一、肿瘤生物治疗的某些新进展和新领域（论文文献综述）
鹿瑶[1]（2021）在《免疫检查点抑制剂对乳腺癌的治疗效果观察》文中指出乳腺癌是女性最常见的肿瘤,长期以来一直是女性肿瘤患病率的第一位,是威胁女性生命和健康的关键原因之一。在过去的30年中,新的抗癌药物如雨后春笋般涌现,诊断和治疗的发展使乳腺癌的死亡率降低了39%。但是,与乳腺癌的斗争仍然面临许多问题和挑战,迫切需要找到新的合理的治疗方法。随着免疫学和生物学的不断发展,免疫疗法长期以来已成为继传统化学疗法,放射疗法和外科手术之后的另一种重要的乳腺癌治疗方法。在肿瘤微环境中,抗原刺激T淋巴细胞活化过程中,由于多种免疫检查点的存在,导致T细胞无法有效激活,免疫检查点在肿瘤的发生和发展过程中起着关键作用。免疫检查点抑制通路的确定导致免疫疗法的重大改进。目前多数治疗主要针对淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）、细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和程序性死亡受体-1（PD-1/PD-L1）等相关免疫检查点分子为靶点。但不同免疫检查点抑制剂对不同类型的乳腺癌的敏感性是否存在差别尚不确定,因此明确不同类型乳腺癌在应用免疫检查点抑制剂的治疗效果,对如何更合理的临床选择将具有重要意义。为了阐明这一问题,本课题作为实验性的研究,主要内容如下:1.观察三种免疫检查点抑制剂对转移性乳腺癌的治疗效果为了了解不同免疫检查点抑制剂在治疗乳腺癌患者中的治疗效果,分别统计了使用三种免疫检查点抑制剂的治疗组与其对照组（常规化疗组）患者治疗效果,结果显示对照组客观缓解率20%。PD-1/PD-L1研究组客观缓解率55%,显着高于对照组（P<0.05）。CTLA-4研究组客观缓解率50%,显着高于对照组（P<0.05）。LAG-3研究组客观缓解率40%,显着高于对照组（P<0.05）。与对照组相比,三种免疫检查点抑制剂均较对照组治疗有效率升高,差异均有显着统计学意义（P<0.05）,说明此三种免疫检查点抑制剂均可提高对乳腺癌的治疗疗效,但三种免疫检查点抑制剂之间无明显差别。2.免疫检查点抑制剂相比于传统治疗对乳腺癌患者一般状态的影响为了了解三种免疫检查点抑制剂在治疗乳腺癌患者时,是否也对患者的一般状态有影响,如体重、心率、血压,我们观察了免疫检查点抑制剂治疗乳腺癌患者后患者的一般状态,结果显示免疫检查点抑制剂组体重、心率及血压与对照组不存在明显差别,没有统计学意义（P>0.05）。说明免疫检查点抑制剂对乳腺癌患者一般状态没有明显影响。3.免疫检查点抑制剂与传统治疗前后血清免疫球蛋白水平比较为了观察与传统治疗方法相比,免疫检查点抑制剂是否能够改善B细胞功能,我们将三种免疫检查点抑制剂组和对照组分别进行观察。结果显示与对照组相比,研究组在治疗后Ig G水平较对照组升高（P<0.05）,其余几种类型抗体包括Ig A、Ig M和Ig E则无明显差别。提示免疫检查点抑制剂有促进乳腺癌患者B细胞分泌产生Ig G抗体的功能,增强体液免疫应答能力,从而参与免疫应答或提高自身抗感染能力,具有良好的治疗作用。4.三种免疫检查点抑制剂对三阴性乳腺癌（TNBC）与非三阴性乳腺癌（非TNBC）患者肿瘤大小的抑制作用为了进一步了解三种免疫检查点抑制剂在治疗不同类型乳腺癌患者时的治疗效果,我们观察了三种免疫检查点抑制剂治疗后,TNBC与非TNBC患者肿瘤大小的变化,结果显示PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂对TNBC患者相比与非TNBC患者的肿瘤大小明显变小（以肿瘤的较大直径与较大的垂直直径的乘积减少50%以上为判断标准）,差异有统计学意义（P<0.05）。然而,CTLA-4和LAG-3免疫检查点抑制剂对TNBC和非TNBC患者都无明显差异,肿瘤无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。5.三种免疫检查点抑制剂对TNBC与非TNBC复发的影响为了解三种免疫检查点抑制剂治疗不同类型乳腺癌后,是否具有显着的抑制癌症复发的作用,我们随访了治疗后出院患者的乳腺癌复发情况,结果显示PD-1/PD-L1和CTLA-4免疫检查点抑制剂应用于TNBC患者可提高病理学缓解率（PCR率）,但对于Luminal A型、Luminal B型乳腺癌基本无获益,而LAG-3免疫检查点抑制剂对TNBC与非TNBC患者的PCR率无明显提高。6.三种免疫检查点抑制剂治疗乳腺癌患者的药物不良反应情况为了明确三种免疫检查点抑制剂在治疗乳腺癌患者时,是否可引起药物不良反应的发生,观察了患者治疗后出现的药物不良反应情况,包括分级、死亡、停药、剂量调整和免疫相关不良事件和输液反应情况,结果显示三种免疫检查点抑制剂的不良反应在各型乳腺癌中与单纯化疗不良反应发生率相似,但其远期影响还疗效需进一步随访观察。结论:1.免疫检查点抑制剂治疗乳腺癌较传统化疗效果显着。2.免疫检查点抑制剂可提高乳腺癌患者血清Ig G水平。3.不同免疫检查点抑制剂对TNBC和非TNBC患者治疗效果不同。免疫检查点抑制剂治疗转移性乳腺癌安全有效,是一种具有发展潜力的临床治疗新策略,值得研究推广。
闫欢[2]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中认为研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
翁洁琼[3]（2020）在《基于网络药理学优化的三阴方干预EMT抑制三阴乳腺癌转移机制研究》文中进行了进一步梳理三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）在所有乳腺癌的分型中约占 15-20%,其雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor-2,HER2）的表达均为阴性。三阴乳腺癌具有治疗后区域复发率高、远处转移率高、预后差的特点,治疗后发生远处转移是患者死亡的首要原因,初诊为TNBC的患者一般在三年内会出现复发转移,发生远处转移的三阴乳腺癌患者的5年相对生存率为11.5%,手术和化疗仍是三阴乳腺癌的主要治疗方法,目前尚无特定靶向治疗的药物,因此发挥中医药的治疗作用,探寻其内在作用机理,具有重要意义。乳腺癌在中医属于“乳岩”等范畴,一般认为肿瘤转移复发与“虚”“毒”“瘀”密切相关。正气不足是肿瘤复发的根本病机,“瘀”、“毒”等余邪伏于体内,伺机而发是肿瘤复发的直接因素。现代医学的治疗手段如手术、放化疗等易伤正气,在正虚的前提下若有癌毒残存则正虚不能制邪,邪毒更易流窜它处,导致肿瘤的复发和转移。正气虚损为肿瘤的复发转移提供了前提条件,在此基础之上,气滞,血瘀,痰湿,热毒等互相博结,则发为癌毒,在癌毒成瘤后,进一步加剧气滞血瘀和热毒程度,阻滞气血经络运行,使肿瘤复发转移。调整机体阴阳、气血、脏腑功能平衡,对肿瘤患者进行中医药干预治疗,可延长患者的无复发生存期,甚至达“既病防变”的效果。卢雯平教授根据多年治疗三阴乳腺癌的临床经验总结出三阴方,全方以黄芪,天南星,皂角刺,海藻,白花蛇舌草,山慈菇作为治疗三阴乳腺癌的基本组方,在此基础上,通常结合患者的舌、脉、不适症状和体质辨证等加减用药。在2007年1月-2012年5月开展的队列研究中,我们将入组的101例三阴乳腺癌患者随机分为辨证服用中药联合西医治疗队列及单纯西医治疗队列,观察患者的3年无进展生存期及患者生存质量,结果显示,中西医结合组的3年无进展生存期较单纯西药治疗组延长,中药可改善因化疗引起的麻木等不适症状,提高患者生活质量。乳腺癌是广安门医院的优势病种,我们还参与了北京市科委课题《中医药对三阴性乳腺癌患者术后复发转移的干预研究》,据2019年5月的随访结果回报,2016年1月～2017年6月入组的60例中晚期三阴乳腺癌患者,中药治疗的3年内无复发生存率为88.3%,文献研究显示三阴乳腺癌的3年无复发生存率为66%,三阴方的疗效确切,其核心药味及内在机制值得深入研究。网络药理学是中药复方药效机制研究的高效方法,可以通过构建可视化网络,从多个层面提供药物活性成分,作用靶点,相关信号通路等方面的信息,预测中药复方的核心成分及作用机制。故本研究分为两个部分,第一部分通过网络药理学的方法探索三阴方的核心药味,预测三阴方的可能作用机制;第二部分根据第一部分的数据分析结果,开展实验研究,验证三阴方干预乳腺癌转移的内在机制,一方面为三阴方的临床应用及进一步推广提供理论基础,另一方面精简中药复方,进一步研究和验证“专病有专方”的中医理念,以期实现更高的卫生经济学效益。目的:通过网络药理学的方法,优化三阴方的组方配伍,探索其核心作用成分及内在的作用机制,并结合体外实验,观察三阴方对乳腺癌细胞的增殖,转移,侵袭等生物学特性的影响,依据网络药理学预测机制探索优化三阴方干预乳腺癌转移的作用机理。方法:第一部分:（1）检索网络数据库,查找三阴方的有效成分和作用靶点并归类总结。通过检索“GeneCard”数据库,获得三阴乳腺癌疾病相关的靶基因。将三阴乳腺癌的靶基因和中药有效成分的作用靶蛋白进行分子对接,使用Cytoscape软件建立“药物-成分-疾病-靶点”网络。（2）分析三阴方的“药物-成分-疾病-靶点”网络数据,总结三阴方的核心药味、有效成分,优化三阴方的配伍。通过建立三阴方的PPI网络,进行GO生物功能富集分析和KEGG信号通路富集分析,筛选三阴方可能作用靶点、影响的生物功能及可能涉及的相关信号通路。第二部分:（1）以优化的三阴方作为研究对象,制备含药血清,设置空白血清组作为阴性对照组,分别加入高、中、低浓度的含药血清培养三阴乳腺癌细胞24h,48h,72h后,使用CCK8实验的方法,观察干预药物对乳腺癌细胞增殖能力的影响,找出最佳给药浓度及最佳干预时间。（2）选取三阴乳腺癌细胞,通过流式细胞仪检测干预药物对三阴乳腺癌细胞凋亡的影响。（3）加入不同浓度的干预药物,培养三阴乳腺癌细胞,通过Transwell迁移实验观察干预药物对三阴乳腺癌细胞迁移能力的影响。（4）培养三阴乳腺癌细胞,加入不同浓度的干预药物,通过Transwell侵袭实验观察干预药物对三阴乳腺癌细胞侵袭能力的影响。（5）通过RT-PCR实验方法,检测依据网络药理学的研究分析的结果,探索三阴方的核心作用机制。结果:第一部分:网络药理学（1）检索得到41三阴方有效活性成分,获得三阴乳腺癌疾病相关的靶基因3885个,在此基础上,删除重复和无关联项,构建三阴方的“药物-疾病-靶点”网络。（2）通过数据分析可知,三阴方中黄芪、皂角刺、白花蛇舌草的作用网络较为广泛,是三阴方中的核心药味;槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷固醇等为三阴方中的主要活性成分:AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、EGFR、EGF等位于PPI网络核心位置;从GO生物过程富集结果分析看,三阴方作用的靶蛋白涉及的生物过程主要影响细胞信号转导和增殖、凋亡等;从KEGG信号通路富集分析看,PI3K/AKT信号通路为主要涉及的通路。