一、乙酰胆碱受体抗体脑室内注射影响大鼠EEG的机制探讨（论文文献综述）
李威[1]（2021）在《下丘脑多巴胺受体参与手十二井穴刺络放血促进重型颅脑创伤大鼠苏醒的作用和机制研究》文中指出目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）后昏迷是神经外科常见急危重症,具有高致残死率的特点。TBI后昏迷患者能否尽快苏醒是影响临床预后的重要因素,且如何促醒是国内外神经科学界研究的热点和难点。手十二井穴刺络放血（简称井穴放血）是中医传统的急救促醒技术,本团队应用该法治疗中枢神经损伤开展多个临床试验证实井穴放血法可安全、有效改善TBI、中风及一氧化碳中毒患者急性期的意识水平,但其促醒机制尚未阐明,限制了该疗法的临床应用与推广。课题组前期研究基于井穴放血对TBI后昏迷大鼠有效促醒效应,发现该法可上调TBI后昏迷大鼠腹侧中脑导水管周围灰质（ventral Periaqueductal gray,v PAG）的P2RX7神经元表达、P2RX7和多巴胺（Dopamine,DA）神经元的兴奋性;通过脑室内注射拮抗剂发现脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3及TRPV1介导手十二井穴放血促醒。本研究围绕v PAG的P2RX7受体及多巴胺神经元向下丘脑投射的多巴胺受体进一步阐释井穴放血促进TBI后昏迷大鼠苏醒的生物学机制。方法:1.复制井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应平台（1）复制重型TBI后昏迷大鼠平台:筛选32只健康成年（8周）雄性（Sprague Dawley,SD）大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（TBI组）、TBI+井穴放血组（Hand Acu组）,假手术组+井穴放血组（Sham+Hand Acu组）,样本量每组8只。Sham组仅打开颅窗而不进行撞击;TBI组则是打开颅窗后利用电子控制性脑皮质撞击仪（electricity Controlled cortical impact,e CCI）制备重型TBI大鼠模型。根据I-VI级意识状态分级量表进行评级,把符合V、VI级昏迷意识状态TBI大鼠纳入实验;Sham组和TBI组均不给予井穴放血治疗,Hand Acu组、Sham+Hand Acu组在相应造模成功基础上立即给予手十二井穴放血干预治疗,疗效评价主要指标是实时观察实验大鼠的昏迷时程。（2）引入脑电监测技术初步探索基于脑电监测评价井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应:筛选6只健康成年（8周）雄性SD大鼠随机分成TBI组、Hand Acu组,样本量每组3只。造模成功后给予安装脑电监测电极连接到Power Lab生物信号采集系统上进行实时脑电监测。利用Mathlab软件提取Alpha、Beta、Delta、Theta波的相对频带能量,并计算Alpha/Theta波相对频带能量的比值来量化井穴放血促醒效应。2.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导井穴放血促醒的研究前期结果发现井穴放血可提高造模后1 h v PAG部位的P2RX7的表达及其兴奋性。故本实验进一步探讨v PAG核团注射P2RX7拮抗剂后观察井穴放血的促醒效应是否消失,以明确v PAG核团的P2RX7受体是否介导井穴放血促醒。实验动物分为4组（n=6只/组）:TBI+DMSO组、Hand Acu+DMSO组、TBI+P2RX7拮抗剂组、Hand Acu+P2RX7拮抗剂组,所有分组均在v PAG核团注射30min后进行造模,其中,Hand Acu+DMSO组、Hand Acu+P2RX7拮抗剂组在行v PAG核团注射及造模成功的基础上进行井穴放血干预。疗效评价指标为实时观察实验大鼠的昏迷时程和改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,m NSS）,评估造模后6h大鼠神经功能缺损情况。3.井穴放血对下丘脑多巴胺受体表达的影响研究实验二明确了v PAG脑区P2RX7受体介导井穴放血促醒。课题组前期研究发现v PAG脑区DA神经元表达P2RX7受体,且井穴放血可提高v PAG脑区DA神经元、P2RX7神经元的兴奋性。既往文献报道v PAG的DA神经元可直接投射到下丘脑外侧区（lateral hypothalamus,LH）的食欲素（orexin,ORX）神经元以维持觉醒,下丘脑乳头结节核脑区（tuberomammillary nucleus,TMN）组胺神经元（Histamine,HA）接受多巴胺调节在调控睡眠觉醒中发挥重要作用。因此,本研究进一步探讨井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核脑区多巴胺受体表达量的影响。采用RT-q PCR技术检测造模及井穴放血干预后1h下丘脑多巴胺受体D1（Dopamine receptor D1,DRD1）、多巴胺受体D2（Dopamine receptor D2,DRD2）、多巴胺受体D3（Dopamine receptor D3,DRD3）的基因含量;采用免疫荧光染色方法,DRD1/DRD2/DRD3+DAPI共染,分别检测下丘脑部位LH及TMN核团多巴胺受体的表达情况。4.井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2神经元兴奋性的调控研究本实验探讨了井穴放血对下丘脑LH及TMN区的DRD2神经元的调控作用。采用Sham组、TBI组、Hand Acu组分组设置,采用多重免疫荧光染色方法检测DRD2+cFos+DAPI共染情况,样本量每组n=4,观察井穴放血干预后下丘脑LH及TMN区DRD2表达情况;同时应用Image J检测LH及TMN区的DRD2神经元的兴奋性。另外,选取Hand Acu组样本进行Orexin+DRD2+DAPI、Orexin+c-Fos+DAPI共染,明确下丘脑LH脑区ORX神经元是否表达DRD2受体及井穴放血是否可激活ORX神经元表达c-Fos蛋白。为进一步明确井穴放血是否可激活ORX神经元,选取Sham组、TBI组、Hand Acu组样本（n=4）进行Orexin+c-Fos+DAPI共染。此外,选取Sham组、TBI组、Hand Acu组样本（n=4）进行组胺神经元免疫组化染色,观察井穴放血疗法对TMN脑组胺神经元的影响。结果:1.井穴放血可缩短重型颅脑创伤后昏迷大鼠的昏迷时间本实验观察井穴放血对TBI大鼠昏迷时程的影响,结果发现:（1）假手术+井穴放血组与假手术组相比,昏迷时程无明显变化,提示井穴放血对水合氯醛所致昏迷无促醒作用。大鼠TBI造模,TBI组的昏迷时程与假手术组相比明显升高,提示TBI大鼠模型复制成功。井穴放血干预后,昏迷时程缩短。以上结果说明井穴放血可促进TBI后昏迷大鼠苏醒。（2）脑电图显示,大鼠在昏迷时期脑电呈慢波、波幅高为特点;清醒时期脑电波频率较昏迷时期快、波幅较昏迷时期低为特点。脑电数据分析显示,TBI造模及井穴放血干预后30-40min,TBI组与井穴放血组脑电Alpha/Theta波相对频带能量的比值变化不明显。TBI组造模后40min开始到100min大鼠Alpha/Theta波相对频带能量的比值持续低平。井穴放血干预后40-100min,Alpha/Theta波相对频带能量比值均较TBI组高（升高8.73～19.47%）。以上结果提示井穴放血可一定程度改善TBI后昏迷大鼠的意识。2.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导井穴放血促醒TBI组与TBI+P2RX7拮抗剂组相比,昏迷时程无明显变化,提示P2RX7拮抗剂对TBI大鼠昏迷时程无明显影响。井穴放血组与TBI组相比,井穴放血干预后可明显缩短TBI大鼠昏迷时间且有统计学意义;其与TBI+P2RX7拮抗剂组相比,也可明显缩短TBI大鼠昏迷时间且有统计学意义。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与井穴放血组相比,大鼠昏迷时程升高有统计学意义;井穴放血+P2RX7拮抗剂组与TBI组及TBI+P2RX7拮抗剂组相比,昏迷时间均无统计学意义。在m NSS评分方面:井穴放血组与TBI组及TBI+P2RX7拮抗剂组相比,6h m NSS评分得到改善。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与井穴放血组相比,m NSS评分有一定升高,但无统计学差异。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与TBI组、TBI+P2RX7拮抗剂组相比,m NSS评分有一定下降,但无统计学差异。以上实验结果提示,v PAG的P2RX7受体信号通路可能介导井穴放血的促醒效应。3.井穴放血可提高下丘脑LH及TMN脑区DRD2的表达量下丘脑多巴胺受体基因含量检测结果显示,井穴放血干预后1h下丘脑DRD1、DRD2、DRD3基因含量均明显升高且有统计学意义。免疫荧光染色结果显示,井穴放血干预后1h在下丘脑LH及TMN区DRD2有大量表达,DRD1、DRD3无表达。荧光定量结果显示,在下丘脑LH区,与假手术组相比,造模后TBI组DRD2下降有统计学意义;井穴放血组与TBI组相比,井穴放血干预后DRD2升高有统计学意义;井穴放血组与假手术组相比,DRD2升高有统计学意义。在TMN区,TBI组与假手术组相比,造模后DRD2下降不明显;井穴放血干预后,与TBI组相比,井穴放血组DRD2升高有统计学意义;井穴放血组与假手术组相比,DRD2升高29.36%,但无统计学差异。实验结果表明,井穴放血可上调下丘脑LH及TMN脑区DRD2的表达量。4.井穴放血可提高下丘脑LH及TMN区DRD2神经元兴奋性下丘脑LH及TMN区多重免疫荧光染色结果分析显示:井穴放血干预后,TBI后昏迷大鼠下丘脑LH及TMN区DRD2神经元兴奋性明显升高且有统计学意义。共染结果发现LH区ORX神经元表达DRD2,井穴放血使LH区ORX神经元与c-Fos共染率达81.6%的（0.816±0.020）;且井穴放血可显着上调下丘脑LH区ORX神经元的表达量。下丘脑TMN的组胺组化结果显示,与假手术组比,TBI组造模后1h下丘脑TMN区组胺神经元表达增多;与TBI组比,井穴放血干预后,可显着下调1h下丘脑TMN区组胺神经元的表达量。以上实验结果表明井穴放血可增加下丘脑LH及TMN核团DRD2神经元兴奋性;LH核团食欲素神经元表达DRD2,井穴放血可上调LH核团ORX神经元表达,并兴奋ORX神经元;井穴放血可下调放血干预后1h下丘脑TMN区组胺神经元表达。结论:1.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导手十二井穴放血促醒作用。2.手十二井穴放血可增加下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2表达及其神经元兴奋性,可能是井穴放血促醒的作用环节之一。3.井穴放血可上调下丘脑外侧区食欲素神经元数量,抑制下丘脑乳头结节核区组胺神经元数量;但其介导井穴放血促醒机制尚需进一步验证。
庞钰洁[2]（2021）在《下丘脑orexin神经元-蓝斑底核神经通路的活动特征及功能研究》文中研究指明睡眠和觉醒是维持人体生存所必须且反复交替的两种生理状态,涉及了复杂的神经机制。Kleitman团队在1953年第一次通过脑肌电以及眼肌电记录发现了REM睡眠,即出现与觉醒类似的活跃脑电并同时伴随着骨骼肌的强烈抑制。其与慢波睡眠的生理表现及神经机制截然不同,因此被确立为睡眠过程中一个具有典型特征的独立时相。值得注意的是下丘脑作为脑内重要且复杂的稳态中枢,富含着不同种类的神经元群整合体内外信号进而共同协调调控人体生理活动。其中的orexin神经元局限分布在外侧下丘脑区及穹窿周区,接收众多脑区的输入并向全脑发送广泛投射,与不同核团形成不同的神经环路发挥着其多样性的调节作用。在哺乳动物、两栖动物以及模式生物的下丘脑中都发现了具有类似分布的orexin神经元群,也说明了该神经元在动物的发育中具有高度保守性,扮演着至关重要的角色。鉴于orexin神经元发送大量投射至觉醒相关的单胺能核团,并且orexin能神经系统发生缺陷时主要导致嗜睡症状,因此以往的研究更多关注其作为觉醒肽在睡眠/觉醒周期中的调控作用。但在随后的研究中也发现orexin神经元能够直接投射到REM睡眠产生和维持的主要结构即脑桥被盖处的SLD核团,提示存在这样一条特定的下丘脑orexin神经元到脑干SLD核团的神经通路参与REM睡眠的复杂调控。值得注意的是,本课题组前期研究表明,调控REM睡眠的关键脑区SLD不仅有orexin能纤维的分布还存在orexin受体的表达,进一步采用光遗传学及化学遗传学技术均证明了下丘脑orexin能神经系统可以通过直接支配SLD进而参与调节REM睡眠脑肌电的稳定。不同于以往发现的orexin神经元在睡眠/觉醒调控中产生的促觉醒作用,本研究更进一步地关注这群特异性投射至SLD的orexin神经元在睡眠/觉醒周期中具有什么样的活动特征,从而参与了睡眠/觉醒的调控。这群特异性投射的orexin神经元是否形成了一个独特的亚群,而该神经元亚群具有什么样的功能意义,产生这样功能意义的具体神经环路机制又是什么,这些问题都有待详尽研究。综上所述,本文将从投射至SLD的orexin神经元群的活动特征和功能及神经环路机制等方面进行探索。利用CTB逆行示踪技术、神经元激活标记c-Fos免疫组化技术和光纤钙成像技术观察该神经元亚群在睡眠/觉醒期间的主要活动特征。然后采用一系列行为学手段来探索该特定通路的功能意义,进一步明确相关orexin能神经系统整体协调和调控睡眠/觉醒周期的联系。最后结合新型逆行/顺行病毒追踪技术,对与这些神经元存在直接神经联系的上下游脑区进行系统标定,初步研究该神经元亚群的神经环路机制。