的序列进行比较（Blaster）,寻找基因突变。结果1)85例血栓性疾病患者中位年龄43岁（1769岁）,其中≤45岁60例（70.6%）,>4550岁20例（23.5%）,50岁以上5例（5.9%）;男性50例,女性35例,男女比例为1.4:1。动脉血栓组18例（男性10例,女性8例）,中位年龄40岁;静脉血栓组67例（男性40例,女性27例）,中位年龄45岁。抗凝蛋白活性水平比较发现:动脉血栓组和静脉血栓组PC、PS、AT活性均明显低于正常对照组（P<0.001）;再发组PC、PS、AT平均活性低于初发组（P<0.01）;年龄≤45岁组患者PC、PS、AT平均活性低于45岁以上组（P<0.01）。动脉血栓组PC、PS、AT平均活性稍高于静脉血栓组,血栓复发组抗凝蛋白平均活性稍高于多发组,但不具有统计学意义（P>0.05, P>0.05）。共有26例患者存在抗凝蛋白缺陷（占30.6%）:PC缺陷7例（8.2%）,PS缺陷9例（10.6%）,AT缺陷5例（5.9%）,复合缺陷5例（PS合并AT缺乏4例,PC合并AT缺乏1例）（5.9%）。抗凝蛋白缺陷组血栓发生的相对危险性明显增加（OR=10.67,95%CI为4.2327.56）。其中PS缺陷发生血栓的危险度最高。2)先证者PC:Ag和PC:A分别为1.4和34%,表现为I型PC缺陷症;其姐姐及其儿子PC:A分别为52%和53%,其女儿PC:A为84%（正常范围70130%）。基因分析发现PC基因第9外显子区G12622T杂合错义突变,导致Val （GTG） 274 Leu （TTG）;同时发现第9外显子区存在13010 13012或13013 13015位TCC （ L404）杂合缺失。先证者儿子也存在上述2种突变。家系成员（I 2、II 1、II 2）在第1外显子及侧翼区第2 405位、2 583位分别存在G/C、A/T多态性。结论1)抗凝蛋白缺陷是中国血栓患者最常见的遗传性易患因素。中国人“原因不明”的血栓性疾病患者普遍存在抗凝蛋白水平低下,抗凝蛋白缺陷不仅与血栓性疾病的发生有关,而且与血栓复发密切相关。2)该家系为I型遗传性PC缺陷症。PC基因第9外显子G12622T杂合错义突变,及13010 13012或13013 13015位TCC杂合缺失,导致蛋白质合成过程中第274位Val被Leu替代,以及第404位Leu缺失。上述2种突变是目前尚未报道的新的基因突变。
二、凝血因子IX基因剔除小鼠的遗传及血液学指标检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凝血因子IX基因剔除小鼠的遗传及血液学指标检测（论文提纲范文）
（1）腺病毒介导的血友病基因治疗实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 重组腺病毒载体 |
| 1.1.3 .细胞系与细胞株 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要仪器与设备 |
| 1.1.6 主要溶液配制 |
| 1.1.7 ADSC的提取及培养 |
| 1.1.8 ADSC的冻存 |
| 1.1.9 BDDh FVIII在 ADSC内的稳定表达 |
| 1.1.10 BDDh FVIII在血友病A鼠体内表达情况 |
| 1.1.11 Ad-h FIX-GFP转染ADSC后凝血因子稳定表达 |
| 1.1.12 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 ADSC复苏后状态观察 |
| 1.2.2 Ad-BDDh FVIII-GFP转染ADSC及转染后传代荧光图 |
| 1.2.3 转染后ADSC的成骨诱导检测 |
| 1.2.4 RT-PCR检测转染后ADSC传代后BDDh FVIII基因表达 |
| 1.2.5 Western blot检测转染后细胞及传代后h FVIII表达 |
| 1.2.6 ELISA检测转染后细胞及传代后h FVIII:Ag表达 |
| 1.2.7 ELISA检测血友病A鼠血浆中h FVIII:Ag水平 |
| 1.2.8 RT-PCR检测肝脏BDDh FVIII基因表达 |
| 1.2.9 Western blot检测肝脏h FVIII蛋白表达 |
| 1.2.10 Ad-h FIX-GFP转染小鼠ADSC及转染后传代荧光图 |
| 1.2.11 RT-PCR检测转染后ADSC传代后h FIX基因表达 |
| 1.2.12 Western blot检测转染后细胞及传代后h FIX蛋白表达 |
| 1.2.13 ELISA检测转染后细胞及传代后h FIX:Ag表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 血友病小鼠模型的初次构建 |
| 2.2 血友病小鼠模型特点的研究 |
| 2.3 血友病小鼠模型的改进 |
| 2.4 锌指核酸酶技术构建血友病鼠模型 |
| 2.5 CRISPR/Cas系统构建血友病鼠模型 |
| 2.6 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（2）腺病毒介导人凝血因子Ⅸ基因在ADSCs中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 实验研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 重组腺病毒 |
| 1.1.3 实验分组 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂 |
| 1.1.6 实验试剂配制 |
| 1.1.7 ADSCs的分离培养与鉴定 |
| 1.1.8 携带hFⅨ基因的腺病毒转染ADSCs |
| 1.1.9 RT-PCR检测转染后ADSCs hFⅨ mRNA的表达 |
| 1.1.10 Western blot技术检测细胞中hFⅨ蛋白表达 |
| 1.1.11 Western blot技术检测细胞上清hFⅨ蛋白表达 |
| 1.1.12 ELISA法测定细胞上清FⅨ:Ag |
| 1.1.13 一期法测定细胞上清FⅨ：C |
| 1.1.14 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 ADSCs的分离培养与鉴定 |
| 1.2.2 携带hFⅨ腺病毒转染ADSCs |
| 1.2.3 细胞中hFⅨ mRNA的表达 |