上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是肿瘤转移的中轴环节,肿瘤细胞通过EMT获得的侵袭力,此时,E-cadherin下调,Vimentin、N-cadherin上调,细胞间的粘附作用减弱,上皮细胞失去细胞极性及与基底膜的连接,多项研究证明PI3K/AKT信号通路与EMT转化过程密切相关,因此推测三阴方可能通过PI3K/AKT信号通路干预肿瘤细胞的EMT的发生,抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭能力。第二部分:实验研究（1）以CCK8实验的方法观察干预药物对乳腺癌细胞增殖的影响,加入不同浓度含药血清处理后,结果发现24h、48h高浓度组,48h中浓度组细胞的OD值低于空白血清对照组,结果具有统计意义（P<0.05）,说明高浓度组干预24h、48h,中浓度组干预48h,细胞增殖能力受到抑制,其中高浓度组含药血清作用24h的抑制效果最明显,抑制率约为38.7%。（2）AV-PI实验中,以高浓度干预药物作用细胞24h后细胞的凋亡比例约为18.33%,与Control组对比,干预组的凋亡比例增加,结果具有统计学意义（P<0.05）,说明高浓度含药血清可以促进4T1细胞的凋亡。（3）以Transwell小室实验检测细胞细胞的迁移能力,结果显示:高、中浓度组含药血清均可抑制细胞迁移,高浓度组效果优于中浓度组,低浓度含药血清对细胞迁移能力无明显抑制作用。（4）以Transwell小室实验检测细胞细胞的侵袭情况,结果显示:高、中浓度组含药血清均可抑制细胞侵袭,但是高浓度与中浓度含药血清对细胞的侵袭作用无明显差别,低浓度组无明显抑制细胞侵袭能力的作用.（5）通过RT-PCR实验发现,以三阴方核心药物含药血清干预后,细胞的E-cadherin的相对表达量上升（P<0.05）,Vimentin相对表达量下降（P<0.05）,N-cadherin表达无明显变化（P>0.05）,但是呈下降趋势,细胞EMT的过程受到抑制。结论:（1）根据网络药理学数据分析结果,优化三阴方的核心处方为:黄芪、皂角刺、白花蛇舌草;三阴方主要活性成分为槲皮素、山奈酚等,主要作用靶点为AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、EGFR、EGF,涉及的生物过程与信号通路转导、细胞增殖、凋亡相关,主要作用于PI3K/AKT信号通路,可能作用机制为通过PI3K/AKT信号通路,干预肿瘤细胞的EMT,从而抑制细胞迁移与侵袭。（2）实验部分基本吻合网络药理学的预测机制,优化三阴方含药血清能够有效抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力,抑制三阴乳腺癌细胞发生EMT。
岳冉[4]（2020）在《纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞》文中提出背景过继免疫疗法（adoptive immunotherapy,AIT）是近年来迅速发展的恶性肿瘤治疗方法,嵌合抗原受体（chmeric antigen receptor,CAR）修饰免疫细胞尤其取得显着成果。细胞免疫疗法的关键基于安全高效的基因转导方法,将目的基因导入胞内。基因转导有多种方法,目前常用的有慢病毒、逆转录病毒及电穿孔等,但转染效率有限、生物安全性低限制了其发展。阳离子聚合物纳米材料生物相容性好、易于修饰、制备简单、稳定性好,而作为极具潜力的基因载体进入人们的视线。本研究利用新型纳米载体mPEG-P（Asp-AED-g-HFB）（PAEF）介导PiggyBac转座子系统修饰自然杀伤（Natural kill,NK）细胞,实现了较高的基因转导效率,为肿瘤细胞免疫治疗提供了实验依据。目的探索新型阳离子聚合物纳米载体PAEF和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体修饰NK细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略。方法1.制备PAEF/DNA（转座子+转座酶）复合物,通过Nano-ZSE动态光散射系统（Malvern Instruments）测量PAEF/DNA复合物的粒径分布和表面电位。2.DNA凝胶电泳验证PAEF的包封率、释放性和稳定性,结合粒径电位选择进入细胞合适的N/P值。3.CCK-8细胞毒性实验分析不同N/P值条件下PAEF/DNA复合物的细胞毒性。4.荧光显微镜及流式细胞术检测细胞转染效率,评估PAEF基因转染载体的可行性。结果1.PAEF/DNA复合物粒径电位测定显示PAEF可包裹DNA形成粒径100150nm的纳米复合物,有利于介导DNA进入细胞。2.DNA凝胶电泳显示,当PAEF/DNA复合物N/P值为20时,PAEF即可实现DNA的完全包裹;在还原剂二硫苏糖醇（dithiothreotol,DTT）存在的情况下,PAEF对DNA有良好的释放能力。3.CCK-8毒性实验表明N/P值为80时,PAEF/DNA复合物转染组的NK-92细胞存活率显着高于脂质体转染组([（72.5±3.9）%和（64.03±1.8）%,P<0.05]。4.PAEF/DNA复合物转染NK-92细胞48h,荧光显微镜下观察,N/P值80时,红色荧光蛋白（RFP）荧光多、荧光强度大;同样,在此N/P值条件下,流式细胞术显示达最高转染效率（83.4%）。传代培养10d,RFP仍能保持稳定的表达。结论1.本研究成功制备了新型阳离子聚合物纳米载体PAEF与DNA的复合物,经粒径及Zeta电位测量、DNA凝胶电泳包裹及释放实验均显示PAEF作为基因载体的可行性。2.PAEF/DNA复合物对NK-92细胞的细胞毒性明显较脂质体转染组低,说明生物相容性好,荧光显微镜及流式细胞术均显示转染效率较高,传代培养后荧光显微镜显示荧光仍有高表达。本研究建立了基于纳米载体的PiggyBac转座子介导的NK细胞基因转导方法,实现了较高的基因转导效率,为过继免疫治疗基因转导提供了试验依据。
汤卓然[5]（2019）在《基于纳米抗体的CD19 CAR-T细胞靶向抗肿瘤作用研究》文中指出背景:在血液系统恶性肿瘤中,B细胞恶性肿瘤的发病率逐年攀升,然而B细胞恶性血液肿瘤的治疗手段仍十分有限。尽管目前CD19 CAR-T在治疗CD19阳性的B细胞恶性血液肿瘤中己取得了巨大进步,但是经传统CD19CAR-T治疗后仍具有较高的复发率。因此,制备一种新型CAR-T抗B细胞恶性肿瘤是当前亟需解决的问题。目的:本研究利用课题组前期筛选的CD19纳米抗体,构建基于纳米抗体的 CD19 CAR-T 细胞（CD19/NB CAR-T）,探索 CD19/NB CAR-T 细胞体外增殖活性及对靶细胞的杀伤作用,进一步研究CD19/NB CAR-T细胞在体内对NOD/SCID鼠荷Nalm6细胞血液瘤的生长抑制作用,为纳米抗体用于恶性血液肿瘤的过继免疫细胞治疗提供新的策略。方法:1.分离培养人外周血T淋巴细胞,用CD19/NB CAR慢病毒转染T细胞获得CD19/NB CAR-T细胞;荧光显微镜观察CD19/NB CAR-T细胞中GFP的表达;通过流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞表达GFP的情况和 CD19/NB CAR-T 细胞中 CD4+/CD8+比例。2.通过流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞与靶细胞共同孵育后的增殖情况;通过流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞与靶细胞共同孵育后CD19/NB CAR-T细胞表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L,溶酶体蛋白CD107a的表达情况。3.通过流式细胞术检测Nalm6、Raji、K562-CD19、K562细胞表面CD19表达情况;采用流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞对Nalm6、Raji、K562-CD19、K562细胞的杀伤作用。4.采用ELISA检测CD19/NB CAR-T细胞经靶细胞刺激后分泌细胞因子（TNF-α、IL-2、IL-10）的情况,ELISPOT 检测 CD19/NBCAR-T 细胞经靶细胞刺激后分泌IFN-γ的T细胞数量。5.构建NOD/SCID鼠荷Nalm6细胞血液瘤模型,随机分为PBS、UTD、Mock、CD105/NB CAR和CD19/NB CAR组。经尾静脉分别注射各组CAR T细胞后,检测荷瘤小鼠血液中恶性肿瘤细胞残余数,观察小鼠的生存率等指标探索CD19/NB CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用。结果:1.将慢病毒转染T细胞后,荧光显微镜下观察到GFP荧光,经流式细胞术检测结果显示Mock组、CD105/NB CAR组和CD19/NB CAR组的T细胞GFP表达率均超过40%,分别达到（40.5 ± 2.37）%、（42.2±3.09）%和（41.7± 2.86）%,表明 CD19/NB CAR-T 细胞制备成功。2.CD19/NB CAR-T细胞经CD19+靶细胞刺激后增殖明显高于其余对照组别（P<0.001）;CD19/NB CAR-T细胞表面活化分子CD25、CD69,记忆分子CD62L和溶酶体蛋白CD107a的表达水平高于其余对照组（P<0.001）。3.经流式细胞术检测显示K562-CD19、Nalm6、Raji细胞的CD19表达率分别达到90.1%、77.3%、69.5%,K562细胞几乎不表达CD19。CD19/NB CAR-T细胞可在体外特异杀伤CD19+的靶细胞。4.CD19/NB CAR-T 细胞经 CD19+靶细胞（K562-CD19 细胞、Nalm6 细胞）刺激后分泌细胞因子TNF-α和IL-2的含量明显高于其余对照组,各组中IL-10的含量相比较无统计学差异;CD19/NB CAR-T细胞经CD19阴性靶细胞（K562细胞）刺激后分泌细胞因子TNF-α、IL-2及IL-10的含量与其余对照组比较无统计学差异。ELISPOT检测结果显示CD19/NB CAR-T细胞经CD19+靶细胞（Nalm6细胞）刺激后分泌IFN-γ的T细胞数量明显高于其余对照组。5.体内实验结果显示,经CD19/NB CAR-T细胞治疗荷Nalm6 NOD/SICD小鼠后,CD19/NB CAR-T细胞对表达CD19的血液瘤有一定的治疗效果,荷瘤小鼠肿瘤细胞生长受到一定的抑制,生存曲线结果图显示经CD19/NB CAR-T细胞治疗后荷瘤小鼠的生存时间延长。结论:该研究成功构建基于纳米抗体的CD19CAR-T细胞,CD19/NB CAR-T细胞可在体外特异性靶向杀伤CD19+靶细胞,在荷Nalm6细胞NOD/SCID小鼠体内具有抗肿瘤效应,为纳米抗体用于恶性血液肿瘤的过继免疫治疗提供了新的策略。