现将相关结果阐述如下:1.蓝斑底核投射的orexin神经元活动特征的研究（1）LH存在一群特异性支配SLD的orexin神经元本文首先研究了投射至SLD脑区的orexin神经元的数量及分布模式等是否具有其独特性。利用CTB逆行示踪剂追踪到有7.1±0.8%的orexin神经元投射到促REM睡眠核团SLD,并且有15.2±2.1%的orexin神经元投射到促觉醒核团LC。此外,通过统计分析发现分别投射到SLD和LC的orexin神经元仅有1.9±0.3%的重叠（n=6 rats,n=3902 orexin neurons）。上述结果表明确实存在一部分orexin神经元能够特异性投射至SLD,尽管SLD与LC相邻,但根据其下游投射靶点乃至功能的不同能够在下丘脑区域区分出不同的orexin神经元亚群。接下来为了进一步探究分别投射到SLD和LC的orexin神经元分布模式是否具有解剖位置上的特异性,根据大鼠立体定位脑图谱按照由尾端至头端的纵轴方向（AP:-2.30～-3.80 mm）,在每隔200μm的6张冠状脑片上统计orexin神经元的分布数量及位置。结果发现投射到SLD的orexin神经元和投射到LC的orexin神经元与整体orexin神经元分布模式均一致,混杂分布于下丘脑中,且分布数量均是从尾端至头端由少逐渐增多再减少。上述结果提示在SLD区域以及LC区域逆行追踪所标记的orexin神经元在下丘脑中为散在分布,而非特异性分布于特定区域位置。（2）特异性支配SLD的orexin神经元亚群显示REM睡眠相关激活为了进一步明确特异性投射至SLD的orexin神经元亚群是否在睡眠/觉醒周期中具有某种活动特征进而为其下游投射靶点提供驱动力,我们对SLD区域注射CTB逆行示踪剂的大鼠进行72 h的REM睡眠剥夺。第一次REM睡眠出现的2.5 h后,立即对大鼠进行灌注,进行c-Fos免疫荧光染色。发现整体orexin神经元在睡眠剥夺组与对照组中的c-Fos表达量并无显着差异（control:7.1±1.3%,n=4 rats;RSD:6.0±0.6%,n=7 rats;P=0.435）,而特异性投射至SLD的orexin神经元群在睡眠剥夺后的恢复期中c-Fos表达量显着增加(control:6.8±2.8%,n=4 rats;RSD:28.2±2.9%,n=7 rats;P=9.221×10-4)。这部分结果表明不同于整体orexin神经元的活动特点,特异性投射至SLD的orexin神经元群能够在丰富的REM睡眠中表现出更强的活性。（3）特异性支配SLD的orexin神经元亚群在REM睡眠期间钙信号增强为了更加精确地探索特异性投射至SLD的orexin神经元在自然生理状态下的睡眠/觉醒周期中的活动特点,在orexin-Cre转基因小鼠的SLD脑区定位注射逆行转染的病毒AAV-retro-Enf1α-DIO-GCa MP6s-WPRE-p A,使得特异性投射至SLD的orexin神经元标记上绿色荧光。采用光纤钙成像技术记录自由活动小鼠脑内这部分orexin神经元的钙信号强度变化,结果显示特异性投射至SLD的orexin神经元在REM睡眠期间具有明显的荧光变化（ΔF/F:0.46±0.05%）,且显着高于NREM睡眠期间（ΔF/F:0.07±0.02%）,而在觉醒期前荧光变化（ΔF/F:1.27±0.17%）呈现出增高的趋势(n=4 mice,one-way ANOVA;F（2,9）=36.146;P=0.5×10-4;post hoc LSD comparison test;P REM vs NREM=0.0236;P REM vs wakefulness=3.27×10-4;P NREM vs wakefulness=0.16×10-4)。上述结果再次明确,不同于以往所研究的仅在觉醒期间发生激活的orexin神经元,我们所关注的这群特异性投射至SLD的orexin神经元能够在整个REM睡眠过程中处于活跃状态。2.蓝斑底核投射的orexin神经元功能及环路特征的初步研究（1）特异性支配SLD的orexin神经元亚群调控REM睡眠稳定值得注意的是具有如此独特性的这部分orexin神经元在整体睡眠/觉醒调控中到底发挥了什么样的功能呢。我们接下来利用了光遗传学技术在单次REM睡眠中光抑制投射至SLD的orexin能纤维末梢,发现小鼠REM睡眠期间theta能量减少约7.4%（n=9mice,P=0.0325）,并且平均REM睡眠片段时程显着缩短18.2%（n=9 mice,P=0.0363）,而其肌电并未发生明显变化（n=9 mice,P=0.32）。进一步采用ta Casp3病毒特异性长时程损毁投射至SLD的orexin神经元亚群。结果发现,与对照组小鼠相比,ta Casp3组小鼠在REM睡眠期间肌电显着升高(ncontrol=11 mice,nta Casp3=8 mice,control:0.93±0.01,ta Casp3:1.04±0.01;two-sided unpaired t-test;P=0.09×10-4)。进一步小鼠采取24 h REM睡眠剥夺,与对照组小鼠相比,ta Casp3组小鼠在rebound期间出现间断的REM睡眠,主要表现在持续维持一段REM睡眠的能力明显减弱(ncontrol=10 mice,nta Casp3=10mice,wildtype:1.77±0.14;ta Casp3:1.34±0.11;two-sided unpaired t-test;P=0.028),并且出现REM睡眠片段数量增多的现象（wildtype:0.99±0.07;ta Casp3:1.38±0.17;two-sided unpaired t-test;P=0.047）。故长时间缺失此通路对REM睡眠稳态具有显着影响,会使得REM睡眠恢复能力有所减弱。综上所述,这部分实验结果表明SLD中的orexin能信号或特异性投射至SLD的orexin神经元的缺失均对REM睡眠的稳态调控具有明显影响,进一步明确了该条特异性通路能够稳定REM睡眠。（2）特异性支配SLD的orexin神经元亚群的下游投射靶点为进一步明确这群投射至SLD的orexin神经元亚群在睡眠/觉醒调控中是通过驱动哪些下游投射靶点进而发挥稳定REM睡眠的作用。故采用orexin-Cre转基因小鼠,在其SLD区域进行立体定位注射,将特异性投射至SLD的orexin神经元表达上红色荧光蛋白,通过荧光蛋白的免疫荧光染色和显微镜下的纤维成像,可系统分析其直接投射的下游靶点。结果发现该orexin神经元亚群仅仅只投射至SLD和与其相邻的LC,在其它REM睡眠相关脑区PNO、LDT以及觉醒相关脑区PVT均不发送纤维投射（n=2 mice）。该实验结果也与第一部分实验结果相呼应,更加明确了投射至SLD的orexin神经元亚群的独特性。（3）特异性支配SLD的orexin神经元亚群的上游全脑输入上述实验结果已表明特异性支配SLD的orexin神经元几乎是单位点投射的且在REM睡眠期具有特定的活动特征,为进一步研究具有如此独特性的orexin神经元亚群的神经环路基础。同样采用orexin-Cre转基因小鼠,首先在其SLD区域进行立体定位注射,标记出投射至SLD的orexin神经元亚群。再采用逆行病毒追踪技术追踪该神经元亚群的上游全脑输入,通过初步研究发现与整体orexin神经元的全脑输入分布相比,这群特异性投射至SLD的orexin神经元可能更多地接受了ZI和DMH脑区的输入（n=2mice）。综上所述,本研究发现下丘脑中有一部分orexin神经元是能够特异性投射至REM睡眠关键脑区SLD,可能接受来自其他脑区不同数量的输入,在REM睡眠期间激活下游投射靶区进而在睡眠/觉醒周期中发挥调控功能。此外,特异性抑制或损毁该orexin神经元亚群将会导致REM睡眠不稳定从而影响整体睡眠/觉醒稳态。故本研究揭示了下丘脑orexin神经元-脑干SLD通路调控REM睡眠的相关活动特点、功能意义及环路机制,为进一步明确相关orexin能神经系统整体协调和调控睡眠/觉醒整体稳态提供新的研究方向。
岳瑞珍[3]（2021）在《热敏灸对AD模型大鼠Aβ转运代谢功能的研究》文中研究说明研究目的本研究以Aβ1-42诱导的AD模型大鼠为对象,用艾灸的方法,观察艾灸热敏与否对AD模型大鼠认知行为、海马神经元的形态、Aβ代谢转运酶的影响,探讨热敏灸对AD模型大鼠的干预效果及作用机制。研究方法本实验研究采用雄性SD大鼠为对象,适应3d后,将其随机分为空白对照组（A组）,假手术组（B组）,其余予以Aβ1-42进行诱导来造模。AD模型建立方法:使用3%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉,麻醉后剃除其位于颅顶部位的毛发以便后续进一步手术,再采用脑立体定位仪固定大鼠脑部,并用碘伏对大鼠的伤口消毒,将其皮下肌肉组织与皮毛分离后,用洁净的干棉球拭去其残留血迹,将其颅骨中线及前囟暴露。参照包新民《大鼠脑立体定位图谱》,侧脑室注射位点以前囟为基点,后移0.8mm,中线旁开1.2mm,以牙科钻钻开颅骨,用10μL微量注射器自脑表面垂直向下进针4 mm,回针1mm,预留一定的注射空间,左右两侧分别缓慢注入5μL的Aβ1-42(含5μg Aβ1-42),5min内注射完毕,注射后留针5min以保证溶液充分弥散后缓慢撤针。手术尾声时以骨蜡密封手术所造成的骨窗,并随即以青霉素在其局部进行喷洒以达到消毒的目的,最终将事先分离的皮肤进行缝合。值得注意的是,在整个手术过程内,接受手术的大鼠体温应当保持在36.5-37.5℃的恒定范围之内。通过水迷宫实验进一步筛选出造模成功的AD模型大鼠,并将其分为AD模型组（C组）,阳性对照组（G组）,其余大鼠给予艾灸治疗。艾灸组每天艾灸1次,每次艾灸40分钟;阳性对照组每天给予药物1次;治疗共持续28天。根据艾灸热敏程度自然分为艾灸热敏组（D组）、艾灸不热敏组（E组）、艾灸迟发热敏组（F组）。艾灸热敏组（D组）:艾灸治疗过程中平均尾温升高>1℃;在采取艾灸手段对AD模型大鼠进行治疗之前,按照实验大鼠腧穴图谱中的定位,事先将大鼠“大椎”穴处的毛发剃去。整个治疗过程之中,将艾条（江西中医药大学附属医院,规格:直径1cm,长12cm,）垂直悬空于“大椎”穴约3 cm的高处予以温和灸,1次/日,每次持续灸40min,共28天。同时将室温控制于25±2℃的恒定温度。艾灸开始前,大鼠被置于特制鼠笼中安静30分钟。用医用红外额温计（调为物温模式）分别在艾灸准备开始前及艾灸开始后每5分钟测量一次大鼠中段的尾温,直至第40分钟,艾灸结束。大鼠尾温为同一时间点3次测量的平均温度。艾灸不热敏组（E组）:艾灸治疗过程中平均尾温升高≤1℃;操作步骤与艾灸热敏组相同。艾灸迟发热敏组（F组）:艾灸治疗过程中前7天平均尾温升高≤1℃,后随着治疗时间的延长,逐渐出现平均尾温升高>1℃;操作步骤与艾灸热敏组相同。阳性对照组（G组）:给予模型大鼠多奈哌齐0.5mg/kg/d腹腔注射。在28d疗程结束后,以水迷宫法对每组大鼠的行为学展开观测。并采取HE组织切片染色法对每组大鼠海马区的神经元形态与排列情况进行观测。采用ELISA法检测各组大鼠脑组织中α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶含量。同时采用Western Blot法对每组大鼠海马组织中的IDE、NEP、ECE-1、ACE2、LPL、Apo E、LRP1、RAGE和RAP蛋白表达情况进行检测。研究结果1.水迷宫法观测结果:假手术组大鼠与对照组相比,水迷宫逃避潜伏期、第六天穿越次数、平台象限时间占比均无显着差异。与模型组相比,艾灸热敏组第1～5d的逃避潜伏期降低明显,第六天水迷宫穿越次、平台象限时间占比均显着升高,结果同阳性对照组;艾灸不热敏组与艾灸迟发热敏组大鼠水迷宫逃避潜伏期变化无统计学意义,艾灸迟发热敏组大鼠水迷宫第六天水迷宫穿越次数与平台象限时间占比显着性升高,艾灸不热敏组大鼠水迷宫平台象限时间占比显着升高。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组的逃避潜伏期明显缩短,第六天水迷宫穿越次数和平台象限时间占比均显着性升高,而艾灸迟发热敏组逃避潜伏期无明显改变,第六天水迷宫穿越次数和平台象限时间占比均显着性升高。2.HE组织切片染色法观测结果:对照组与假手术组大鼠的海马神经元及其胶质细胞未出现异常现象且其排列均匀整齐,细胞质丰富,无间质出血,无坏死。而AD模型组大鼠的脑组织出现严重损伤的现象,具体表现为其神经元细胞的排列出现一定程度上的紊乱,且其细胞形态出现严重的肿胀及变形,同时神经元大量丢失,严重者出现神经元大量死亡,并伴随有部分细胞核出现溶解、固缩的现象。与AD模型组大鼠相比,进行治疗后,各组大鼠的脑组织损伤出现减轻的现象,其中艾灸热敏组和阳性对照组减轻明显,脑组织形态较正常,无炎细胞浸润,排列整齐;迟发热敏组的细胞紊乱和炎症细胞浸润程度也有所减轻;艾灸不热敏组无明显改善。HE半定量评分显示:与模型组相比,艾灸热敏组、艾灸迟发热敏组与阳性对照组大鼠脑组织HE半定量评分显着下降,艾灸不热敏组大鼠脑组织HE半定量评分变化无统计学意义。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组和艾灸迟发热敏组大鼠脑组织HE半定量评分显着下降,差异有统计学意义;且艾灸热敏组优于艾灸迟发热敏组。3.ELISA法测定结果:与对照组比较,模型组大鼠脑海马组织中α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶含量均显着升高;与模型组比较,艾灸热敏组、艾灸迟发热敏组和阳性对照组大鼠脑组织中β-分泌酶、γ-分泌酶含量均有不同程度的降低,α-分泌酶的含量均有不同程度的升高,而艾灸不热敏组α-分泌酶无升高,β-分泌酶、γ-分泌酶无下降,差异无统计学意义。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组α-分泌酶的含量明显升高,β-分泌酶、γ-分泌酶含量明显降低;艾灸迟发热敏组β-分泌酶含量明显降低,γ-分泌酶含量下降无统计学意义。4.WB结果显示:与空白对照组大鼠比较,假手术组的大鼠海马组织中的NEP、IDE、ECE-1、ACE2、LPL、Apo E、LRP1、RAGE和RAP蛋白的表达水平均无显着变化,而模型组中IDE、NEP、ECE-1、Apo E、ACE2和LRP1蛋白表达下降明显,RAGE和RAP蛋白的表达水平均呈现出显着的升高现象。而与此同时,LPL蛋白表达水平并无呈现出明显的变化趋势。较之于AD模型组大鼠,艾灸热敏组、艾灸迟发热敏组和阳性对照组的NEP、IDE、ECE-1、ACE2、Apo E和LRP1蛋白的表达水平均呈现出显着的升高现象,且海马组织中RAP、和RAGE蛋白表达水平均明显下降,艾灸不热敏组的大鼠脑海马组织中NEP、ECE-1、ACE2、LPL、Apo E、LRP1和RAP蛋白的表达水平均无显着变化,IDE表达显着升高,RAGE表达显着降低。与艾灸不热敏组比较,艾灸热敏组和艾灸迟发热敏组NEP、ECE-1、ACE2、Apo E、LRP1蛋白表达水平均显着升高,RAP蛋白表达水平均明显下降,而RAGE蛋白表达下降不明显,艾灸热敏组IDE蛋白表达明显升高,艾灸迟发热敏组IDE蛋白表达升高不明显。结论1.热敏灸干预能够提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力。2.热敏灸干预能提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力,可能与其改善AD模型大鼠海马区神经元及胶质细胞的排列结构和形态有关。3.热敏灸干预能提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力,可能与其升高AD模型大鼠海马组织中α-分泌酶的含量,降低β-分泌酶、γ-分泌酶含量从而使Aβ沉积减少有关。4.热敏灸干预能提高AD模型大鼠的空间学习和记忆能力,可能与其调节Aβ转运代谢相关蛋白有关。