| 1.2.4 细胞内hFⅨ蛋白的表达 |
| 1.2.5 细胞上清hFⅨ蛋白的表达 |
| 1.2.6 细胞上清中FⅨ:Ag |
| 1.2.7 细胞上清FⅨ：C |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 血友病B基因治疗的研究进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 血友病B的药物替代治疗 |
| 2.3 血友病B的基因治疗 |
| 2.4 血友病B的基因治疗临床试验研究 |
| 2.4.1 基因治疗临床前期试验研究 |
| 2.4.2 基因治疗的临床试验研究 |
| 2.4.3 基因治疗载体 |
| 2.4.4 基因治疗最新研究进展 |
| 2.5 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（3）遗传性FⅫ缺陷症分子机制及血小板相关疾病研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症基因突变的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 遗传性FⅫ缺陷症患者及家系成员凝血象检测 |
| 1.1.2 酶联免疫法检测FⅫ抗原（FⅫ:Ag） |
| 1.1.3 遗传性FⅫ缺陷症家系F12基因突变分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 家系1基因分析结果 |
| 1.2.2 家系2基因分析结果 |
| 1.2.3 家系3基因分析结果 |
| 1.2.4 家系4基因分析结果 |
| 1.2.5 家系5基因分析结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 3种F12基因突变引起FⅫ缺陷症的分子机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 突变表达质粒的构建 |
| 2.1.2 细胞培养 |
| 2.1.3 细胞转染 |
| 2.1.4 转染细胞内外FⅫ抗原、活性的检测 |
| 2.1.5 转染细胞培养上清液和细胞裂解液FⅫ蛋白的Western Blot检测 |
| 2.1.6 Real-time定量PCR |
| 2.1.7 蛋白降解抑制试验 |
| 2.1.8 突变载体与正常基因表达载体共转染实验 |
| 2.1.9 p IRES2-FⅫ-HIS/p IRES2-FⅫ-HA免疫共沉淀实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.2 转染细胞内、外FⅫ抗原的测定 |
| 2.2.3 转染细胞培养上清液FⅫ蛋白的Western Blot检测结果 |
| 2.2.4 Real-time定量PCR |
| 2.2.5 蛋白降解抑制试验 |
| 2.2.6 突变载体与正常基因表达载体共转染实验 |
| 2.2.7 p IRES2-FⅫ-HIS/p IRES2-FⅫ-HA免疫共沉淀实验 |
| 2.3 讨论 |
| 第三部分 血小板膜蛋白GPIbβ 胞内段调控GPIbα 酶切的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 GST-GPIbβcp、GST-GPIbβcp和HIS-GST融合蛋白的表达 |
| 3.2.3 GST-GPIbβcp、GST-GPIbβcp和HIS-GST融合蛋白的纯化 |
| 3.2.4 HIS Pull-down实验 |
| 3.2.5 质谱 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3.2 蛋白表达与纯化 |
| 3.3.3 HIS Pull-down结合质谱法对与GPIbβ 胞内段可能相互作用的蛋白进行筛选 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 免疫性血小板减少性紫癜基因诊断研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 骨髓基因组DNA标本提取 |
| 4.2.3 Agilent Sureselect方法制备测序文库 |
| 4.2.4 Illumina Hiseq2000测序 |
| 4.2.5 测序数据分析 |
| 4.2.6 测序数据结果解释 |
| 4.2.7 Sanger测序验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 难治性ITP患者全外显子组测序及数据质量评估 |
| 4.3.2 难治性ITP患者全外显子组检测候选致病基因 |
| 4.3.3 难治性ITP患者新致病基因CTBP2的鉴定 |
| 4.3.4 CTBP2基因突变p.S240F蛋白预测功能分析 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及研究成果 |
（4）睾丸注射LV载体及其安全性评定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要的仪器设备 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 转基因动物制备方法的研究进展 |
| 1.1 转基因技术研究概述 |
| 1.1.1 DNA显微注射法 |
| 1.1.2 逆转录病毒载体法 |
| 1.1.3 体细胞核移植法 |
| 1.1.4 胚胎干细胞介导法 |
| 1.1.5 精子载体法 |
| 1.2 生精细胞法介导基因转移研究进展 |
| 1.2.1 精子介导基因转移的基本原理 |
| 1.2.2 生精细胞法研究进展 |
| 第二章 牛的转基因研究现状 |
| 2.1 转基因牛的研究进展 |
| 2.2 RNAi技术在转基因牛的研究 |
| 2.3 转基因动物安全性及检测方法 |
| 2.4 研究目的和意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一、睾丸注射慢病毒载体对公牛精液品质的影响 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 实验牛群 |
| 1.1.2 慢病毒颗粒 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验分组 |