李良萍[6]（2019）在《共载阿霉素和siRNA的自组装叶酸—生物素—季铵化阳离子淀粉纳米粒的制备及体外协同抗肿瘤研究》文中认为恶性肿瘤已成为我国致死率最高的病症之一,由于其致病因素的复杂性、病情发展的交互性和变化性,以及患者个体特征造成的各种不确定性,使癌症的治疗难度倍增。已有的临床治疗药物和主流治疗方法如手术治疗、化疗和放疗,无论是单独使用还是联合应用,均难以取得理想的疗效,无法有力遏制恶性肿瘤的恶化和高致死率。面对严峻的治疗现状,新的、高效的治疗手段和药物制剂的研制一直是癌症治疗努力探索的方向。化疗是癌症的主要治疗手段之一,应用于大多数恶性肿瘤的发生发展阶段的治疗。化疗药物可以通过干扰核酸的合成代谢、抑制有丝分裂、抑制蛋白质合成等机制抑制肿瘤细胞的增殖,有效杀灭癌细胞。但肿瘤细胞的抗凋亡机制以及快速产生的多药耐药性,使化疗收效甚微。加上化疗药物的全身性分布,常常在抑癌过程中对其它正常组织器官造成严重损伤,给患者带来很多难以承受的副作用。基因治疗常被用于致癌基因的敲除（或沉默）和抑癌基因的导入或激活,从而达到抑制肿瘤发生发展的治疗目的。但基因药物极易在生物体内降解、失活,且无肿瘤靶点特异性和募集能力。运用具有肿瘤靶向性的纳米载体系统包载化疗药物和基因制剂,进行两种药物制剂的肿瘤细胞靶点共输送,实现化疗和基因治疗协同抑癌,是非常值得期待的癌症治疗途径,也是当前癌症治疗的研究热点。该治疗方法可以避免化疗药物和基因制剂的全身性分布,减少用药带来的毒副作用和药物制剂的大量损耗,能够提高药物制剂的肿瘤靶点募集度,提高药物的疗效。基于肿瘤组织的增强的渗透及滞留效应（EPR效应）和叶酸与特异性受体间的亲和作用,本论文设计、制备了一种新的共载抗癌药物和siRNA的肿瘤靶向递送纳米载体,即叶酸-生物素-季铵化淀粉纳米载体（FBqS NPs）。该载体具有两亲性质,在水溶液中可自组装成为核壳型球状聚合物纳米粒,其内核可通过疏水性相互作用包载化疗药物,而阳离子亲水外壳借静电吸附包载siRNA,实现化疗药物和siRNA的共包载及递送。我们以疏水性小分子药物阿霉素（DOX）为化疗的模式药物进行FBqS NPs的内核包载,以可降解1型胰岛素样生长因子受体（IGF1R）靶基因转录产物mRNA的siRNAIGF1R为基因药物,FBqS NPs带正电荷的亲水外壳静电吸附包载荷负电的siRNAIGF1R,制备DOX和siRNAIGF1R共载的siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs。通过一系列实验,观察和评估siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs的理化性质以及DOX和siRNAIGF1R协同作用下的体外肿瘤细胞抑制效果。主要研究内容和研究结果如下:1)参照已有研究的制备方法,进行反应温度和反应时间双因素交互实验,在实验室制备出高取代度季铵化阳离子淀粉,元素分析测得季铵化基团取代度为0.59。以叶酸、生物素和季铵化淀粉为原料,通过“一步法”酯化合成叶酸-生物素-季铵化淀粉两亲性高分子聚合物（FBqS）,在水溶液中经超声处理,自组装成为叶酸-生物素-季铵化淀粉纳米微粒（FBqS NPs）。对FBqS NPs的理化性质进行了一系列表征,结果显示FBqS NPs为球形的核壳结构纳米微粒,平均粒径为109nm,多分散系数为0.183,Zeta电位为28.59mV。通过超声波处理和静电吸附,FBqS NPs被制备成DOX和siRNAIGF1R共包载的siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs。DOX的载药量和包封率均较理想,分别为5.9%和70.7%。凝胶电泳实验测得DOX/FBqS NPs完全包载siRNAIGF1R的质量比为40/1,FBqS NPs可以在高浓度血清中有效保护siRNAIGF1R免于核糖核酸酶降解长达48小时以上,siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs的血液相容性明显优于游离DOX。siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs的DOX和siRNAIGF1R的释放行为均为pH敏感型,酸性环境更有利于DOX和siRNAIGF1R的释放。2)共载DOX和siRNAIGF1R的FBqS NPs用于人非小细胞肺癌A549细胞内DOX和siRNAIGF1R的靶向递送,siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs的细胞毒性、靶向配基竞争性、细胞增殖抑制、细胞的摄入、胞吞机制和目标蛋白表达抑制被充分论证,与其它几种不同药物剂型相比,siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs显示出最高的A549细胞毒性,且游离叶酸对该细胞毒性呈剂量依赖型的竞争性抑制,A549细胞与siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs孵育时表现出最低的细胞增殖能力。能量依赖的、小窝蛋白和网格蛋白介导的细胞内吞是siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs的主要胞吞途径,siRNAIGF1R/DOX/FBqS NPs显着抑制A549细胞的目标蛋白IGF1R表达。
孙雯雯[7]（2017）在《HT29细胞结肠癌干细胞抗原负载免疫细胞及其联合中药的干预研究》文中研究说明结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,每年世界范围内死于结肠癌的患者约60万。肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、转移和复发的根源,目前尚缺乏对结肠癌HT-29细胞干细胞体内外杀伤作用及机理的系统性研究。中药基于中医理论治疗,在临床上应用已久。基于此,本论文通过体内外实验,系统地研究了结肠癌HT-29细胞干细胞作为特异性抗原负载DC-CIK细胞和中药槐耳颗粒及山药提取物联合DC-CIK细胞体系对结肠癌干细胞杀伤作用及机理。首先,利用磁珠分选方法分选HT29细胞系中CD133+细胞,进行克隆形成与裸鼠致瘤实验。结果表明,同一接种密度下,CD133+细胞克隆形成率显着高于CD133-细胞,CD133+细胞可致裸鼠成瘤。这些研究验证了CD133分子作为源自HT29细胞结肠癌肿瘤干细胞特异性标志物的可行性。在上述CD133+细胞作为结肠癌肿瘤干细胞的基础上,制备了3种特异性抗原:（1）构建含有CD133抗原表位AC133编码序列的原核表达质粒,获得纯化的AC133重组蛋白,证实能够使小鼠产生免疫应答,继而构建了AC133慢病毒真核表达载体;（2）结肠癌干细胞总RNA提取物;（3）结肠癌干细胞全细胞裂解物。用上述3种结肠癌干细胞抗原分别负载DC-CIK细胞,体外杀伤HT29细胞及其干细胞,结果显示3种体系细胞杀伤效果均强于无负载的DC-CIK细胞和单独的CIK细胞。此外,研究了中药槐耳颗粒及山药提取物对HT29细胞及其干细胞的杀伤作用。结果显示,槐耳颗粒和山药提取物均可抑制结肠癌HT-29细胞增殖速率,使干细胞（CD133+细胞）比例明显降低。中药槐耳颗粒及山药提取物联合DC-CIK细胞对HT29细胞及其干细胞的杀伤作用强于单独使用槐耳颗粒及山药提取物。随后,建立了结肠癌干细胞荷瘤裸鼠模型,进行体内药效实验及机理研究。结果表明,上述3种抗原负载DC-CIK细胞体系、中药槐耳颗粒或山药提取物联合DC-CIK细胞体系,及5-Fu联合DC-CIK细胞体系对荷瘤小鼠的抑瘤效果强于单独使用5-Fu、中药槐耳颗粒或山药提取物、无负载的DC-CIK细胞;其发挥作用的机制主要包括CD4+T、CD4+T/CD8+T和Th1型细胞因子升高,PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和Notch通路中的关键基因PI3KR1、Wnt1和Notch1的mRNA表达下调,及Bcl-2蛋白表达下调和Bax蛋白表达上调,诱导细胞凋亡。总之,本文通过体内外试验联合证明CD133可以作为源自HT29细胞的结肠癌肿瘤干细胞特异性标志物,其相应抗原负载的DC-CIK细胞体系,以及中药槐耳颗粒或山药提取物联合DC-CIK细胞体系均对结肠癌干细胞具有较好杀伤效果,为其临床应用研究奠定了基础。
崔稳丽[8]（2016）在《卵巢子宫内膜异位症与卵巢恶性肿瘤相关分析》文中研究指明目的通过对EAOC及未合并EMs的卵巢恶性肿瘤病例回顾性分析,了解EAOC的发病情况、高危因素及影响预后的独立因素。方法1一般临床资料分析:回顾性分析我院2007年1月至2015年1月就诊并经病理确诊的原发性卵巢恶性肿瘤患者共257例,根据卵巢子宫内膜异位症恶变诊断标准及病理结果,将257例患者分成三组:A组,卵巢子宫内膜异位症恶变组,25例;B组,仅合并EMs的卵巢恶性肿瘤,32例;C组,未合并子宫内膜异位症的卵巢恶性肿瘤,200例。从卵巢恶性肿瘤的临床病理资料对三组进行对照分析。2生存分析:将A组和B组合并统称为子宫内膜异位症相关卵巢癌（EAOC）。收集57例EAOC患者的临床病理资料、随访情况。回顾性分析57例EAOC患者的治疗情况,并利用SPSS17.0软件采用Kaplan-Meier法,Log-rank法检验生存率,以了解影响EAOC预后的独立因素。结果1临床资料分析:（1）子宫内膜异位症相关卵巢癌（A组和B组）的发病率为3.6%（57/1564）,卵巢EMs恶变卵巢癌（A组）发病率为1.6%（25/1564）;（2）EAOC（A组和B组）的平均发病年龄（46.3±15.1）岁,显着低于未合并EMs卵巢癌的发病年龄,P<0.05;（3）术前血清CA125水平,三组血清CA125水平多在200 U/m L以上,A组60%（15/25）,B组68.8%（22/32）,C组84.5%（169/200）;（4）肿瘤直径:三组肿瘤直径多在10 cm以上,A组16例（16/25,64%）,B组22例（22/32,68.8%）,C组162例（162/200,81.0%）;（5）A组和B组患者主诉症状以下腹疼痛为主（33/57,57.8%）,而C组则以腹部包块为主（130/200,65%）,两者临床主诉症状相比差异性显着,P<0.05;（6）FIGO分期:通过统计学分析发现A组和B组以Ⅱ期为主,分别占68.0%和56.3%,而C组却以Ⅲ期为主,所占比例为56.0%,三组FIGO分期相比差异显着,P<0.05;（7）组织学分型:A组、B组均以透明细胞癌为主,分别占60.0%和56.3%,而C组则以浆液性腺癌为主（55.5%）。