乔启城[4]（2021）在《下丘脑orexin-脑桥尾侧网状核和背外侧被盖底核神经通路调控肌张力的功能及机制研究》文中认为下丘脑orexin神经肽系统是睡眠/觉醒周期的重要调控者,其缺陷也导致多种形式的运动障碍。运动功能由神经系统中众多运动结构协调控制完成,大量的研究已经表明,orexin能神经系统对这些运动结构均有直接的纤维投射,提示orexin能神经系统可以通过对它们直接的作用参与运动调控,然而具体的神经通路机制及功能,以及相关的生理意义及其与orexin缺陷导致的运动障碍发病机制之间的关系,都还很不清楚。已有研究表明,在orexin全基因敲除动物的脑桥中导入orexin基因,可以显着改善orexin缺失导致的疾病症状,包括其运动障碍症状。该结果提示脑桥可能是orexin调控运动功能的重要靶点。脑桥中存在一系列参与运动控制的功能核团,包括脑桥尾侧网状核（caudal pontine reticular nucleus,PnC）以及背外侧被盖底核（sublaterodorsal tegmental nucleus,SLD）等。PnC中的兴奋性网状脊髓神经元在觉醒期促进躯体肌张力升高,是此时机体维持姿势的核心因素之一;SLD则与快速眼动睡眠（Rapid eye movement,REM）时正常的肌张力迟缓（muscle atonia）现象密切相关。有意思的是,在orexin缺陷的人或动物不仅存在觉醒期肌张力突然缺失而导致的猝倒（cataplexy）运动障碍,其REM睡眠期的肌张力迟缓状态也受到严重损害,常表现出REM期肌张力异常亢进而致梦境运动行为,被称为快速眼动睡眠行为障碍（rapid eye movement behavior disorder,RBD）。本课题组及其他多个研究者先前的工作也已发现,orexin能神经纤维投射到达PnC和SLD,且orexin确可影响这些脑区的神经元活动,提示orexin能神经系统可能通过这些脑区,对肌张力有复杂的调控模式,因此需要在整体行为背景中,分别对orexin能神经系统投射到PnC和SLD的神经通路的形态和活动特征、相关细胞/分子层面机制、以及具体生理功能意义,展开深入研究。本课题首先关注了下丘脑投射到PnC的orexin能神经通路,并首先采用神经束路示踪明确其形态学特征;在此基础上联合采用电生理学、光纤钙成像、运动行为学、光/化学遗传学以及微透析等技术手段,详细解析了这些神经通路对肌张力调控效应以及功能意义。此外在课题组其他研究也已明确下丘脑-SLD orexin能神经通路形态和活动特征的基础上,对下丘脑orexin-SLD神经通路调控肌张力的功能意义也进行了探索。主要结果如下:1.下丘脑orexin-PnC神经通路的构筑特征及生理学作用（1）特异性投射至PnC的orexin能神经元弥散分布于下丘脑外侧区为明确下丘脑-PnC的orexin能神经通路形态学特征,我们首先采用逆行束路追踪技术,通过在单侧PnC中微量注射CTB Alexa Fluor?555,标记了投射至PnC的神经元。同时,我们也在同一侧的前庭外侧核（lateral vestibular nucleus,LVN）注射CTB Alexa Fluor?488,同步标记投射至LVN的神经元。逆行追踪标记神经元后,通过免疫组织化学染色技术可特异标记其中的orexin能神经元,结果显示确有orexin神经元直接投射至PnC区域,且并未发现这部分orexin能神经元有特异性聚集表达的区域,而是较为弥散地平均分布。为进一步定量分析这些投射至PnC的orexin能神经元的分布特征,我们沿纵轴方向,由尾端至头端覆盖orexin能神经元所定位的下丘脑区域,等间距（200μm）地收取4个冠状切面进行了统计分析。结果显示整体的orexin能神经元,在从尾端至头端的4个位面中的计数数量分别为59.5±5.5、70.5±14.1、144.0±32.9、144.3±42.5（n=4）,而同样的每一切面中,特异性投射到PnC的orexin能神经元数量分别为9±3、11.3±2.0、20.8±2.4、18.8±5.3（n=4）,表明这些orexin能神经元与整体orexin能神经元在纵轴方向的分布趋势较为一致。分析特异性投射到PnC的orexin能神经元占比则表明,在CTB注射位点同侧有17.7±7.8%的orexin神经元投射到PnC,而在注射位点对侧这一比例则为12.3±4.3%,统计分析未发现orexin能神经元对PnC进行投射的同/对侧比例有明显差异（n=4,P>0.05）。为进一步确定投射到PnC的orexin能神经元的特异性,我们用投射到LVN（另一脑干肌张力调控中枢）的orexin神经元进行了对比分析。结果表明,在4只双位点逆行束路追踪的小鼠下丘脑,我们计数到6.8±0.9%的orexin能神经元投射到LVN（n=4）,且它们也在下丘脑弥散地平均分布,而同时计数到14.4±1.0%的orexin能神经元投射到了PnC（n=4）,更为有意思的是,这两部分orexin能神经元几乎不存在重叠,同时投射到这两个脑区被双标的orexin神经元占比仅为1.7±0.3%（n=4）,提示投射到PnC的这部分orexin能神经元很可能构成具备独特功能的亚群。（2）Orexin能纤维末梢和受体广泛分布于PnC区域在对PnC区域进行免疫组织化学荧光染色后,我们也仔细分析了该脑区中orexin能神经纤维形态特征,结果显示在PnC中orexin能神经纤维呈曲张体样分布;相应的orexin受体也在PnC神经元上丰富表达。进一步研究发现表达orexin能受体的神经元大部分为谷氨酸能神经元,而且细胞直径均大于35μm。（3）光遗传学激活PnC中orexin能纤维末梢引起PnC神经元兴奋性反应为了分析orexin-PnC通路的活动是否会对PnC神经元产生影响,我们利用离体膜片钳结合转基因杂交动物orexin-Cre:Ai27D小鼠开展了脑片膜片钳实验。Orexin-Cre:Ai27D小鼠由orexin-Cre小鼠和Cre酶依赖表达Ch R2-td Tomato融合蛋白的报告小鼠杂交而来,前期免疫组织化学荧光染色已证实出生8-14天后,该小鼠orexin能神经元已经大量表达Ch R2-td Tomato融合蛋白。因此在脑片膜片钳实验中,我们通过在荧光显微镜下观察到PnC脑区有td Tomato荧光显示的orexin能纤维末梢情况下,通过蓝光照射（473 nm,20 Hz,5 ms pulses,5 s）对其进行激活后,观察钳制的PnC神经元上膜电位反应,结果发现可引起一个去极化反应,表明orexin-PnC神经通路的活动确能影响PnC神经元的活动。2.下丘脑orexin-PnC神经通路的肌张力调控效应（1）光遗传学激活PnC中orexin能神经纤维末梢促进运动调控功能在解析了orexin-PnC神经通路特征的基础上,我们通过光遗传学方法表达Ch R2并特异性激活这一通路研究其对肌张力的在体调控作用。我们在动物进行加速rota-rod运动行为（4-40 rpm,180 s）测试过程中,通过随机选取重复试验,在动物执行运动行为时进行PnC区域orexin能神经元纤维末梢的光遗传学激活（473 nm,20 Hz）,并与对照重复试验时动物的运动时长进行比较发现,orexin-PnC通路的激活显着增长了动物在加速rota-rod运动中的掉落时间（对照:106.90±14.41 s,蓝光照射:125.49±7.49 s,n=6,P<0.05）,表明该通路的激活促进了PnC介导的运动调控功能。（2）下丘脑orexin-PnC神经通路促进运动调控的在体活动基础为明确orexin-PnC神经通路促进运动调控的功能是否在正常在体情况下发生,我们通过光纤钙荧光信号记录,首先观察了特异投射至PnC的orexin能神经元(orexinPnC)在动物进行加速rota-rod运动时的活动情况。结果显示,在加速rota-rod运动一开始后,orexinPnC神经元的钙荧光信号即快速、大幅度上升,并在动物整个运动期维持在较高的水平(运动开始前500 ms平均钙信号水平:0.54±0.12%,运动起始阶段峰值钙信号水平:6.52±1.24%,PCtrl vs Peak<0.01,运动持续期间平均信号水平:2.86±0.38%,PCtrl vs Lasting<0.01)（n=5）,且常在基线水平上出现钙信号峰。该结果表明orexin-PnC神经通路促进运动调控的功能很可能在正常加速rota-rod运动时即可发生。（3）光遗传学抑制下丘脑-PnC orexin能神经通路在体活动降低了肌张力调控随后通过光遗传学方法表达Arch T并特异性抑制这一通路的结果显示,加速rota-rod运动中通过589 nm黄光持续抑制这一通路确实降低了动物的掉落时间（无光照:49.95±5.07 s,黄光照射:42.58±9.33 s,n=6,P<0.05）,表明orexin-PnC神经通路的内源性活动确可促进运动调控功能。进一步的爪抓力测试表明,光遗传学抑制orexin-PnC神经通路的内源性活动是通过降低PnC介导的肌张力控制（无光照:125.49±7.49 gf,黄光照射:106.90±14.41 gf,n=6,P<0.05）,实现对运动调控的影响。3.下丘脑orexin-PnC神经通路促进肌张力的功能意义（1）正性情绪增强下丘脑orexin-PnC神经通路在调控肌张力过程中的活动为明确orexin-PnC神经通路活动促进肌张力的功能意义,我们进一步对其在体活动进行了观察。通过光纤钙荧光信号成像技术,我们首先发现orexinPnC神经元的钙荧光信号在动物被巧克力诱发的正性情绪时,会显着升高（进食前500 ms信号均值:3.29±1.13%,进食时500 ms信号均值:9.67±2.47%,n=4,P=0.022）。这一现象提示,orexinPnC神经元很可能接受正性情绪调控,并将其整合到调控肌张力时的活动中。我们随后通过建立正性情绪与运动功能之间的操作式条件反射对这一可能性进行了直接验证,结果显示,在动物建立好红光环境下平衡木（balance beam）运动与巧克力奖励相关的操作式条件反射后,此环境的平衡木运动中orexinPnC神经元确实表现出更强水平的钙荧光信号增长（无红光环境:100±32.21%,红光环境:124.56±40.19%,n=4,P=0.023）。考虑到orexin缺陷导致的肌张力突然消失的猝倒症状常由正性情绪诱发,这一结果强烈提示了orexin-PnC神经通路在正性情绪下运动过程中的活动对于此时的肌张力调控有重要意义,缺失就可能导致猝倒症发生。（2）Orexin-KO动物PnC中长时程微透析orexin可减少猝倒发作通过微透析给药方法,为orexin-KO模型小鼠的PnC长时程补入orexin后,长时间观察了在正性情绪诱发物存在的情况下对行为影响,EEG-EMG监测结果则显示,基因敲除小鼠的猝倒样发作频率显着减少（orexin:0.23±0.11次/h,ACSF:0.87±0.3次/h,n=6,P<0.01）,发作的持续时间也明显降低（orexin:20.1±10.6 s/h,ACSF:86.2±21.2 s/h,n=6,P<0.01）,表明局限于PnC中的orexin补充即可挽救猝倒症。4.下丘脑orexin-SLD神经通路调控肌张力的功能意义（1）下丘脑orexin-SLD神经通路对肌张力的下调功能特定影响REM睡眠稳定本部分实验在课题组先前其他研究工作的基础上,首先观察了orexin-SLD神经通路对SLD介导肌张力控制功能的可能影响。结果发现通过神经药理学方法观察orexin对SLD调控的行为学效应。对于每次抓杆中的最大肌张力（maximal force,MF）进行了分析发现orexin可显着抑制大鼠的MF（saline:159.2±10.0 gf,orexin:131.8±13.7gf,P<0.05;n=6）,阻断剂TCS对大鼠肌张力无显着影响（saline:159.2±10.0 gf,TCS:177.3±14.4 gf,n=6,P>0.05）。大鼠抓杆时间,orexin与TCS均无显着差异（saline:1.61±0.14s,orexin:1.49±0.14 s,P=0.179;saline:1.61±0.14 s,TCS:1.65±0.14 s,P=0.685）（n=6）。