| 1.2.2 公牛睾丸注射慢病毒 |
| 1.2.3 精液常规品质检查 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 注射后对精液品质的影响 |
| 1.3.2 精子形态显微镜观察 |
| 1.4 讨论 |
| 试验二、血液、精液外源DNA扩增及血液生理生化指标的检测 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 慢病毒颗粒 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要酶、试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 其他溶液的配制 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验分组 |
| 1.2.2 公牛睾丸注射慢病毒 |
| 1.2.3 血样的采集与血常规检测 |
| 1.2.4 血液DNA的提取与检测 |
| 1.2.5 假阴道法人工采精 |
| 1.2.6 精液DNA的提取及检测 |
| 1.2.7 外源BSD基因的扩增 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 血常规检测指标结果 |
| 1.3.2 外源基因扩增结果 |
| 1.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究及通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一部分 四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究 |
| 前言 |
| 第一章 应用DNA直接测序法对血友病B患者进行基因诊断 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨwt的构建及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 三种新的基因突变导致血友病B的分子发病机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 一种新的小片段插入突变导致血友病B的分子发病机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第一部分 参考文献 |
| 第二部分 通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究 |
| 前言 |
| 第一章 真核表达载体pIRES2-ZsGreenl/FⅧwt的构建及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 凝血因子Ⅷ、Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 参考文献 |
| 第三部分 免疫相关指标检测在原发免疫性血小板减少症的诊断及治疗中的意义 |
| 前言 |
| 第一章 ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞及血小板特异性抗体的检测和意义探讨 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 ITP患者T淋巴细胞亚群的检测和意义探讨 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 ITP患者血小板生成素及网织血小板检测的临床意义探讨 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）小鼠B6品系自发突变白斑的遗传学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小鼠遗传学研究概况 |
| 1.1.1 小鼠“经典遗传学研究” |
| 1.1.2 小鼠“反向遗传学”及基因组改造手段研究 |
| 1.2 小鼠毛色遗传学研究 |
| 1.2.1 小鼠毛色研究历史和现状 |
| 1.2.2 小鼠毛色基因及其功能 |
| 1.2.3 白斑小鼠研究概况 |
| 1.2.4 kit 基因突变白斑小鼠 |
| 1.2.5 kit 基因突变与人类色素沉着紊乱疾病 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验小鼠 |
| 3.1.2 主要仪器及设备 |
| 3.1.3 实验所用主要试剂及配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 B6 自发突变白斑遗传模式的确立 |
| 3.2.2 白斑突变纯合子的筛选与观察 |
| 3.2.3 N_2小鼠的繁殖及样品的准备 |
| 3.2.4 微卫星定位标记体系的建立 |
| 3.2.5 白斑突变基因的初步定位 |
| 3.2.5.1 小鼠尾部组织 DNA 的提取 |
| 3.2.5.2 PCR 扩增及产物电泳检测 |
| 3.2.6 白斑突变基因的精细定位 |
| 3.2.7 候选基因的确立及鉴定 |
| 3.2.7.1 RNA 提取及 cDNA 合成 |
| 3.2.7.2 引物合成及 PCR 反应 |
| 3.2.7.3 PCR 产物回收和纯化 |
| 3.2.7.4 回收产物与 pGEM-T Easy 载体连接 |
| 3.2.7.5 感受态细胞的制备及转化 |
| 3.2.7.6 测序鉴定突变位点 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 突变白斑遗传模式及纯合子筛选 |
| 4.1.1 突变白斑性状遗传模式 |
| 4.1.2 白斑突变纯合子筛选与观察 |
| 4.1.3 繁殖 F_1、N_2小鼠部分表型分析 |
| 4.2 微卫星标记的筛选 |
| 4.3 白斑突变基因的初步定位结果及分析 |
| 4.4 白斑突变基因精细定位结果及分析 |
| 4.5 候选基因确定 |
| 4.6 小鼠脑组织总 RNA 提取结果 |
| 4.7 kit 基因 RT-PCR 扩增结果 |
| 4.8 kit 基因克隆测序鉴定结果 |
| 4.9 预测 KIT 蛋白质二级结构水平变化 |