2生存分析:（1）57例子宫内膜异位症相关卵巢癌患者平均生存时间（23.7±18.5）个月,1年存活率为71.9%,3年存活率为21.1%,5年存活率为7.0%;（2）年龄≤50岁患者的生存时间（中位生存时间26个月）显着高于年龄>50岁患者的生存时间（中位生存时间13个月）,P<0.01;（3）FIGO分期Ⅰ/Ⅱ期患者生存时间（中位生存时间24个月）与Ⅲ/Ⅳ期患者的生存时间（中位生存时间17个月）相比,具有显着的差异性;（4）术后残余肿瘤灶<2 cm患者生存时间（中位生存时间25个月）明显高于≥2 cm患者生存时间（中位生存时间15个月）,P=0.008;（5）血清CA125水平>200 U/m L患者生存时间（中位生存时间15个月）显着低于≤200 U/m L患者的生存时间（中位生存时间33个月）,P<0.01;（6）化疗>6个疗程时长患者的生存状况（中位生存时间28个月）优于≤6个疗程患者的生存状况（中位生存时间19个月）,P<0.01,且在化疗基础上进行合理的中医药调护能够明显的提高患者生活质量,延长患者生存时间。结论1.卵巢子宫内膜异位症存在着一定的恶变机率,并且恶变的卵巢子宫内膜异位症的组织学类型以透明细胞癌为主,FIGO分期以Ⅱ期为主;其中年龄小病程长、血清CA125水平>200 U/m L及肿瘤直径>10 cm是卵巢子宫内膜异位症恶变的高危因素。2.年龄、术前血清CA125水平、病理分期、术后残余病灶大小、化疗时长及中医药调护与子宫内膜异位症相关卵巢癌的预后密切相关。
卢斌[9]（2013）在《肿瘤细胞免疫治疗项目投资的策划与分析》文中指出肿瘤细胞免疫治疗研究是当今世界上生命科学和转化医学研究的热点之一,从肿瘤细胞免疫治疗的研究成果可以看出其拯救生命、保障健康的重要作用和潜在价值,利用该技术治疗疾病是医学史上的一次革命。专家断言:“二十一世纪的肿瘤治疗,将是细胞治疗的时代”。世界卫生组织公布的数据显示,在2008年,中国已成为世界第二大癌症高发病率国家。面对如此大的肿瘤市场,面对肿瘤患者求治无门,开展肿瘤细胞免疫治疗必将带来丰厚的经济收益和社会收益。本文根据其技术先进、成本低廉和前景广阔等特点,通过调查分析,对其产品定位、营销模式、生产组织、投资规模以及投资风险规避等进行了系统的分析和全过程策划。首先,通过市场分析,对目标顾客群进行细分,确定该产品的目标市场及其营销模式;其次,从目标市场、营销策略、企业内外环境分析、财务规划、投资风险等诸多因素共同作用的分析中探索开发该项目市场的条件和基础;最后,综合该产品的市场和生产模式定位,对投资规模,财务状况以及预期的投资风险进行预测,确定该项目预期的收益和现金流,并为潜在风险提供可行的规避办法,对近期项目的开发和发展燃提出操作性较强的措施和对策,在此基础上提出肿瘤细胞免疫治疗的长远发展方向。总之,本文从市场、生产、投资收益和现金流等几个方面对该新产品投资项目进行了分析和评估,并为每一步骤提供了行之有效的实施计划,财务评价结果表明该投资项目具有可行性。
李姵萱[10]（2011）在《疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究》文中研究表明1.目的：疏肝清毒汤是对癌症具有比较客观疗效的—自拟方,本文以其来处理肝癌细胞株HepG-2,以初步探讨疏肝清毒汤体外抗肝癌的作用机制。2.方法：2.1细胞的培养：用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。2.2疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验：将疏肝清毒汤原液作系列倍比稀释成以下八个浓度100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L。用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度2孔,并设不加药物的对照。置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养,12d后去掉上清,将所余细胞用MTT法测药物细胞毒性。2.3疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响：取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将疏肝清毒汤稀释至浓度为60g/L和30g/L,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。在培养后即刻及1、2、3、4、5、6、7天,各取样4孔,消化后各孔取40μl,加0.4%台盼蓝染液10μl,置血球计数板计数拒染的活细胞数,并与培养时间作图。2.4疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响：将疏肝清毒汤原液作系列倍比稀释成以下八个浓度60、30、15、7.5、3.751、1.875、0.938、0.469g/L。用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,按0.1ml/孔分种于96孔板,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁,2d后换含药培养液0.1ml/孔,每个浓度2孔,并设不加药物的对照。置37℃、饱和湿度、5%C02培养箱内继续培养；12d后收集上清,用人血清甲胎蛋白（AFP）酶联定量诊断试剂盒检测上清中AFP的分泌量。2.5疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响：用0.06%胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成浓度为3×105个/ml的细胞悬液,将细胞悬浮液加入96孔培养板中,每孔200μl,置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养,培养24小时细胞贴壁。弃培养液,加入浓度为60g/L和30g/L的疏肝清毒汤,每个浓度2孔,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。分别培养24 h和48 h后离心收集上清,用酶联免疫法（ELISA）检测ALT、LDH。2.6疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响：取对数生长期的细胞,0.06%胰酶消化后制成单细胞悬液,0.4%台盼蓝染色,计算拒染的活细胞率为97.5%。将细胞悬液接种至50cm2培养瓶中,106个细胞/瓶,培养液为含10%FCS、100U/ml青链霉素的10%胎牛血清的DMEM,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24小时后,更换培养液,药物组：每瓶培养液5 ml中加入疏肝清毒汤终浓度为60g/L、30g/L；对照组加入等量2%DMEM。加药后于24小时、48小时每个时间点各取3瓶细胞,进行检测。凋亡细胞的检测：小心弃掉培养液,0.06%胰酶消化3分钟,轻轻吹打细胞成单细胞悬液,1000r/min离心10分钟,Binding Buffer重悬细胞至1×106/ml,取100μl细胞悬液（HepG-2细胞）至5ml FACS管中,加入5μl Annexin V-FITC,10μlF混匀,室温下避光孵育15分钟后每管加入400μl Binding Buffer,1小时内上机进行流式细胞分析。同时设对照管（主细胞）和补偿设置管,即未染色的细胞,单染Annexin V-FIT的管和单染PI的管。FCM流式细胞术分析：采用FACS Calibur（美国BECKMAN COULTE公司）ALTRA型流式细胞仪,488nm激发光源。先将对照管上样,通过调整参数FSC和SSC,在散射光点图（FSC/SSC）中清获显示出一个清晰、集中的细胞群体,对细胞群体进行设门（Gate）,再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将对照管（裸细胞）的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达比率。调定流式细胞仪,使荧光散入图中裸细胞集中分布在左下象限。保持FL1、FL2、FL3不变分别将单染AV-FITC的管和单染PI的管上样,调整仪器荧光补偿值,进行光谱重叠校正后即可分析样本。每个样本上获取10,000个细胞,采用CellQuest功能软件进行分析。2.7AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡：将1×106/ml HepG-2细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,加入疏肝清毒汤终浓度为60g/L、30g/L,置37℃、5%CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养,孵育后分别于24及48小时观察结果。AO/EB染色及观察结果：取细胞悬液100μl,加入AO/EB染料4μl混匀,置1滴于载玻片,上覆盖玻片,荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。2.8疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响：细胞爬片分组以24孔培养板每孔置入一块无菌玻片,取对数生长期HepG-2细胞消化制备成细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/ml,接种24孔板内lml/孔。置培养箱24小时后,中药组加入疏肝清毒汤终浓度分别为60g/L和30g/L,对照组加入2%DMEM,以上各组均平行三孔,继续培养48小时后,取出爬满的细胞的玻片,用PBS漂洗二遍,经4%多聚甲醛固定30分钟,PBS洗涤后自然风干,-20℃保存备用。