进一步发现orexin不引起睡眠/觉醒状态的转换,但可促进REM睡眠。与对照组REM睡眠总时长11.7±2.6%相比显着增加（3μM orexin-A:14.1±3.0%,P=0.319;30μM orexin-A:21.2±5.0%,P=0.0468）而阻断剂TCS可以抑制REM睡眠总时长减少到（9.4±2.5%,P=0.0304）（n=6）。统计REM持续时间(saline:36.9±5.6 s,3μM orexin-A:45.1±7.7 s,30μM orexin-A:56.5±8.3 s,TCS 3μM:29.8±5.2 s,Psaline vs 3μM orexin-A=0.175,Psaline vs 30μM orexin-A<0.05,Psaline vs TCS 3μM<0.01)（n=6）,我们发现,orexin-A可显着增加单次REM睡眠时长,阻断剂TCS则可以缩短REM睡眠时长。（2）长时程抑制下丘脑orexin-SLD神经通路诱发RBD肌张力控制障碍为进一步验证结果,我们通过化学遗传学方法长时程抑制下丘脑orexin-SLD神经通路。首先通过离体膜片钳验证CNO可以抑制表达h M4D的orexin神经元活动。EEG-EMG分析发现特异性抑制投射到SLD的orexin神经元,可降低EEG theta功率（溶剂组:409.3±52.3μV2,CNO:372.9±55.6μV2,n=8,P<0.05）但不影响其频率分布,对照病毒EEG theta功率无变化（溶剂组:340.9±113.3μV2,CNO:324.9±99.2μV2,n=5,P=0.518）。分析肌张力变化,发现NREM-REM肌张力下降幅度减弱（溶剂组:93.4±1.6%,CNO:99.0±1.5%,n=8,P<0.01）;对照病毒转换前后肌张力比值无变化（溶剂组:0.93±0.03,CNO:0.94±0.02,n=5,P=0.376）。提示下丘脑orexin-SLD神经通路抑制诱发类似RBD肌张力控制障碍综上所述,本课题证明了下丘脑存在orexin-PnC神经通路,并明确了其对肌张力调控的机制,效应以及功能意义,证明这一通路缺失可导致觉醒期猝倒。此外,我们也明确了REM期SLD调控肌张力的效应及机制,证实orexin缺失可诱发RBD肌张力控制障碍。这两条神经通路缺失导致的引发肌张力控制障碍与嗜睡-猝倒症发病有着密切关系,综上,我们的研究为临床诊断及治疗提供了新的理论依据。
王亚晗[5]（2020）在《参枝苓口服液对拟SAD小鼠的髓鞘保护作用机制研究》文中认为目的伴随社会老龄化,阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）发病率逐年飙升,其中散发性阿尔茨海默病（Sporadic Alzheimer’s Disease,SAD）占95%以上,且病因病机复杂。SAD患者存在中枢神经系统胰岛素抵抗和葡萄糖代谢异常,且不伴外周血糖升高,又被称为“Ⅲ型糖尿病”。“从心论治”代表方参枝苓口服液具有益气温阳,化痰安神的功效,对早中期AD有一定疗效,但机制有待探讨。白质损伤存在于AD全过程,早于淀粉样蛋白（amyloid P-protein,Aβ）沉积和神经纤维缠结（neurofibirilary tangles,NFTs）引起的早期认知障碍。PI3 K/Akt-mTOR信号通路是调控髓鞘相关蛋白,维护髓鞘完整的重要通路。为了从动物整体水平研究参枝苓口服液对SAD的髓鞘保护作用机制,本研究通过双侧侧脑室注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）（icv-STZ）拟SAD模型,观察参枝苓口服液对SAD小鼠学习和记忆保持能力的影响,并基于PI3K/Akt-mTOR通路,在髓鞘厚度、形态完整性和髓鞘相关蛋白形成的功能性脑回路中,探讨参枝苓口服液对于SAD早期的认知保护作用,从中医药角度为阿尔茨海默病早期干预提供实验基础。方法1.30只雄性3月龄C57BL/6J野生型小鼠随机选取15只双侧侧脑室注射人工脑脊液作为对照组,另外15只双侧icv-STZ制备SAD模型。分别于造模1、2、3、4个月后对两组小鼠进行跳台实验,观察小鼠学习和记忆保持能力变化;免疫组化和Western-blot观察AD特征性病理相关蛋白（Aβ42、phospho-tau）以及中枢糖代谢相关蛋白（IR、IRS-1、GSK3β、p-GSK3β、GLUT1、GLUT3）的表达水平,评价AD相关病理改变;透射电镜观察髓鞘超微结构,免疫组化和Western-blot观察髓鞘碱性蛋白（MBP）表达水平,评价模型的髓鞘损伤情况。2.90只雄性3月龄C57BL/6J野生型小鼠随机抽取15只双侧侧脑室注射人工脑脊液作为对照组,另外75只双侧icv-STZ制备SAD模型,适应性饲养一个月后随机分为模型组（蒸馏水）,多奈哌齐组（0.92mg/kg/d）,参枝苓大、中、小剂量组（49.67g/kg/d、24.83 g/kg/d、12.42g/kg/d）每组15只,所有小鼠按0.1ml/10g小鼠体重给药,每日灌胃1次,连续灌胃3个月。3.Morris水迷宫观察干预3个月后各组小鼠行为学表现,评价参枝苓口服液对SAD小鼠学习和记忆保持能力的影响。4.以牢固蓝（Luxol Fast Blue,LFB）染色法和透射电镜观察灌胃后各组小鼠的髓鞘超微结构和形态;免疫组化、Western-blot和RT-PCR观察髓鞘特异性蛋白MAG、MBP、MOG、PLP的蛋白表达和基因调控水平,评价参枝苓口服液对SAD小鼠的髓鞘保护作用。5.以免疫组化、Western-blot和RT-PCR观察PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白表达和基因调控水平,评价参枝苓口服液在髓鞘形成相关通路中发挥的作用。结果1.双侧icv-STZ拟SAD小鼠模型的AD相关病理改变跳台实验示:造模1、2、3、4个月后,双侧icv-STZ小鼠平均潜伏期较对照组缩短、平均错误次数较对照组增加（P<0.05,P<0.01）。免疫组化和Western-blot示:双侧icv-STZ小鼠Aβ42和p-tau表达较对照组增加（P<0.05,P<0.01）;双侧icv-STZ小鼠IR表达较对照组减少（P<0.05）,而IRS-1表达较对照组增加（P<0.01）,GSK-3β表达较对照组增加,而p-GSK-3β表达较对照组减少（P<0.05）;双侧icv-STZ小鼠GLUT1、GLUT3表达均较对照组减少（P<0.05,P<0.01）。透射电镜观察两组小鼠海马CA1区髓鞘超微结构,对照组髓鞘板层结构清晰完整,少突胶质细胞形态基本正常,双侧icv-STZ小鼠髓鞘崩解或严重膨出,少突胶质细胞形态不规则,染色质可见浓缩、边集（×2.5k）;对照组髓鞘和突触数量较多,双侧icv-STZ小鼠髓鞘和突触数量减少（×2.0k）;免疫组化和Western-blot与电镜结果一致,双侧icv-STZ小鼠MBP表达较对照组减少（P<0.05,P<0.01）。2.参枝苓口服液对拟SAD小鼠行为学的影响Morris 水迷宫示:第2～5天,各组小鼠平均潜伏期均缩短、平均游泳距离均减少,模型组平均潜伏期较对照组持续延长（P<0.01）、平均游泳距离较对照组增加（P<0.01）;第4天,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组平均潜伏期较模型组缩短、平均游泳距离较模型组减少（P<0.05,P<0.01）;第5天,各治疗组小鼠平均潜伏期较模型组均缩短（P<0.05）,仅参枝苓大剂量组平均游泳距离较模型组减少（P<0.05）;撤台后,模型组较对照组穿越平台次数减少（P<0.01）,目标象限停留时间缩短（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组的穿越平台次数较模型组增加（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组的目标象限停留时间较模型组增加（P<0.05,P<0.01）。3.参枝苓口服液对拟SAD小鼠髓鞘结构和轴突直径/有髓纤维直径（g-ratio）的影响LFB染色示:对照组可见髓鞘纤维分布稠密,呈深蓝染色;模型组髓鞘纤维明显脱失,染色浅;各药物治疗组髓鞘纤维分布较模型组更紧密,蓝染色加深。透射电镜观察各组小鼠海马CA1区髓鞘板层结构,对照组髓鞘结构清晰完整,模型组髓鞘严重崩解,各治疗组的髓鞘结构较模型组明显修复（×12.0k）;随机选取5个视野计算g-ratio,模型组小鼠g-ratio较对照组增加（P<0.01）,各治疗组（参枝苓小剂量组除外）g-ratio值较模型组均减少（P<0.01）（×1.2k）;观察各组单个髓鞘,对照组轴突直径小,髓鞘较厚,模型组轴突直径较对照组增大,髓鞘变薄,多奈哌齐和参枝苓大、中剂量组轴突直径较模型组均减小,髓鞘厚度增加（×8.0k）。Western-blot示:模型组MAG表达较对照组降低（P<0.05）,各治疗组（除参枝苓小剂量组）MAG表达较模型组增加（P<0.05）。免疫组化示:除模型组外,各组均见MAG 阳性染色,其中对照组和参枝苓大剂量组MAG染色较深且分布稠密,模型组偶见MAG 阳性染色。Western-blot示:模型组MBP表达较对照组降低（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组MBP表达较模型组增加（P<0.01）;模型组MOG表达较对照组降低（P<0.01）,参枝苓大、小剂量组MOG表达较模型组增加（P<0.05）;模型组PLP表达较对照组降低（P<0.01）,除参枝苓小剂量组外的各治疗组PLP表达较模型组均增高（P<0.05）。4.参枝苓口服液对拟SAD小鼠MAG、MBP、MOG、PLP mRNA表达的影响RT-PCR显示,模型组MAG、MBP、MOG、PLP mRNA表达较对照组减少（P<0.05,P<0.01）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组MAG、MBP、MOG mRNA表达较模型组增加（P<0.05,P<0.01）,各药物治疗组PLP mRNA表达较模型组均增加（P<0.05）。5.参枝苓口服液对拟SAD小鼠PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白表达的影响免疫组化示:模型组PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR阳性细胞数较对照组均减少（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,多奈哌齐组和参枝苓大、中剂量组PI3K、p-Akt阳性细胞数增加（P<0.05）,多奈哌齐组和参枝苓大剂量组Akt、mTOR和p-mTOR阳性细胞数增加（P<0.05,P<0.01）。PI3K和p-PI3K Westen-blot示:模型组PI3K表达较对照组降低（P<0.05）,参枝苓大、中剂量组PI3K表达较模型组均增加（P<0.05,P<0.01）;模型组p-PI3K表达较对照组降低（P<0.01）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组p-P13K表达较模型组均增加（P<0.05）。Akt和p-Akt Westen-blot示:模型组Akt、p-Akt表达较对照组降低（P<0.05）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组Akt、p-Akt表达较模型组增加（P<0.05）。mTOR和p-mTORWesten-blot示:模型组mTOR表达较对照组降低（P<0.01）,各治疗组mTOR表达较模型组均增加（P<0.05,P<0.01）;模型组p-mTOR表达较对照组降低（P<0.05）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组p-mTOR表达较模型组增高（P<0.05,P<0.01）。p-S6K1 Westen-blot示:模型组p-S6K1表达较对照组降低（P<0.01）,多奈哌齐和参枝苓大剂量组p-S6K1表达较模型组增高（P<0.05）。6.参枝苓口服液对拟SAD小鼠PI3K/Akt-mTOR通路及下游S6K mRNA表达的影响模型组PI3K mRNA表达较对照组减少,无统计学差异（P>0.05）;各治疗组PI3K mRNA表达较模型组增加,无统计学差异（P>0.05）。模型组Akt、mTOR mRNA表达较对照组减少（P<0.05）;多奈哌齐和参枝苓大剂量组Akt、mTOR mRNA表达较模型组增加（P<0.05,P<0.01）,参枝苓中剂量组Akt mRNA表达较模型组增加（P<0.05）。模型组S6K mRNA表达较对照组减少（P<0.01）;多奈哌齐和参枝苓大剂量组S6K mRNA表达较模型组增加（P<0.05）。结论1.双侧icv-STZ拟SAD小鼠不仅行为学认知障碍持续存在4个月,并存在AD相应病理改变及髓鞘损伤;2.参枝苓口服液改善拟SAD小鼠早期认知损伤,与其促进髓鞘损伤后修复、增加髓鞘特异性蛋白表达,调节PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白表达有关。