| 5 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 突变基因定位方法及策略 |
| 5.1.2 小鼠显性白斑 W 位点自发突变 |
| 5.1.3 kit 基因结构与功能 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
（7）靶向肝脏基因组位点特异性整合治疗血友病B的初步研究（论文提纲范文）
| 第一部分 靶向肝脏基因组位点特异性整合治疗血友病B的初步研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与试剂 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 一种新的用于血友病B基因治疗的腺病毒-整合酶嵌合系统的构建及其体外表达鉴定 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与试剂 |
| 试验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Th1(CXCL10)和Th2(CCL2)趋化因子在原发性免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义的初步研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与试剂 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 血友病基因治疗的研究进展 |
| 附录 常见英文缩写 |
| 研究生在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）遗传性角膜病小鼠生物学特性观察（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 饲养条件 |
| 1.3 繁殖性能和生长发育的观察 |
| 1.3.1 繁殖性能的观察 |
| 1.3.2 生长发育的观察 |
| 1.4 脏器重量和脏器指数的测定 |
| 1.5 血常规和尿常规 |
| 1.6 行为学测试 |
| 1.6.1 行为学实验程序[3-4] |
| 1.6.2 抓绳 |
| 1.6.3 平衡木 |
| 1.6.4 筑巢 |
| 1.7 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 繁殖性能 |
| 2.2 生长发育 |
| 2.3 脏器重量和脏器指数 |
| 2.3.1 雌、雄B6-Co小鼠脏器重量和脏器指数之间的比较 |
| 2.3.2 B6-Co表型正常小鼠、B6-Co单眼小鼠和B6-Co双眼小鼠的比较 |
| 2.4 血常规、尿常规检测结果 |
| 0.05)。'>2.4.1 血常规由表5看出,WBC、MCH、PLT、PCT各组间差异无统计学意义(P>0.05)。 |
| 2.4.2 尿常规 |
| 2.5 行为学实验 |
| 2.5.1 运动协调能力 |
| 2.5.2 生活习性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 繁育性能 |
| 3.2 生长发育 |
| 3.3 脏器指数 |
| 3.4 血常规和尿常规 |
| 3.5 行为学实验 |
（9）脂联素对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、英文缩略词简表 |
| 四、论文正文 |
| 前言 |
| 第一章 TNF-α对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 脂联素对TNF-α诱导内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 脂联素调节内皮细胞表达组织因子和组织因子途径抑制物表达的机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 五、综述1 |
| 六、综述2 |
| 七、致谢 |
| 八、攻读博士学位期间发表的文章 |
（10）遗传性易栓症的基础与临床研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 “原因不明”血栓性疾病患者抗凝蛋白检测及临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 病例来源 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 I型遗传性蛋白C缺陷症遗传表型和基因突变的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 病例及家系资料 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 遗传性易栓症与不良妊娠 |
| 参考文献 |
四、凝血因子IX基因剔除小鼠的遗传及血液学指标检测（论文参考文献）
- [1]腺病毒介导的血友病基因治疗实验研究[D]. 李杰. 华北理工大学, 2020(02)
- [2]腺病毒介导人凝血因子Ⅸ基因在ADSCs中的表达[D]. 王馨. 华北理工大学, 2019(01)
- [3]遗传性FⅫ缺陷症分子机制及血小板相关疾病研究[D]. 金佩佩. 上海交通大学, 2015(02)
- [4]睾丸注射LV载体及其安全性评定[D]. 张星. 华中农业大学, 2012(02)
- [5]四种新的基因突变导致血友病B分子发病机制研究及通读疗法对无义突变所致血友病治疗的初步研究[D]. 陈剑芳. 山西医科大学, 2012(11)
- [6]小鼠B6品系自发突变白斑的遗传学研究[D]. 王栋. 河南农业大学, 2012(04)
- [7]靶向肝脏基因组位点特异性整合治疗血友病B的初步研究[D]. 顾东生. 中国协和医科大学, 2009(04)
- [8]遗传性角膜病小鼠生物学特性观察[J]. 朱顺星,孙丽,刘春,邵义祥. 南通医学院学报, 2009(02)
- [9]脂联素对内皮细胞组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响及机制研究[D]. 陈懿建. 中南大学, 2008(12)
- [10]遗传性易栓症的基础与临床研究[D]. 郑昌成. 安徽医科大学, 2008(05)