检测方法按试剂盒说明书进行,主要步骤有：滴入过氧化物酶阻断剂50μl；37℃10分钟；PBS反复洗三次,滴入正常非免疫羊血清50μl；37℃10分钟,直接甩干,分别加入p53一抗,37℃2小时；PBS洗3次,滴入生物标记的二抗,37℃10分钟；PBS洗3次,滴入链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶溶液,37℃10分钟；PBS洗3次,滴入新鲜配制的DAB显色溶液,光学显微镜下观察显色效果,至显色明显,用自来水冲洗后,苏木素复染。中性树胶封固,摄像。2.9疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响：细胞的准备：取对数生长期细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×104/ml的单细胞悬液,在24孔培养板中接种细胞,每孔1ml。培养24小时细胞贴壁后,用完全培养基将疏肝清毒汤稀释至浓度为60g/L和30g/L,对照组用2%DMEM取代疏肝清毒汤。37℃,5%CO2、饱和湿度条件下于CO2培养箱中培养。Fas/FasL mRNA相对表达量的变化：分别抽提对照组HepG-2,疏肝清毒汤60g/L、30g/L组HepG-2三组细胞总RNA,逆转录为cDNA。取逆转录反应产物1μl作为模板,共扩增Fas基因片段和内参β-actin。PCR反应条件：94℃预变性5min,94℃变性45s,64℃退火30 s,72℃延伸1min,经35个循环。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,将结果在凝胶呈像系统中扫描其辉度值,以Fas基因与内参基因的辉度比值作为其相对表达量,比较各组之间的差别。同样实验共重复3次。取逆转录反应产物1μl作为模板,共扩增FasL基因片段和内参β-actin。PCR反应条件：94℃预变性5 min,94℃变性45 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,经38个循环。扩增产物在1.8%琼脂糖凝胶中电泳,将结果在凝胶呈像系统中扫描辉度值,以Fas L基因与内参基因的辉度比值作为其相对表达量,比较三组之间的差别。同样实验共重复3次。3.结果3.1疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验：（1）疏肝清毒汤在设定的八个浓度（100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g/L）时,对HepG-2细胞的药物半数毒性浓度TC50为62.65 g/L,对HepG-2细胞的破坏率分别为107.66、37.83、5.82、-0.97、-3.88、-15.52、4.85、21.34%；（2）疏肝清毒汤在浓度100g/L,细胞出现空泡、萎缩、脱落,破坏率分别达107.66%和88.90%；疏肝清毒汤浓度为50g/L,镜下可见细胞形态大致正常。3.2疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响：疏肝清毒汤浓度为60g/L,在0-7天时,其细胞数分别为1、1.7、1.8、1.2、0.9、0.7、0.4、0.3万/ml,浓度为30g/L,其细胞数分别为1、1.7、1.9、1.6、1.4、0.9、0.6、0.4万/ml,细胞增殖缓慢。可见,疏肝清毒汤（60g/L、30g/L）能抑制’HepG-2细胞的生长。3.3疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响：疏肝清毒汤浓度为60g/L和30g/L时,HepG-2细胞AFP的分泌量为13.22 ng/ml和18.08 ng/ml,而对照组为214.52 ng/ml。根据正常参考值为小于20ng/ml的标准,可以看出当疏肝清毒汤浓度在60、30 g/L时,能抑制HepG-2细胞AFP的分泌,在体外对肝癌细胞HepG-2的AFP分泌有抑制作用。故疏肝清毒汤在体外抑制肝癌细胞HepG-2分泌AFP的作用较好。3.4疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响：加入疏肝清毒汤24h后,疏肝清毒汤60g/L组ALT为12.34 U/L,LDH为182.42 U/L,疏肝清毒汤30g/L组ALT为10.89 U/L,LDH为165.33 U/L,与空白组比较有极显着性差异；加入疏肝清毒汤48 h后,疏肝清毒汤60g/L组ALT为18.60 U/L,LDH为284.40 U/L,疏肝清毒汤30g/L组ALT为15.18 U/L,LDH为218.30 U/L,与空白组比较有显着性差异。3.5疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响：疏肝清毒汤随浓度增加,HepG-2细胞的凋亡率升高,出现典型的凋亡峰,与对照组相比差异有显着性（P<0.05）。但本实验凋亡率较小,可能与细胞凋亡发生的整个过程短暂,凋亡时间不同步,部分凋亡细胞碎裂未能检测到有关。但实验结果还是较明确地证明了疏肝清毒汤能直接诱导HepG-2细胞凋亡,这可能是疏肝清毒汤抗肝癌的重要机制之一。3.6AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡：对照组细胞在24和48小时其凋亡率分别为2.10%和3.21%；疏肝清毒汤60g/L诱导HepG-2细胞凋亡,在24和48小时其凋亡率分别为8.90%和18.32%；疏肝清毒汤30g/L诱导HepG-2细胞凋亡,在24和48小时其凋亡率分别为6.40%和12.54%。3.7疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响：疏肝清毒汤组p53表达显色较对照组明显加深,呈强染色,且阳性细胞数明显增多。疏肝清毒汤浓度为60g/L时,p53阳性细胞率为33.56%,疏肝清毒汤浓度为30g/L时,p53阳性细胞率为29.45%,与空白对照组比较,有显着性差异（P<0.05）,且呈剂量依赖关系。3.8疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响：（1）Fas基因mRNA相对表达量的变化：Fas基因与β-actin RT-PCR共扩增,表明以疏肝清毒汤60g/L剂量处理后的HepG-2细胞其Fas基因的相对表达量较对照组明显增高。（2）FasL基因mRNA相对表达量的变化：FasL基因与β-actin RT-PCR共扩增,表明疏肝清毒汤60g/L剂量组HepG-2细胞Fas L基因的相对表达量较空白对照组和阴性对照组明显增高。4.结论4.1疏肝清毒汤能抑制HepG-2细胞的生长,对HepG-2细胞有明显的细胞毒作用,并且这种改变随着药物作用时间的延长而更加明显。4.2疏肝清毒汤在体外抑制肝癌细胞HepG-2分泌AFP的作用较好。4.3疏肝清毒汤抗癌的作用机制是诱导细胞凋亡,且诱导作用随诱导时间延长,其细胞凋亡率逐渐增高。4.4疏肝清毒汤能上调人肝癌细胞HepG-2凋亡相关基因p53的表达,且呈剂量依赖关系。4.5疏肝清毒汤能上调Fas/FasL的表达,从而诱导肝癌细胞的凋亡。
二、肿瘤生物治疗的某些新进展和新领域（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤生物治疗的某些新进展和新领域（论文提纲范文）
（1）免疫检查点抑制剂对乳腺癌的治疗效果观察（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 乳腺癌的危害及现状 |
| 1.2 乳腺癌的病因学探讨 |
| 1.2.1 导致乳腺癌的主要因素 |
| 1.2.2 发病机制 |
| 1.3 乳腺癌的分类、病理和分级 |
| 1.3.1 组织学分类 |
| 1.3.2 分级 |
| 1.4 乳腺癌的临床症状和相应检查 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 辅助检查 |
| 1.5 乳腺癌的诊断 |
| 1.6 乳腺癌的综合治疗 |
| 1.6.1 手术治疗 |
| 1.6.2 化学药物治疗 |
| 1.6.3 内分泌治疗 |
| 1.6.4 放射治疗 |
| 1.6.5 生物靶向治疗 |
| 1.7 免疫疗法,乳腺癌治疗新思路 |
| 1.7.1 乳腺癌与人体免疫系统 |
| 1.7.2 乳腺癌的免疫治疗措施 |
| 1.8 免疫检查点阻滞剂在乳腺癌免疫治疗中的研究结果 |
| 1.8.1 免疫检查点和肿瘤免疫逃逸 |
| 1.8.2 靶向治疗CTLA-4 的免疫检查点抑制剂 |
| 1.8.3 用于PD-1/PD-L1靶向治疗的免疫检查点抑制剂 |
| 1.9 三阴性乳腺癌免疫治疗研究进展 |
| 1.9.1 乳腺癌的分子结构分析 |
| 1.9.2 TNBC主动免疫疗法 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 临床资料 |
| 2.1.1 病例来源 |
| 2.1.2 诊断标准 |
| 2.1.3 纳入标准 |
| 2.1.4 观察指标 |
| 2.1.5 评价标准 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 对照组行常规化疗方案 |
| 2.2.2 研究组行检查点抑制剂免疫治疗方案 |
| 2.2.3 患者血清免疫球蛋白水平的检测 |
| 2.2.4 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 观察三种免疫检查点抑制剂对乳腺癌的治疗效果 |
| 3.2 免疫检查点抑制剂相比于传统治疗对乳腺癌患者一般状态的影响 |
| 3.3 免疫检查点抑制剂与传统治疗前后血清免疫球蛋白水平比较 |
| 3.4 三种免疫检查点抑制剂对TNBC与非TNBC患者肿瘤大小的抑制作用 |
| 3.5 三种免疫检查点抑制剂对TNBC与非TNBC复发的影响 |
| 3.6 三种免疫检查点抑制剂治疗乳腺癌患者的药物不良反应情况 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 研究生期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）基于网络药理学优化的三阴方干预EMT抑制三阴乳腺癌转移机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文略缩词 |
| 综述一: 中药复方的网络药理学研究进展 |
| 1.网络药理学的提出背景 |
| 2.中药复方研究的特点 |
| 3.中药复方的网络药理学研究进展 |
| 4.总结 |