冯慧[6]（2020）在《Orexin能信号系统对蓝斑底核和巨细胞网状核神经元网络的调控作用及行为学效应研究》文中研究表明Orexin是由位于外侧下丘脑区和穹隆周区的一类特定神经元产生的肽类神经递质,其神经纤维可投射至几乎整个中枢神经系统,如大脑皮层、下丘脑、边缘系统、脑干和脊髓等。Orexin前体蛋白可以裂解产生orexin-A和orexin-B,通过激活两种G蛋白偶联受体,即orexin-1型受体和orexin-2型受体,主要对下游靶区产生兴奋性调控作用并参与其介导的生理功能,如参与摄食调节、体温调节、内分泌调节、睡眠/觉醒功能及动机性行为等。因此揭示orexin神经投射参与形成的不同神经环路和各个下游靶区内orexin能信号系统发挥调节作用的神经机制对研究其在不同生理功能中的作用至关重要。鉴于orexin神经系统对觉醒相关脑区的大量投射,以往的研究更多的关注其在觉醒功能中的作用。但是也有文献指出orexin神经系统能够参与睡眠功能的调节。有研究报道,orexin神经系统能够直接投射到REM睡眠起始和维持的关键脑区蓝斑底核（sublaterodorsal tegmental nucleus,SLD）和巨细胞网状核（gigantocellular reticular nucleus,Gi）,提示orexin神经系统可能通过直接调节SLD活动和Gi神经元活动参与REM睡眠的调控。我们课题组前期免疫荧光实验证明SLD脑区确实存在orexin纤维分布和orexin受体表达。此外,离体电生理实验结果揭示SLD脑区存在广泛的电突触联系,进一步研究结果表明orexin对SLD神经元网络放电活动存在复杂的调控作用,一方面orexin通过直接的突触后效应兴奋表达orexin受体的神经元,并通过电突触将这种兴奋效应传递到更广泛的区域;另一方面orexin通过增加电突触电导增强SLD神经元之间的电突触联系,从而导致兴奋效应在整个SLD网络中的广泛同步化。因此,orexin能够整合性地影响整个SLD神经元网络的放电活动,使其更广泛、高效、协调地兴奋。然而,在体情况下,SLD中的orexin能信号系统能否发挥上述调控作用,这种调控作用对大脑功能状态和REM睡眠有何贡献目前尚不清楚。另外,我们也在Gi脑区观察到了orexin纤维分布和orexin受体表达,并且orexin能够通过激活突触后膜上的orexin-1型和orexin-2型受体在Gi神经元上引起内向电流反应。同样地,orexin引起的上述兴奋效应对Gi神经元放电活动的具体影响及机制仍未可知。综上所述,本文首先采用在体多通道记录和神经药理学技术研究SLD中的orexin能信号系统对SLD神经元网络放电活动的调控效应以及对脑功能状态的影响,然后综合采用光遗传学和化学遗传学技术探讨SLD中orexin能信号系统对REM睡眠的调控作用和机制,另一方面,采用全细胞膜片钳记录技术结合神经药理学技术研究orexin调控Gi神经元活动的电生理效应及机制。现将相关结果阐述如下:1.Orexin能信号系统调节SLD神经元网络活动及脑功能状态的在体研究（1）Orexin通过对SLD神经元网络放电活动的影响增强海马LFP振荡活动本文首先研究orexin-A对SLD脑区神经元网络放电活动的调控作用。麻醉状态下,orexin-A显着增加了记录到的69.1%（67/97）的神经元的放电频率（n=67/97 units,P<0.01）。此外,通过分析SLD神经元对在±1 ms内的同步化放电情况来评估SLD网络中电突触的活动,结果显示30μM的orexin-A使存在电突触联系的SLD神经元对比例从8.4%上升到13.0%（n=215对）,并且显着增强了88.0%的存在电突触联系的SLD神经元的同步化放电概率（n=56 units,P<0.01）。上述结果表明orexin-A能够兴奋记录到的大部分SLD神经元,并提高其兴奋时的同步化放电水平,进而导致SLD神经元网络的同步化兴奋。接下来为了进一步探究orexin对SLD神经元网络放电活动的调控效应有什么生理意义,我们采用同步记录海马局部场电位（local field potential,LFP）活动来反映SLD神经元网络的输出效率,体现脑功能状态的变化。结果发现麻醉状态下海马LFP活动呈1Hz左右的慢振荡,orexin-A增强了海马LFP慢振荡核心频段（0.3-2.5 Hz）的能量（n=5rats,P<0.05）。相位锁定分析结果显示,orexin-A显着增加了SLD神经元放电活动与海马LFP慢振荡之间的锁定强度（baseline:n=76/97 pairs,orexin:n=84/97 pairs,P<0.01）。上述结果提示orexin能信号通过引起SLD神经元网络同步化兴奋上调SLD神经元网络的输出效率,增强下游靶点海马网络活动,从而参与脑功能状态的调节。（2）Orexin引起的SLD神经元网络同步化程度的提高对调节脑功能状态至关重要为了进一步明确orexin引起的SLD神经元网络同步化兴奋与其输出效率之间的关系,我们采用CBX干扰SLD神经元网络的同步化放电水平,结果显示在CBX存在的情况下,电突触耦连SLD神经元之间的同步化放电概率减弱了47.7%（n=60 units,P<0.01）,此外,CBX完全阻断了由orexin-A引起的电突触耦连SLD神经元同步化程度的提升（n=30 units,P=0.959）,而不影响orexin-A引起的SLD神经元放电频率的增加（n=39/72 units,P<0.01）。上述结果表明CBX能够干扰SLD神经元网络的同步化程度,而不影响神经元的兴奋效应。观察此时海马LFP慢振荡发现其核心频段的能量相较于单独注射orexin-A显着降低（每组n=5 rats,P<0.05）,并且CBX完全阻断了orexin-A引起的SLD神经元放电活动与海马LFP慢振荡之间的锁定强度的增加（baseline:n=40/72,orexin+CBX:n=55/72,P=0.488）。这部分结果表明,SLD神经元网络的输出效率依赖于orexin对SLD神经元网络同步化程度的调控,一旦其同步化程度下降,将直接影响到SLD神经元网络的输出效率,从而无法实现对脑功能状态的调节。2.Orexin能信号系统对SLD调控作用的行为学效应研究（1）NREM睡眠期间激活SLD脑区的orexin能纤维末梢能够活化脑功能状态并下调肌张力,但并不引起REM睡眠的转换为了进一步研究orexin对SLD神经元网络同步化兴奋的调控引起的脑功能状态的改变对SLD介导的REM睡眠的影响,首先采用离体膜片钳记录结合光遗传学技术,结果发现激活SLD的orexin能纤维末梢在所有记录的SLD神经元上均能引起一个明显的去极化反应（n=6 neurons for each group,P<0.05）。表明光遗传学激活SLD区域的orexin能纤维末梢能够直接兴奋SLD神经元,影响SLD神经元网络的输出效率。进一步采用光遗传学方法在双侧LH注射AAV-Ef1α-DIO-ChR2-mCherry,在双侧SLD脑区埋置光纤,并同步记录EEG-EMG信号变化。在体光遗传学激活结合脑肌电记录结果显示,在小鼠进入稳定的NREM睡眠后采用不同频率的光刺激,脑电全频段能量和肌电呈刺激频率依赖性的的下降(n=6 mice,EEG:P10Hz<0.05,P20Hz<0.01,EMG:P20Hz<0.01)。光刺激频率为20 Hz时,小鼠脑电全频段能量在给光后2.4 s出现下降（n=6 mice,P<0.01）,而肌电在给光后约9 s出现下调（n=6 mice,P<0.01）,与生理情况下NREM睡眠向REM睡眠的转换类似。分析脑电功率能谱图显示,theta组分显着增加（n=6 mice,P<0.05）,但并没有引起明确而连续的theta节律,即没有转入REM睡眠。上述结果表明激活SLD的orexin能纤维末梢无法使NREM睡眠转入REM睡眠,但是确实能够激活脑功能状态,如增加theta成分占比以及引起肌张力的下调。（2）REM睡眠期间操纵SLD脑区的orexin能纤维末梢调节REM睡眠时长接下来进一步探究NREM睡眠期间的脑功能状态的激活和肌张力的下调能否贡献给生理状态的REM睡眠,我们在单次REM睡眠中光操纵SLD的orexin能纤维末梢,记录EEG-EMG信号变化和REM睡眠时长。结果显示激活SLD的orexin能纤维末梢后,theta/delta能量比增加10.5%（n=9 mice,P<0.05）,并且显着增加12.1%的平均REM睡眠时长（n=9 mice,P<0.05）。相反,抑制SLD脑区的orexin能纤维末梢减少8.0%theta/delta能量比（n=9 mice,P<0.05）,且显着减少了18.2%的平均REM睡眠时长（n=9 mice,P<0.05）,激活和抑制均未观察到显着的EMGREM/NREM改变。光遗传学结果表明SLD中的orexin能信号系统能够提升SLD神经元网络的输出效率,并通过稳定脑功能状态的激活延长单次REM睡眠时长,有助于稳定REM睡眠。（3）化学遗传学抑制SLD脑区的orexin能信号系统导致REM睡眠不稳定我们接下来研究化学遗传学抑制SLD中的orexin能信号系统对REM睡眠的影响。在双侧SLD脑区注射AAV-retro-hSyn-DIO-h M4D（Gi）-mCherry抑制SLD中的orexin能信号。与注射vehicle相比,腹腔注射CNO显着减少了17.0%的REM睡眠总量（n=8 mice,P<0.01）,而不影响觉醒时间百分比和NREM睡眠时间百分比。进一步分析发现REM睡眠总量的减少是由于平均单次REM睡眠时长减少导致的（n=8 mice,P<0.05）。另外,EMG-EEG分析结果显示,注射CNO后大部分REM睡眠片段中均出现严重且持续的肌张力迟缓障碍,并且NREM睡眠转入REM睡眠的生理性肌张力下降也被CNO阻断（n=8 mice,P<0.01）。同时,CNO注射还引起EEG活动theta/delta能量比显着减小（n=8 mice,P<0.05）。上述结果表明SLD中orexin能信号缺失会干扰脑功能状态的激活和肌张力下调,导致单次REM睡眠片段的不稳定,从而减少REM睡眠总量。3.Orexin对巨细胞网状核神经元活动的调控作用及机制研究（1）Orexin通过引起突触后去极化增强Gi神经元放电活动首先,我们在电流钳模式下研究orexin对Gi神经元放电活动的调控作用。我们发现,在电流钳模式下,Gi神经元具有自发放电,100 nM orexin-A（2 min）能够显着增强这些Gi神经元的放电活动频率（n=6 neurons,P<0.05）。此外,在灌流液中加入TTX（0.1μM）,以阻断动作电位的产生和神经元间的突触传递活动观察到orexin-A可以在Gi神经元上诱导出去极化反应（n=6 neurons,P<0.01）。上述结果提示,orexin可以通过引起突触后去极化增强Gi神经元放电活动。（2）Orexin增加Gi神经元的持续性放电能力,而不影响其输入阻抗接下来,我们进一步研究了orexin-A对Gi神经元的兴奋效应是否伴随着神经元输入阻抗的变化。通过电流输入将测试的神经元膜电位钳制于-60 mV附近,并在加入orexin-A（100 nM）诱发出去极化效应的平台期后再将其膜电位水平钳制回baseline水平。在加入orexin-A前后,分别对测试的Gi神经元施加阶梯超极化刺激（step:-10 pA,duration:2 s）。通过绘制在上述测试中得到的电流-电压曲线（current-voltage relationship）变化,可以计算得出其斜率（slope）,即为该神经元的输入阻抗。通过上述研究,我们发现,orexin对Gi神经元的输入阻抗并不存在显着影响。在这种情况下,我们进一步探讨了orexin-A对Gi神经元的放电活动模式是否存在直接的调控效应。在（2）中所述条件下,我们发现系列方波刺激（0-225 pA）可以在所有测试的Gi神经元上诱导出tonic的放电反应。有意思的是,通过绘制电流-放电频率曲线（current-frequency curve）后我们发现,orexin-A显着增强了相同电流（>100 pA）刺激在Gi神经元中所引起的放电活动频率（n=9 neurons,P<0.05）。该部分结果揭示,在相同去极化驱动力的条件下,orexin还可以直接增强Gi神经元的兴奋性。（3）Orexin通过缩短放电峰峰间距增强Gi神经元兴奋性最后,对orexin增强Gi神经元兴奋性的机制进行进一步研究。在加入orexin前后,通过分析相同电流刺激（225 pA）所诱发的放电活动的峰峰间距（inter-spike intervals）,我们发现所有测试Gi神经元的诱发动作电位的峰峰间距均在2-s刺激的后半段到达平台期。统计分析后发现,orexin对诱发放电反应的初始阶段的峰峰间距并无显着影响,有意思的是,orexin显着缩短了平台期时Gi神经元放电的峰峰间距（n=9 neurons,P<0.05）。这部分数据表明,orexin能够通过缩短放电的峰峰间距增加Gi神经元的持续性放电活动。接下来,进一步对上述缩短的峰峰间距这一现象产生的电生理基础进行了分析。我们发现orexin对Gi神经元的动作电位放电阈值、放电幅度、波形宽度均无影响。此外,orexin不影响动作电位后超极化的幅度和时间间隔。上述结果提示,orexin缩短Gi神经元放电的峰峰间距并非通过对动作电位波形的影响来实现,而是反应了自前一个动作电位后超极化的波谷水平向后一个动作电位的阈值水平更快的去极化。综上所述,本研究发现SLD中的orexin能信号能够广泛兴奋SLD神经元,并提升神经元之间的同步化放电水平,引起SLD神经元网络的同步化兴奋,从而上调SLD神经元网络的输出效率,通过增强与下游靶点海马之间的联系激活脑功能状态。在自由活动动物上,SLD中的orexin能信号系统通过稳定脑功能状态的激活稳定单次REM睡眠时长,一旦其信号缺失将会引起脑功能状态不稳定和肌张力迟缓障碍,从而导致REM睡眠不稳定。本研究揭示了orexin能信号系统调控REM睡眠的直接通路及其机制,并为理解orexin信号缺失引起的REM睡眠疾病的发病机制提供新的研究方向。另外,本研究还发现orexin能够直接调控Gi神经元的放电活动,通过增强其兴奋性促进Gi神经元持续性放电。这部分结果揭示了orexin对Gi神经元的兴奋性调控作用,为今后探索Gi脑区orexin能信号系统的生理学效应和意义以及其在Gi介导的运动行为中的具体功能奠定基础。