| 综述二: 中西医关于三阴乳腺癌转移的上皮间充质转化机制研究 |
| 1.研究背景 |
| 2.转移机制研究 |
| 3.中医学对乳腺癌复发转移的认识 |
| 4.总结 |
| 前言 |
| 一、网络药理学分析三阴方 |
| 1.研究方法 |
| 1.1 筛选三阴方有效成分及靶基因 |
| 1.2 获取三阴乳腺癌相关基因 |
| 1.3 构建预测的“药物-成分-靶点-疾病”网络 |
| 1.4 构建蛋白相互作用(PPI)网络 |
| 1.5 基因本体(GO)功能富集分析和与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 三阴方主要活性成分 |
| 2.2 三阴方靶蛋白及TNBC相关基因 |
| 2.3 三阴方的“药物-成分-靶点-疾病”网络 |
| 2.4 单味中药的拓扑学网络 |
| 2.5 蛋白相互作用(PP)网络核心基因 |
| 2.6 基因本体(GO)功能富集分析和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 二、优化三阴方干预乳腺癌转移的实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验试剂和器材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要溶液配置 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 含药血清制备 |
| 2.3 加药方法 |
| 2.4 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.6 Transwell体系检测细胞迁移 |
| 2.7 Transwell体系检测细胞侵袭 |
| 2.8 实时定量荧光PCR |
| 2.9 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 三阴方可以抑制乳腺癌细胞的增殖 |
| 3.2 三阴方可以促进细胞的凋亡 |
| 3.3 三阴方可以抑制细胞的迁移 |
| 3.4 三阴方可以抑制细胞的侵袭 |
| 3.5 三阴方影响EMT相关基因的表达 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:PiggyBac转座子系统及CAR-NK细胞在肿瘤免疫治疗中的进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）基于纳米抗体的CD19 CAR-T细胞靶向抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞及培养条件 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 实验仪器设备 |
| 1.6 实验溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 慢病毒载体构建 |
| 2.2 慢病毒包装以及质量检测 |
| 2.3 T淋巴细胞分离 |
| 2.4 慢病毒转染T细胞 |
| 2.5 各组CAR-T细胞转染效率检测 |
| 2.6 流式细胞仪检测各组CAR-T细胞的CD4~+表达比例 |
| 2.7 流式细胞仪检测各组CAR-T细胞的CD8~+表达比例 |
| 2.8 细胞的传代及培养 |
| 2.9 流式细胞术检测Nalm6等靶细胞的CD 19表达情况 |
| 2.10 流式细胞术检测CD19/NB CAR-T细胞增殖情况 |
| 2.11 经流式细胞仪检测经靶细胞刺激后的CAR-T细胞表面分子表达情况 |
| 2.12 酶联免疫斑点法检测CAR-T细胞经靶细胞刺激后分泌INF-γ的T细胞数目 |
| 2.13 ELISA检测CAR-T细胞经靶细胞刺激后分泌IL-2细胞因子的水平 |
| 2.14 ELISA检测CAR-T细胞经靶细胞刺激后分泌TNF-α细胞因子的水平 |
| 2.15 ELISA检测CAR-T细胞经靶细胞刺激后分泌IL-10细胞因子的水平 |
| 2.16 流式细胞仪检测CAR-T细胞对CD19~+肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 2.17 观察CAR-T治疗对小鼠B-ALL血液瘤的抑制作用 |
| 2.18 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 成功构建慢病毒载体 |
| 3.2. 慢病毒成功转染CAR基因至T细胞 |
| 3.3. 流式细胞术检测结果显示CD19/NB CAR-T细胞的CD4~+/CD8~+比例与其余对照比较,差异无显着性 |
| 3.4. 经CD19~+细胞刺激后CD19/NB CAR-T细胞快速增殖 |
| 3.5. 经CD19~+细胞刺激后CD19/NB CAR-T细胞表面活化分子CD25和CD的表达水平高于其余对照组 |
| 3.6. 经CD19~+细胞刺激后CD19/NB CAR-T细胞表达记忆相关分子CD62L的比例升高 |
| 3.7. CD19/NB CAR-T细胞能特异性杀伤CD19~+肿瘤细胞 |
| 3.8. 流式细胞术检测对各组细胞的CD107a表达,CD19/NB CAR组的CD107a表达最高 |
| 3.9. 经CD19~+细胞刺激后CD19/NB CAR-T细胞分泌IFN-γ的能力上调 |
| 3.10. CD19/NB CAR-T细胞经CD19~+靶细胞刺激后分泌细胞因子(IL-2、TNF-α)增多 |
| 3.11. CD19/NB CAR-T能抑制小鼠B-ALL血液瘤的生长 |
| 4. 讨论 |
| 全文小结 |
| 附录1 |
| 附录2: 中英文缩略词对照表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（6）共载阿霉素和siRNA的自组装叶酸—生物素—季铵化阳离子淀粉纳米粒的制备及体外协同抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症 |
| 1.2 恶性肿瘤生理特征 |
| 1.2.1 细胞无限增生和异质化生长 |
| 1.2.2 脉管系统不健全 |
| 1.2.3 免疫逃逸 |
| 1.2.4 浸润和转移 |
| 1.2.5 恶性肿瘤的微环境特征 |
| 1.2.5.1 肿瘤微环境低氧状态 |
| 1.2.5.2 肿瘤微环境低pH状态 |
| 1.2.5.3 肿瘤微环境高压状态 |
| 1.2.5.4 肿瘤微环境慢性炎症状态 |
| 1.3 癌症治疗方法简介 |
| 1.3.1 手术治疗 |
| 1.3.2 化疗 |
| 1.3.3 放疗 |
| 1.3.4 分子靶向治疗 |
| 1.3.5 免疫治疗 |
| 1.3.6 基因治疗 |
| 1.4 肿瘤靶向给药概述 |
| 1.4.1 肿瘤靶向递药生理基础 |
| 1.4.2 靶向给药系统动力机制 |
| 1.4.3 肿瘤靶向给药系统的设计与构建 |
| 1.4.3.1 载体系统大小 |
| 1.4.3.2 载体系统低pH响应性 |
| 1.4.3.3 肿瘤靶点特异性 |
| 1.4.3.4 良好的生物兼容性 |
| 1.4.3.5 理想的药物包封与释放 |
| 1.5 肿瘤靶向纳米载体综述 |
| 1.5.1 靶向药物载体介绍 |
| 1.5.1.1 结构外形特征分类 |
| 1.5.1.2 药物制剂递送分类 |
| 1.5.2 抗肿瘤药物制剂 |
| 1.5.2.1 化学药物 |
| 1.5.2.2 基因药物 |
| 1.5.2.3 生物分子药物 |
| 1.6 研究目的、研究内容、研究意义 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 研究意义 |
| 第二章 高取代度季铵化阳离子淀粉的制备与表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验内容 |
| 2.4.1 季铵化阳离子淀粉实验室制备 |
| 2.4.2 季铵化阳离子淀粉理化性质表征 |
| 2.4.2.1 元素分析 |
| 2.4.2.2 核磁共振分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 阳离子淀粉取代度 |
| 2.5.2 阳离子淀粉化学结构特征 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米载体的制备与表征 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验试剂与耗材 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验内容 |
| 3.4.1 “一步法”制备叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒 |
| 3.4.2 叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒的理化性质表征 |
| 3.4.2.1 核磁共振分析 |
| 3.4.2.2 透射电镜成像 |
| 3.4.2.3 粒径、Zeta电位和多分散指数测定 |
| 3.4.2.4 临界聚集浓度测定 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒的结构特征 |
| 3.5.2 叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒的表面形态 |
| 3.5.3 叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒的粒径、Zeta电位和多分散性指数 |
| 3.5.4 临界自聚浓度值 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 阿霉素包载的叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒制备与表征 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验试剂与耗材 |
| 4.3 实验仪器 |
| 4.4 实验内容 |
| 4.4.1 阿霉素包载的叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒的制备 |
| 4.4.2 DOX/FBqS NPs的理化性质表征 |
| 4.4.3 DOX/FBqS NPs的载药、释药性质 |
| 4.4.3.1 DOX浓度标准曲线 |