刘珍洪[7]（2020）在《基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用》文中进行了进一步梳理目的本课题从中医心脑相关理论出发,选用“从心论治”代表方参枝苓口服液,基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨其干预阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的作用机制。AD是老年痴呆症最常见的类型。临床可表现为记忆、情志和行为障碍,对患者家庭、护理人员造成了沉重的经济和精神负担。近年来研究表明,髓鞘损伤与AD、帕金森疾病（Parkinson’sdisease,PD）和中风等神经退行性疾病相关。其中发现AD与髓鞘的破坏和丢失关系密切。研究发现髓鞘损伤早于认知障碍、老年斑（Senileplaque,SPs）和神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）等病理改变,髓鞘损伤可能在AD早期认知障碍中发挥关键作用。PI3K/Akt-mTOR通路是髓鞘形成的强大驱动力,是CNS髓鞘蛋白表达的主要驱动因素。一些研究显示神经元PI3K/Akt-mTOR信号传导的异常和持续激活是AD的早期特征。mTOR在构成髓鞘的少突胶质细胞中对脂质合成,转录因子调节,和细胞骨架具有显着作用,这是少突胶质细胞发育不可或缺的过程。除外,表观遗传阻滞、脂质代谢异常皆与AD的病理密切相关。本研究通过体内实验探索参枝苓口服液是否有改善损伤髓鞘的作用,同时观察体外是否能通过保护Aβ42损伤的少突胶质细胞进而维持髓鞘完整性而防治早期AD。并基于PI3K/Akt-mTOR信号通路、表观遗传调控及脂质代谢探讨其可能机制,为参枝苓口服液保护髓鞘提供可能的证据。方法1.36只3月龄雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组,多奈哌齐组,参枝苓口服液组,每组12只。同背景、同月龄野生型C57BL/6J小鼠12只作为正常组。多奈哌齐组给予多奈哌齐（0.92mg.kg-1·d-1）灌胃给药,参枝苓口服液组给予参枝苓口服液（2.9ml·kg-1·d-1）灌胃给药。正常组和模型组灌予等体积的0.5%CMC。2.利用Y迷宫实验研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠空间识别和记忆能力的影响。3.利用透射电镜研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中淀粉样斑块、髓鞘及少突胶质细胞超微结构的影响。4.利用免疫组化和Western blot方法研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中髓鞘相关蛋白MBP、PLP和MAG与Aβ42蛋白的表达变化影响。5.40只雄性SD成年大鼠（200±20g）随机分为正常组和参枝苓口服液组,参枝苓口服液组以成人（70kg）等效剂量的2倍量进行灌胃,正常组灌服等体积0.5%CMC,每天1次,连续7d,制备参枝苓口服液含药血清。6.UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液含药血清主要有效成分。7.Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞,建立拟AD体外细胞模型。8.利用CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清及阳性药多奈哌齐对OLN-93少突胶质细胞的安全剂量和有效剂量。9.利用Western blot、RT-qRCR法、免疫荧光研究参枝苓口服液含药血清对Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞髓鞘相关蛋白和PI3K/Akt-mTOR信号通路蛋白及mRNA表达影响。10.利用PI3K/Akt-mTOR信号通路抑制剂LY294002（PI3K抑制剂）及Rapamycin（mTOR抑制剂）进一步确认PI3K/Akt-mTOR信号通路在参枝苓口服液髓鞘保护中的参与作用。11.利用染色质免疫共沉淀（CHIP）实验观察参枝苓口服液对Aβ42损伤少突胶质细胞OLN-93的乙酰化组蛋白与MBP基因相互作用。12.利用LC-MS/MS法观察参枝苓口服液对Aβ42损伤少突胶质细胞OLN-93脂质代谢的影响。结果1.体内动物实验参枝苓口服液和阳性对照药多奈哌齐连续灌胃3个月后可以明显延长APPswe/PS1dE9双转基因小鼠在新异臂中活动的路程和持续时间。透射电镜下可观察到在损伤的少突胶质细胞附近淀粉样斑块的沉积,而正常组和治疗组未观察到。同时,透射电镜下观察到参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显改善髓鞘板层的结构、髓磷脂的崩解以及少突胶质细胞的结构破坏。在此基础上,对各组小鼠海马进行免疫组化及Western blot实验结果也显示,参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中髓鞘相关蛋白MBP、PLP和MAG的蛋白表达。同时,APPswe/PS1dE9双转基因模型小鼠海马中观察到Aβ42的蛋白表达上调,参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显下调小鼠海马中Aβ42的蛋白表达。2.UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液及参枝苓含药血清主要有效成分参枝苓口服液中,芍药内酯苷、肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这5种代谢物都能检测到。且浓度含量:甘草酸>芍药苷>芍药内酯苷>肉桂酸>甘草苷。参枝苓口服液大鼠含药血清中,可以检测到肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种代谢物。浓度含量:甘草酸>肉桂酸>芍药苷>甘草苷。芍药内酯苷虽然在质谱中可以检测到峰,但是信号可能与噪音相似,定量检测未检测出含量。提示,参枝苓口服液确实可以经过灌胃入血发挥作用,参枝苓口服液髓鞘保护作用可能与肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种成分密切相关。3.体外细胞实验Aβ42可以诱导OLN-93少突胶质细胞引起损伤,100μMAβ42孵育细胞16h以及1μM、10μM和100μM的Aβ42孵育细胞24h和48h后可以明显降低细胞活力。同时,1～100μM的Aβ42孵育细胞24h,细胞的损伤率明显增加。1～100μM的Aβ42孵育24h可以对细胞形态造成破坏,引起细胞固缩,碎裂,死亡。并且,Aβ42孵育24h可以显着升高OLN-93细胞的凋亡水平。用CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐的安全剂量、给药时间范围结果显示,1%～20%浓度的参枝苓口服液含药血清孵育3～48h对正常OLN-93细胞不具有细胞毒性,甚至16%和20%浓度的参枝苓口服液含药血清孵育24h和48h可以显着提高正常OLN-93细胞的细胞活力。多奈哌齐对正常OLN-93细胞的安全剂量及时间为:孵育 3h（0.01μM,0.1μM,1 μM,10μM,100μM）;孵育 24h（0.01 μM,0.1 μM,1μM,10μM,100μM）;孵育 48h（0.01 μM,0.1μM,1 μM,10μM）。CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐的有效剂量、给药时间范围,16%,20%参枝苓口服液含药血清孵育24h及48h。1 μM,10μM和100μM多奈哌齐孵育3h或24h;0.1μM,1μM和10μM多奈哌齐孵育48h。Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞,与体内动物实验一致,表现为Aβ42明显下调少突胶质细胞髓鞘相关蛋白MBP、PLP、MAG和MOG的表达,并且下调MBP和PLP的mRNA表达水平,而参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐干预后可以明显逆转这些蛋白和mRNA的表达水平。另一方面,Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞还表现为引起PI3K/Akt-mTOR信号通路的异常。Aβ42不仅可以下调PI3K,Akt及mTOR的蛋白和mRNA表达水平,还可以明显下调p-PI3K,p-Akt及p-mTOR的蛋白表达水平,而参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐干预后可以明显逆转这些蛋白和mRNA的表达水平。参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐对Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞的保护作用可以被PI3K/Akt-mTOR信号通路的抑制剂完全逆转,具体表现为,无论是使用LY294002,Rapamycin还是联合使用LY294002与Rapamycin都可以完全逆转参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐上调MBP的能力。CHIP实验显示:Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞后组蛋白H3乙酰化水平升高。多奈哌齐和参枝苓口服液含药血清下调组蛋白H3乙酰化水平。同时,Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞后,更多的基因MBP发生了组蛋白H3乙酰化。多奈哌齐和参枝苓口服液含药血清可以下调组蛋白H3乙酰化的MBP基因水平。脂质代谢结果显示:正常组的CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS显着高于模型组。模型组的Cer、DG、SM和TG显着高于正常组。两组Cerp、Hex2Cer、HexCer和Sphingosine含量均等。多奈哌齐的Cer、CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS显着高于模型组。模型组的SM和TG明显高于多奈哌齐组。参枝苓口服液的Cer、DG、CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、SM显着高于模型组。模型组的TG明显高于参枝苓口服液组。结论参枝苓口服液具有改善损伤髓鞘的作用,同时参枝苓口服液含药血清能保护Aβ42损伤的少突胶质细胞进而维持髓鞘完整性而防治早期AD。参枝苓口服液的髓鞘保护作用与PI3K/Akt-mTOR信号通路、表观遗传调控及脂质代谢密切相关。首先,参枝苓口服液可能通过上调PI3K,Akt及mTOR mRNA的水平,引起PI3K,Akt及mTOR蛋白的表达水平上调,增加PI3K,Akt及mTOR的磷酸化,增强PI3K/Akt-mTOR信号通路的活性,从而发挥少突胶质细胞及髓鞘保护作用。其次,参枝苓口服液通过下调组蛋白H3乙酰化水平、下调组蛋白H3乙酰化的MBP基因水平从而保护少突胶质细胞。再者,参枝苓口服液通过上调CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS的含量,下调TG含量,调整脂质代谢紊乱从而保护少突胶质细胞。最后,参枝苓口服液髓鞘保护作用的物质基础则可能与肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种成分密切相关。
唐慧玲[8]（2020）在《腹侧中脑导水管周围灰质ATP受体神经元参与井穴刺络法干预重型颅脑创伤大鼠促醒的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）性昏迷是神经外科常见急危重症之一,并且其残死率高居于各类创伤之首。据统计,2016年全球TBI流行病例数为5550万例,新发病2708万例,年发生率为369（331～412）人/10万人,其中重型患者占18～20%,死亡率高达30～50%。据有关数据分析,重型TBI性昏迷患者能否尽快苏醒是影响临床预后的重要因素,昏迷状态继而恶化为植物状态的患者也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。故寻找安全有效的促醒疗法,降低死残率,使患者尽快回归家庭和社会具有重要意义。手十二井穴刺络法是独具中医特色的急救昏迷技术,简便易行。本课题组前期临床试验研究已证实手十二井穴刺络法（以下简称井穴刺络法）可有效改善TBI等多种中枢神经损伤（Central nervous system injuries,CNSIs）患者的意识状态。井穴刺络法虽有明确的促醒疗效,但其促醒的生物学机制尚未完全阐明。故阐明其促醒机制,有助于拓展该法在TBI等多种CNSIs性昏迷的临床应用和国际推广,提高救治率。课题组前期在探讨井穴刺络法促进TBI性昏迷大鼠苏醒机制研究中,利用基因芯片筛查发现,井穴刺络1 h可激活脑干三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）信号通路、神经投射及蛋白分泌等通路。并利用基因定量验证基因芯片分析的结果,提示井穴刺络法可上调脑干多个神经投射受体,如P2RX7、P2RX3、TRPV1等,并可上调TBI性昏迷大鼠脑干多巴胺（Dopamine,DA）受体D3（Dopamine receptor D3,DRD3）的表达。本研究围绕筛查出的关键神经投射受体（P2RX7、P2RX3、TRPV1）进一步阐释其参与井穴刺络法促醒的分子机制。方法:1.