| 4.4.3.2 载药量和包封率测定 |
| 4.4.3.3 阿霉素体外释放 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 DOX/FBqS NPs理化性质特征 |
| 4.5.2 DOX浓度标准曲线 |
| 4.5.3 纳米粒的载药量和包封率 |
| 4.5.4 药物体外释放结果 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒制备与表征 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验试剂与耗材 |
| 5.3 实验仪器 |
| 5.4 实验内容 |
| 5.4.1 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒制备 |
| 5.4.2 叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒的siRNAIGF1R包载与释放性质表征 |
| 5.4.2.1 琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.4.2.2 siRNA~(IGF1R)浓度标准曲线 |
| 5.4.2.3 siRNA~(IGF1R)体外释放 |
| 5.4.2.4 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载纳米粒血清稳定性评估 |
| 5.4.2.5 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载纳米粒血液相容性测定 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 纳米粒的siRNAIGF1R吸附包载能力 |
| 5.5.2 PBS溶液中siRNAIGF1R的浓度标准曲线 |
| 5.5.3 siRNA~(IGF1R)体外释放结果 |
| 5.5.4 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载纳米粒血清稳定性 |
| 5.5.5 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载纳米粒的血液相容性 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载叶酸-生物素-阳离子淀粉纳米粒体外联合抑癌 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验试剂与耗材 |
| 6.3 实验仪器 |
| 6.4 肿瘤细胞培养 |
| 6.5 体外细胞实验 |
| 6.5.1 细胞毒性实验 |
| 6.5.2 叶酸竞争性实验 |
| 6.5.2.1 MTT实验 |
| 6.5.2.2 CLSM成像 |
| 6.5.3划痕实验 |
| 6.5.4 体外细胞摄取 |
| 6.5.5 胞吞抑制剂实验 |
| 6.5.5.1 CLSM成像 |
| 6.5.5.2 FCM实验 |
| 6.5.6 蛋白质免疫印迹 |
| 6.6 实验结果 |
| 6.6.1 siRNA~(IGF1R)和阿霉素共载纳米粒的体外细胞毒性 |
| 6.6.1.1 MTT实验结果 |
| 6.6.1.2 FCM实验结果 |
| 6.6.2 叶酸竞争性抑制 |
| 6.6.2.1 MTT实验结果 |
| 6.6.2.2 CLSM成像结果 |
| 6.6.3 细胞的增殖抑制 |
| 6.6.4 细胞摄取和胞内扩散方式 |
| 6.6.5 细胞摄取机制 |
| 6.6.5.1 CLSM成像结果 |
| 6.6.5.2 FCM实验结果 |
| 6.6.6 目标蛋白抑制能力 |
| 6.7 本章小结 |
| 第七章 全文总结 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.1.1 FBqS NPs的制备与表征 |
| 7.1.2 DOX和siRNAIGF1R共载的FBqS NPs制备与表征 |
| 7.1.3 体外肿瘤细胞抑制 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 研究不足与展望 |
| 7.3.1 研究存在的不足 |
| 7.3.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）HT29细胞结肠癌干细胞抗原负载免疫细胞及其联合中药的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 .结肠癌的发病及其防治 |
| 1.1.1 .结肠癌的发病趋势 |
| 1.1.2 .结肠癌的治疗现状 |
| 1.2 .肿瘤干细胞的概念、特征及分选 |
| 1.2.1 .肿瘤干细胞的概念 |
| 1.2.2 .肿瘤干细胞的特征 |
| 1.2.3 .肿瘤干细胞的分离与鉴定 |
| 1.3 .靶向肿瘤干细胞的治疗策略 |
| 1.3.1 .单克隆抗体的治疗 |
| 1.3.2 .靶向肿瘤干细胞信号传导通路、耐药和凋亡的治疗 |
| 1.3.3 .免疫细胞的治疗 |
| 1.4 .中药在恶性肿瘤治疗中的作用 |
| 1.5 .本论文研究目的及意义 |
| 第2章 结肠癌HT29细胞干细胞特异性生物标志CD133的鉴定 |
| 2.1 .引言 |
| 2.2 .实验材料与方法 |
| 2.2.1 .实验材料 |
| 2.2.2 .主要实验仪器 |
| 2.2.3 .结肠癌HT29细胞的复苏培养 |
| 2.2.4 .结肠癌CD133~-细胞和CD133~+细胞的分选 |
| 2.2.5 .流式细胞仪检测HT29细胞中干细胞(CD133~+细胞)的比例 |
| 2.2.6 .克隆形成实验检测结肠癌细胞的克隆形成率 |
| 2.2.7.结肠癌细胞裸鼠成瘤实验 |
| 2.2.8 .结肠癌移植瘤组织HE染色 |
| 2.2.9 .RT-PCR检测裸鼠移植瘤中CD133表达 |
| 2.2.10 .统计学分析 |
| 2.3 .结果 |
| 2.3.1 .结肠癌HT29细胞克隆形成实验结果 |
| 2.3.2 .结肠癌细胞裸鼠致瘤实验结果 |
| 2.3.3 .结肠癌裸鼠移植瘤HE染色结果 |
| 2.3.4 .RT-PCR检测裸鼠移植瘤CD133表达结果 |
| 2.4 .讨论 |
| 2.4.1 .肿瘤干细胞的发现 |
| 2.4.2 .肿瘤干细胞的分离与鉴定 |
| 2.5 .本章小结 |
| 第3章 负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对结肠癌干细胞体外杀伤的研究 |
| 3.1 .引言 |
| 3.2 .实验材料与方法 |
| 3.2.1 .实验材料 |
| 3.2.2 .主要实验仪器 |
| 3.2.3 .CD133特异性抗原的制备 |
| 3.2.4 .DC的制备与细胞免疫表型的检测 |
| 3.2.5 .CIK细胞的制备与细胞免疫表型的检测 |
| 3.2.6 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对HT29细胞及CD133~+细胞的体外杀伤实验 |
| 3.2.7 .统计学分析 |
| 3.3 .结果 |
| 3.3.1 .肿瘤干细胞总RNA和全细胞裂解物的制备与鉴定 |
| 3.3.2 .AC133原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3.3 .AC133重组慢病毒感染结果 |
| 3.3.4 .CIK和DC细胞的形态 |
| 3.3.5 .DC细胞和CIK细胞免疫表型分析 |
| 3.3.6 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对HT29细胞的体外杀伤作用 |
| 3.3.7 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞干细胞的体外杀伤作用 |
| 3.3.8 .负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞及其干细胞杀伤活性的比较 |
| 3.4 .讨论 |
| 3.4.1 .肿瘤干细胞特异性抗原的制备 |
| 3.4.2 .AC133重组慢病毒表达体系的构建 |
| 3.4.3 .肿瘤免疫细胞治疗 |
| 3.5 .本章小结 |
| 第4章 槐耳颗粒及山药提取物联合DC-CIK细胞对结肠癌HT29细胞中肿瘤干细胞比例的影响 |
| 4.1 .引言 |
| 4.2 .实验材料与方法 |
| 4.2.1 .实验材料 |
| 4.2.2 .主要实验仪器 |
| 4.2.3.细胞毒性实验 |
| 4.2.4 .流式细胞仪检测结肠癌HT29细胞干细胞比例 |
| 4.2.5 .DC-CIK细胞对槐耳颗粒与山药提取物作用HT29细胞前后杀伤作用的检测 |
| 4.2.6 .统计学分析 |
| 4.3 .结果 |
| 4.3.1 .槐耳颗粒和山药提取物对结肠癌HT-29细胞形态的影响 |
| 4.3.2 .槐耳颗粒和山药提取物对结肠癌HT-29细胞增殖抑制的影响 |
| 4.3.3 .槐耳颗粒和山药提取物对结肠癌HT-29细胞干细胞(CD133~+细胞)表达的影响 |
| 4.3.4 .DC-CIK细胞对槐耳颗粒和山药提取物作用HT-29细胞前后杀伤作用的比较 |
| 4.3.5 .DC-CIK细胞对槐耳颗粒和山药提取物作用HT-29细胞前后CD133~+细胞比例变化的比较 |
| 4.4 .讨论 |
| 4.4.1 .槐耳颗粒在恶性肿瘤中的治疗 |
| 4.4.2 .山药在恶性肿瘤中的治疗 |
| 4.5 .本章小结 |
| 第5章 负载CD133特异性抗原的DC-CIK细胞、中药及化疗药联合DC-CIK细胞的体内药效研究 |
| 5.1 .引言 |
| 5.2 .实验材料与方法 |
| 5.2.1 .实验材料 |
| 5.2.2 .主要实验仪器 |
| 5.2.3 .建立结肠癌干细胞(CD133~+细胞)裸鼠模型 |
| 5.2.4 .结肠癌干细胞荷瘤裸鼠的免疫治疗 |
| 5.2.5 .流式细胞术检测血清T淋巴细胞亚群 |
| 5.2.6 .ELISA法检测血清细胞因子的含量 |
| 5.2.7 .结肠癌移植瘤组织HE染色 |
| 5.2.8 .免疫组化检测移植瘤组织中Bcl-2与Bax的蛋白表达 |
| 5.2.9 .用 RT-PCR检测相关信号通路关键基因表达水平的变化 |
| 5.2.10 .统计学处理 |
| 5.3 .结果 |
| 5.3.1 .结肠癌裸鼠动物模型 |
| 5.3.2 .荷瘤裸鼠生存状况比较 |
| 5.3.3 .对荷瘤裸鼠抑瘤的影响 |
| 5.3.4 .荷瘤裸鼠T淋巴细胞亚群检测结果 |
| 5.3.5 .荷瘤裸鼠血清细胞因子检测结果 |
| 5.3.6 .荷瘤裸鼠肿瘤病理学检测结果 |
| 5.3.7 .瘤体凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax表达结果 |
| 5.3.8 .信号通路关键基因表达水平的结果 |
| 5.4 .讨论 |
| 5.4.1 .结肠癌治疗面临的挑战 |
| 5.4.2 .结肠癌干细胞荷瘤裸鼠治疗的实验研究 |
| 5.4.3 .荷瘤裸鼠实验作用机制的研究 |
| 5.5 .本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 6.1 .结论 |
| 6.2 .创新点 |
| 6.3 .展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 发表论文获奖和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（8）卵巢子宫内膜异位症与卵巢恶性肿瘤相关分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、一般临床特征的研究 |
| 1.1 研究资料与方法 |
| 1.1.1 收集资料 |
| 1.1.2 纳入标准 |
| 1.1.3 排除标准 |
| 1.1.4 分组 |
| 1.1.5 研究方法 |
| 1.1.6 诊断标准 |
| 1.1.7 临床分期 |
| 1.1.8 组织学分型 |
| 1.1.9 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 发病率 |
| 1.2.2 发病年龄 |
| 1.2.3 临床症状 |
| 1.2.4 术前血清CA125测定 |
| 1.2.5 肿瘤大小 |
| 1.2.6 FIGO分期 |
| 1.2.7 病理组织学类型 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1EMs的恶变率 |
| 1.3.2 EAOC与年龄的关系 |
| 1.3.3 EAOC与血清CA125浓度的关系 |
| 1.3.4 EAOC的临床病理学特点 |
| 1.3.5 卵巢EMs与卵巢癌的关系 |
| 二、EAOC的预后及其影响因素的研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 收集资料 |
| 2.1.2 纳入标准 |
| 2.1.3 排除标准 |
| 2.1.4 随访 |
| 2.1.5 病理学诊断、分期及组织学分型标准 |
| 2.1.6 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 年龄 |
| 2.2.2 主诉症状 |
| 2.2.3 辅助检查 |
| 2.2.4 手术方式 |
| 2.2.5 术后化疗 |
| 2.2.6 病理学分型 |
| 2.2.7 FIGO分期 |
| 2.2.8 随访结果 |
| 2.2.9 患者生存情况 |
| 2.2.10 预后影响因素 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 卵巢EMs相关性恶性肿瘤的治疗 |
| （1）手术治疗 |
| （2）放疗和化疗 |
| （3）生物治疗 |
| （4）中西医结合治疗 |
| 2.3.2 影响卵巢EMs相关性恶性肿瘤预后的因素 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 子宫内膜异位症恶变的研究新进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）肿瘤细胞免疫治疗项目投资的策划与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 项目研究的意义 |
| 1.3 论文研究内容与结构 |
| 第2章 相关理论综述及公司和项目简介 |
| 2.1 相关理论综述 |
| 2.1.1 市场营销组合(4PS)理论 |
| 2.1.2 整合营销的4C理论 |
| 2.1.3 SWOT分析法 |
| 2.1.4 投资创业相关理论 |
| 2.2 公司简介 |
| 2.2.1 投资法人代表 |
| 2.2.2 公司的业务范围 |
| 2.3 战略目标及规划 |
| 2.3.1 总体目标 |
| 2.3.2 具体目标 |
| 2.4 企业管理团队和组织结构 |
| 2.4.1 项目管理团队 |
| 2.4.2 项目合作中心组织架构 |
| 2.4.3 竞争机制 |
| 2.4.4 激励体系 |
| 2.4.5 培训制度 |
| 2.5 技术产品及运行模式 |
| 2.5.1 细胞免疫治疗技术 |
| 2.5.2 项目技术创新点 |
| 2.5.3 产品特性及用途 |
| 2.5.4 细胞治疗运行模式 |
| 2.5.5 GMP实验室相关要求 |
| 第3章 市场分析与竞争态势分析 |
| 3.1 行业分析 |
| 3.1.1 我国城乡及不同类型地区居民肿瘤患病率分析 |
| 3.1.2 我国城乡地区居民疾病肿瘤两周患病率按年龄分析 |
| 3.1.3 我国肿瘤患者死亡率分析 |
| 3.1.4 肿瘤细胞免疫治疗市场概况 |
| 3.2 竞争分析 |
| 3.2.1 主要竞争对手概况 |
| 3.2.2 CPM矩阵分析 |
| 3.2.3 SWOT分析模型 |
| 3.3 目标市场分析 |
| 3.3.1 目标市场消费群体构成 |
| 3.3.2 目标市场规划 |
| 第4章 目标市场需求预测与营销策略 |
| 4.1 市场需求预测 |
| 4.2 市场销售计划 |
| 4.3 营销策略 |
| 4.3.1 影响营销策略的因素分析 |
| 4.3.2 肿瘤细胞免疫治疗的整合营销 |
| 4.3.3 整合营销战略的具体实施 |
| 第5章 项目的财务规划 |
| 5.1 投资计划及融资方案 |
| 5.1.1 投资的财务环境假设 |
| 5.1.2 资本结构组成 |
| 5.1.3 融资方案 |
| 5.1.4 五年投资计划 |
| 5.2 运营成本与利润预测 |
| 5.3 财务状况分析 |
| 5.4 投资可行性分析 |
| 5.4.1 现金流分析 |
| 5.4.2 投资回收期分析 |
| 5.4.3 盈亏平衡点分析 |
| 5.4.4 投资净现值NPV动态分析 |
| 5.4.5 投资的敏感性分析 |
| 5.5 财务风险总结 |
| 第6章 项目投资风险分析与风险控制 |
| 6.1 专利技术风险与应对措施 |
| 6.2 市场风险与应对措施 |
| 6.3 财务风险与应对措施 |
| 6.4 管理风险与应对措施 |
| 6.5 环境政策风险与应对措施 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一节 肝癌概述 |
| 第二节 现代医学文献部分 |
| 1.肝癌的流行病学 |
| 2.肝癌的病因研究 |
| 3.肝癌分子与细胞生物学 |
| 4.肝癌的生物治疗 |
| 5.p53基因与肝癌的研究进展 |
| 6.原发性肝癌细胞凋亡的研究进展 |
| 第三节 中医学对肝癌的认识 |
| 1.肝癌的临床表现及中医学描述 |
| 2.肝癌的病因病机 |
| 第四节 抗肝癌中草药研究进展 |
| 第五节 疏肝清毒汤应用于诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的思路 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 疏肝清毒汤对HepG-2细胞的毒性作用实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 疏肝清毒汤对HepG-2细胞生长曲线的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 疏肝清毒汤对HepG-2细胞AFP分泌的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 疏肝清毒汤对HepG-2细胞ALT和LDH的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 AO/EB荧光染色法测定疏肝清毒汤诱导HepG-2细胞凋亡 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七 疏肝清毒汤对细胞凋亡调控基因p53的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八 疏肝清毒汤对HepG-2肝癌细胞的Fas/FasL表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 主要创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 外文缩略语表 |
| 致谢 |
四、肿瘤生物治疗的某些新进展和新领域（论文参考文献）
- [1]免疫检查点抑制剂对乳腺癌的治疗效果观察[D]. 鹿瑶. 吉林大学, 2021(01)
- [2]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [3]基于网络药理学优化的三阴方干预EMT抑制三阴乳腺癌转移机制研究[D]. 翁洁琼. 中国中医科学院, 2020(01)
- [4]纳米载体介导的PiggyBac转座子制备CAR-NK细胞[D]. 岳冉. 新乡医学院, 2020(12)
- [5]基于纳米抗体的CD19 CAR-T细胞靶向抗肿瘤作用研究[D]. 汤卓然. 广西医科大学, 2019(08)
- [6]共载阿霉素和siRNA的自组装叶酸—生物素—季铵化阳离子淀粉纳米粒的制备及体外协同抗肿瘤研究[D]. 李良萍. 安徽师范大学, 2019(01)
- [7]HT29细胞结肠癌干细胞抗原负载免疫细胞及其联合中药的干预研究[D]. 孙雯雯. 天津大学, 2017(10)
- [8]卵巢子宫内膜异位症与卵巢恶性肿瘤相关分析[D]. 崔稳丽. 天津医科大学, 2016(03)
- [9]肿瘤细胞免疫治疗项目投资的策划与分析[D]. 卢斌. 兰州理工大学, 2013(06)
- [10]疏肝清毒汤诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡及其机制的实验研究[D]. 李姵萱. 广州中医药大学, 2011(09)