井穴刺络法改善重型颅脑创伤性昏迷大鼠意识状态的效应平台研究将筛选24只健康成年（8周）雄性（Sprague Dawley,SD）大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（TBI组）、TBI+手十二井穴刺络组（Hand Acu组）,为了在效应上初步探索手十二井穴刺络法在促醒疗效上是否存在穴位差异性。本研究在前期研究的基础上增加了神经分布不同的足十二井穴刺络组（Foot Acu组）,样本量为每组6只。Sham组仅打开颅窗而不进行撞击;TBI组则是打开颅窗后利用电子控制性脑皮质撞击仪（electricity Controlled cortical impact,e CCI）制备重型TBI大鼠模型。根据I-VI意识状态分级量表（详见表3）,把V、VI级TBI大鼠定义为昏迷状态并纳入实验中;Sham组和TBI组均不给予井穴刺络法治疗,Hand Acu组和Foot Acu组在重型TBI模型的基础上分别给予手十二井穴刺络法和足十二井穴刺络法进行干预治疗,在48 h内每日治疗2次,时间间隔为12 h。疗效评价主要指标是实时观察实验大鼠的昏迷时程以及采用改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,m NSS）评估大鼠造模后6h、24 h和48 h的神经功能缺损症状。2.脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3、TRPV1介导井穴刺络法促醒的机制研究本课题前期结果发现,井穴刺络法可上调时间点为1 h脑干部位的P2RX7、P2RX3、TRPV1以及DRD3的表达。故本实验基于前期实验结果,进一步探讨脑室内注射（Intracerebral ventricle injection,i.c.v）P2RX3拮抗剂、P2RX7拮抗剂以及TRPV1拮抗剂后观察井穴刺络法的促醒效应是否消失,以探讨P2RX7、P2RX3、TRPV1是否介导井穴刺络法促醒。根据三个拮抗剂的溶剂有别,故实验分组设置为以下7组（n=6只/组）:TBI+i.c.v盐水组、井穴刺络+i.c.v盐水组、P2RX3拮抗剂组;TBI+i.c.v DMSO组、井穴刺络+i.c.v DMSO组、P2RX7拮抗剂组、TRPV1拮抗剂组,即这三个拮抗剂组（P2RX3拮抗剂组、P2RX7拮抗剂组、TRPV1拮抗剂组）均在脑室内注射拮抗剂的基础上进行井穴刺络法干预。3.井穴刺络法对腹侧中脑导水管周围灰质（ventral Periaqueductal gray,v PAG）的P2RX7、P2RX3、TRPV1及多巴胺神经元的影响研究课题组继续研究脑干部位哪个核团内表达这些受体,并介导井穴刺络法促醒。根据既往文献报道,v PAG是脑干网状上行激活系统（Ascending reticular activating system,ARAS）的关键投射部位之一,v PAG的DA神经元在醒觉传导中起“中继站”作用,且v PAG表达P2RX7、P2RX3及TRPV1。故本研究进一步精确到脑干部位的v PAG核团,阐明井穴刺络法对P2RX7、P2RX3、TRPV1信号通路的调控作用。采用多重免疫荧光染色联合类流式组织全景半定量分析方法,分别检测脑干部位v PAG核团的P2RX7、P2RX3、TRPV1和DA的表达及共定位量。选取Hand Acu组的P2RX7/P2RX3/TRPV1+DA+DAPI共染,观察井穴刺络法干预后v PAG核团的DA神经元是否表达P2RX7、P2RX3、TRPV1;同时检测v PAG核团的P2RX7/P2RX3/TRPV1/DA+c-fos+DAPI共染,以观察P2RX7、P2RX3、TRPV1及DA神经元的兴奋性。结果:1.井穴刺络法可缩短重型颅脑创伤性昏迷大鼠的苏醒时间和改善神经功能缺损症状本实验观察井穴刺络法对TBI大鼠昏迷时程及其神经功能缺损症状的影响,结果如下:（1）实验大鼠TBI造模后发现,TBI组的昏迷时程与Sham组相比明显升高且有统计学意义(**P<0.01 v.s.Sham),说明TBI大鼠模型复制成功。经井穴刺络法干预后,Hand Acu组与TBI组相比,昏迷时程缩短且有统计学意义(▲▲P<0.01 v.s.TBI);同样,Foot Acu组与TBI组相比,昏迷时程缩短且有统计学意义（▲P<0.05 v.s.TBI）;说明手/足十二井穴刺络法均可缩短TBI大鼠的昏迷时程,且Hand Acu组的促醒效应优于Foot Acu组。（2）在神经功能改善方面,实验大鼠TBI造模后6 h、24 h、48 h的m NSS评分结果显示,大鼠TBI后的m NSS评分比Sham组显着升高且有统计学意义(**P<0.01 v.s.Sham),说明造模成功。在时间点为24 h的m NSS评分上,经井穴刺络法治疗后,Hand Acu组比TBI组降低且有统计学意义（▲P<0.05 v.s.TBI）,说明手十二井穴具有改善大鼠神经功能缺损的作用;而Foot Acu组与TBI组相比,只有下降趋势。在时间点为48h的m NSS评分上,Hand Acu组比TBI组降低且有统计学意义(▲▲P<0.01 v.s.TBI);此时,Hand Acu组比Foot Acu组降低也出现统计学差异（#P<0.05 v.s.Foot Acu）,而Foot Acu组与TBI组相比,同样只有下降趋势。说明手十二井穴有改善TBI大鼠神经功能缺损的作用。以上结果显示,在m NSS评分方面,Hand Acu组的m NSS评分效应指标更显着于Foot Acu组,说明手十二井穴刺络法在改善神经功能方面可能存在穴位特异性。综上所述,两个效应指标的结果表明手十二井穴刺络法的治疗效应更显着,故课题组之后的实验均采用手十二井穴刺络法作为干预措施以探讨其促醒的生物学机制。2.脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3、TRPV1介导手十二井穴刺络法促醒实验结果显示,三个拮抗剂实验在手十二井穴刺络法干预下均有促醒疗效（*P<0.05v.s.TBI）。P2RX7拮抗剂组与Hand Acu组相比,大鼠昏迷时程升高且有统计学意义（▲P<0.05 v.s.Hand Acu）;同样,P2RX3、TRPV1拮抗剂组与Hand Acu组相比,大鼠昏迷时程明显升高且有统计学意义(▲▲P<0.01 v.s.Hand Acu)。此外,意外的结果也发现P2RX3、TRPV1拮抗剂组与TBI组相比,大鼠昏迷时程也明显升高且有统计学意义(**P<0.05 v.s.TBI)。该实验结果提示,脑室内注射P2RX7、P2RX3和TRPV1拮抗剂可拮抗井穴刺络法促醒效应,表明脑内P2RX7、P2RX3及TRPV1介导井穴刺络法促醒。3.井穴刺络法可激活腹侧中脑导水管周围灰质表达P2RX7和多巴胺的神经元本实验多重免疫荧光染色结果提示:（1）Hand Acu组的P2RX7/P2RX3/TRPV1+DA+DAPI共染的结果发现,v PAG部位的P2RX7、P2RX3、TRPV1以及DA神经元主要表达于细胞质及细胞膜上,进一步研究发现DA神经元表达P2RX7、P2RX3和TRPV1。（2）多重免疫荧光染色联合类流式组织全景半定量分析发现,井穴刺络法干预1 h可提高脑干v PAG部位的DA及P2RX7神经元兴奋性（▲P<0.05 v.s.TBI）,P2RX3神经元兴奋性仅呈上调趋势,而TRPV1神经元兴奋性无明显影响。本实验结果提示,井穴刺络法可提高v PAG部位P2RX7神经元的表达量（▲P<0.05 v.s.TBI）以及DA和P2RX7神经元的兴奋性（▲P<0.05 v.s.TBI）,可能参与井穴刺络法促醒。结论:1.手十二井穴刺络法可缩短重型颅脑创伤性昏迷大鼠的苏醒时间并改善神经功能缺损症状。2.脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3及TRPV1介导手十二井穴刺络法促醒。3.手十二井穴刺络法可上调腹侧中脑导水管周围灰质的P2RX7和多巴胺神经元表达及其兴奋性,可能是该疗法促醒的作用机制之一。
沈青[9]（2020）在《小胶质细胞Tak1介导肥胖相关脑血管功能障碍的研究》文中研究说明目的:本文旨在研究小胶质细胞中TGF-β活化激酶1（Tak1）介导的炎症信号通路在肥胖相关的脑血管功能紊乱中的作用及其机制,以及该通路对肥胖相关的脑卒中预后的影响。方法:建立高脂食物诱导的肥胖小鼠模型,对脑内Tak1表达水平及基底动脉功能进行检测。药物抑制或小胶质细胞特异性敲除Tak1,观察基底动脉结构和功能变化。在脑干小胶质细胞中表达组成性活性Tak1,观察基底动脉结构和功能变化。筛选出在肥胖小鼠脑干中过表达的细胞因子,在细胞水平研究Tak1对筛选出的细胞因子的调控。用该细胞因子刺激大鼠主动脉内皮细胞,观察内皮型一氧化氮合酶（e NOS）的活性。注射该细胞因子受体的抗体于肥胖及正常小鼠第四脑室,观察脑血管结构和功能的变化。对肥胖及正常体重的Tak1敲除及对照基因型小鼠进行暂时性缺血脑卒中造模,对脑缺血体积和脑卒中的预后进行分析。结果:高脂食物诱导的肥胖小鼠脑干Tak1被激活,脑血管发生结构异常和功能紊乱。药物抑制或小胶质细胞特异性敲除Tak1能够显着改善肥胖小鼠脑血管的结构与功能异常。小胶质细胞特异性表达组成性活性的Tak1导致正常小鼠基底动脉发生结构和功能紊乱。肥胖小鼠脑干存在细胞因子IL-18和其他分子的过表达。Tak1能够促进IL-18的产生;IL-18会引起大鼠内皮细胞中e NOS活性下降。阻断IL-18受体能够明显改善肥胖小鼠脑血管结构和功能异常。最后,敲除Tak1能够明显减少肥胖小鼠脑缺血体积,改善脑卒中的预后。结论:Tak1-IL-18通路介导了肥胖相关的脑血管结构异常和功能紊乱。Tak1可能成为预防或治疗该病变的靶点。
王雪娇[10]（2020）在《小胶质细胞在系统性红斑狼疮自身抗体诱导的脑认知障碍中的作用及机制的研究》文中提出目的:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种多系统受累的慢性自身免疫性疾病。临床表现多种多样,累及肾脏出现蛋白尿,血尿乃至肾衰竭;心血管系统受累则常出现心包炎,心内膜炎及冠状动脉损害。当SLE患者出现无菌性脑炎,脑血管病变,头痛,急性意识错乱,认知功能减退,情绪障碍及精神病等中枢神经系统（central nervous system,CNS）受累症状时,称之为神经精神性狼疮,即狼疮脑病（neuropsychiatric SLE,NPSLE）。目前有关NPSLE的病理机制仍不清楚。已有临床研究发现抗核糖体P蛋白自身抗体（autoantibodies against ribosomal P protein,Anti-P）等来自SLE患者血清中的自身抗体与NPSLE的神经精神症状密切相关。在动物实验中发现这些自身抗体可攻击大脑海马区神经元从而造成空间记忆功能的损害。然而既往有关NPSLE研究大多只检验了自身抗体对大脑神经元的直接作用,而在CNS中发挥免疫和神经调节作用的小胶质细胞却很少受到关注。目前已有越来越多的证据表明,小胶质细胞介导的神经炎症反应在多种神经精神疾病中都起着重要作用。为了深入探讨小胶质细胞与NPSLE的相关性,我们在本研究中以正常小鼠为模型开展一系列在体实验,检验SLE患者来源的Anti-P IgG（immunoglobulin G,IgG）等致病因素对脑组织细胞形态,神经电生理活动和认知行为功能的影响,着重探讨小胶质细胞介导的炎症反应的发生发展过程,并验证通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）的途径能否缓解神经炎症反应,从而达到治疗Anti-P IgG诱导的神经功能障碍的目的。研究方法:1、收集SLE患者血清或健康对照者血清,通过在体脑内微量注射的方法,将其注射到小鼠侧脑室内（intracerebroventricular,ICV）,通过在体荧光显微成像的方法观察脑微血管内白细胞贴壁滚动和粘附情况,以评价微血管内炎症反应的程度。2、通过注射含有热灭活H37Ra结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂（complete Freund’s Adjuvant,CFA）和百日咳毒素（pertussis toxin,PTx）的方法提高小鼠脑血屏障（blood brain barrier,BBB）的通透性,然后经尾静脉注射SLE患者来源的Anti-P IgG（immunoglobulin G）,使其能够通过BBB进入到CNS中。3、在小鼠大脑初级听皮层（the primary auditory cortex,A1）植入电极,记录A1对40 Hz click-train刺激反应的脑电图（electroencephalogram,EEG）信号,以评价听觉稳态反应（auditory steady-state response,ASSR）。4、制作脑组织切片,使用神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein,NeuN）、离子钙接头蛋白（ionized calcium binding adapter molecule,Iba-1）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）分别对神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞进行特异性免疫荧光染色,以评价不同类型细胞的密度和形态的变化。通过TUNEL法来检测脑组织中神经细胞的凋亡情况。检测趋化因子[chemokine（C-C motif）ligand 2,CCL2和CCL5]和粘附分子[P-选择素（P-Selectin）和细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule,ICAM-1）]表达情况。5、使用集落刺激因子-1受体（colony-stimulating factor-1 receptor,CSF1R）抑制剂PLX3397选择性消除小鼠脑内小胶质细胞,观察在没有小胶质细胞存在的情况下Anti-P IgG对小鼠脑神经活动的影响。6、将亲和纯化的Anti-P IgG或健康对照IgG注射到正常小鼠左右腹侧海马CA1区。48 h后,通过社交行为实验来评价Anti-P Ig G对小鼠社会认知记忆功能的影响。并通过嗅觉测试和旷场试验来评价小鼠嗅觉功能和运动能力。7、用qRT-PCR方法检测脑组织中细胞因子[肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、白介素-1（interleukin,IL-1）和IL-6,干扰素-γ（interferon,IFN-γ）],趋化因子（CCL2和CCL5）和神经营养因子（IL-4和IL-10）的表达水平。8、检验预先使用米诺环素和雷帕霉素（rapamycin,Rapa）预处理小鼠能否减轻上述组织学,电生理和行为学检测的异常表现。结果:1、我们利用活体显微成像的方法观察到:ICV注射SLE血清后导致小鼠脑微血管中出现白细胞贴壁滚动和粘附现象。免疫组织切片染色结果显示SLE血清可以使小鼠大脑皮层和海马的Iba-1染色的小胶质细胞密度增加,并呈现激活状态。同时脑组织中炎性介质、趋化因子和粘附分子表达水平显着升高。应用米诺环素治疗后白细胞的贴壁滚动和粘附现象也有所减轻,并且脑组织中小胶质细胞活化明显减少,炎症分子水平降低。2、注射到外周循环血中的Anti-P IgG可以通过打开的BBB进入脑内,促使ASSR增强的同时激活脑组织中的小胶质细胞,但未造成明显的神经细胞凋亡。当脑内小胶质细胞被消除时,Anti-P IgG可导致ASSR严重降低并同时出现明显的神经细胞凋亡。3、在腹侧海马CA1区内注射Anti-P IgG可以造成小鼠的社会认知能力损害,而嗅觉和运动功能并未受到影响。同时伴有vCA1区内神经元损伤、星形胶质细胞和小胶质细胞激活,白细胞介素（IL-1β、IL-6）和TNF-α等炎症因子的产生增加,而IL-4和IL-10的产生减少。预先应用Rapa治疗可以缓解Anti-P Ig G引起的社会认知功能障碍,减少神经病变及星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,同时还减少了促炎细胞因子的产生并且增加了抗炎细胞因子的产生。结论:1、我们的研究提示SLE患者血清来源的致病因素可以引起小胶质细胞活化,以及白细胞与脑微血管粘附等炎症反应,这可能是造成SLE患者BBB功能受损,外周循环中的自身抗体大量进入CNS的一个重要原因。2、SLE患者来源的Anti-P IgG可引起ASSR等脑神经电活动出现异常,而在小胶质细胞存在的情况下这种异常电活动可以恢复,但是如果失去了小胶质细胞的保护则会出现不可逆的神经损伤。3、小胶质细胞介导的神经炎症反应可能参与了Anti-P Ig G诱导的社会认知行为障碍,Rapa可以通过抑制神经炎症反应而发挥对神经功能的保护作用。
二、乙酰胆碱受体抗体脑室内注射影响大鼠EEG的机制探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙酰胆碱受体抗体脑室内注射影响大鼠EEG的机制探讨（论文提纲范文）
（1）下丘脑多巴胺受体参与手十二井穴刺络放血促进重型颅脑创伤大鼠苏醒的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 复制井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应平台 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7 受体介导井穴放血促醒研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验三 井穴放血对下丘脑多巴胺受体表达的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验四 井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2 神经元兴奋性的调控研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 针刺促进急性中枢神经损伤后昏迷苏醒机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）下丘脑orexin神经元-蓝斑底核神经通路的活动特征及功能研究（论文提纲范文）
| 英文缩略一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 蓝斑底核投射的orexin神经元活动特征 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 蓝斑底核投射的orexin神经元功能及环路机制初步研究 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Orexin神经元群参与睡眠/觉醒调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 学习期间在投和已发表的论文 |
| 致谢 |
（3）热敏灸对AD模型大鼠Aβ转运代谢功能的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 祖国医学对阿尔茨海默病的研究现状 |
| 1.阿尔茨海默病的概念 |
| 2.阿尔茨海默病的病因病机 |
| 3.阿尔茨海默病的针灸治疗 |
| 第二节 现代医学对阿尔茨海默病的研究现状 |
| 1.阿尔茨海默病的概念 |
| 2.阿尔茨海默病的病因及致病机理 |
| 3.阿尔茨海默病的发病机制 |
| 4.阿尔茨海默病的西医治疗 |
| 第三节 热敏灸研究现状 |
| 1.热敏灸理论研究现状 |
| 2.热敏灸基础研究现状 |
| 3.热敏灸临床研究现状 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 水迷宫测定造模研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.水迷宫测定AD大鼠造模结果 |
| 第二节 热敏灸对Aβ_(1-42)诱导的AD模型大鼠空间学习记忆能力的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果与分析 |
| 第三节 热敏灸对AD模型大鼠海马区形态学的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.小结 |
| 第四节 热敏灸对AD模型大鼠脑组织中α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶含量的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.小结 |
| 第五节 热敏灸对AD模型大鼠脑海马组织中Aβ代谢及转运相关蛋白表达的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 分析与讨论 |
| 1 动物模型的选择依据 |
| 2 治疗方法的选择依据 |
| 3 艾灸时间的选择依据 |
| 4 穴位的选择依据 |
| 5 热敏灸干预AD模型大鼠Aβ转运代谢的机制探讨 |
| 6 不同组别之间治疗结果的差异及分析 |
| 7 影响实验的因素及其控制方法 |
| 8 本研究的创新性 |
| 9 研究不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（4）下丘脑orexin-脑桥尾侧网状核和背外侧被盖底核神经通路调控肌张力的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 下丘脑orexin-PnC神经通路的构筑及生理学作用研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 下丘脑orexin-PnC神经通路的肌张力调控效应研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 下丘脑orexin-PnC神经通路促进肌张力的功能意义研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 下丘脑orexin-SLD神经通路调控肌张力的功能意义研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Orexin能神经系统调控运动功能及其缺陷导致运动障碍的神经机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）参枝苓口服液对拟SAD小鼠的髓鞘保护作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一 阿尔茨海默病啮齿类动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 PI3K/Akt-mTOR通路参与髓鞘维护的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 双侧侧脑室注射STZ拟SAD小鼠模型的AD相关病理变化和髓鞘改变 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠模型认知能力影响的时效关系 |
| 2.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月Aβ_(42)表达水平的影响 |
| 3.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月p-tau蛋白表达水平的影响 |
| 4.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月糖代谢相关蛋白的影响 |
| 5.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月髓鞘超微结构的影响 |
| 6.双侧icv-STZ对拟SAD小鼠造模后4个月髓鞘相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 参枝苓口服液对拟SAD模型认知能力的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Morris水迷宫平均潜伏期的影响 |
| 2.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Morris水迷宫平均游泳距离的影响 |
| 3.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠空间探索和记忆保持能力的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 参枝苓口服液对拟SAD模型髓鞘损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘LFB染色的影响 |
| 2.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘超微结构的影响 |
| 3.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠g-ratio的影响 |
| 4.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘相关糖蛋白(MAG)表达的影响 |
| 5.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘碱性蛋白(MBP)表达的影响 |
| 6.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)表达的影响 |
| 7.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)表达的影响 |
| 8.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠MAG、MBP、MOG、PLP mRNA的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 参枝苓口服液对拟SAD模型PI3K/Akt-mTOR通路相关蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠PI3K表达的影响 |
| 2.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-PI3K表达的影响 |
| 3.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Akt表达的影响 |
| 4.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-Akt表达的影响 |
| 5.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠mTOR表达的影响 |
| 6.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-mTOR表达的影响 |
| 7.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠p-S6K1表达的影响 |
| 8.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠PI3K mRNA的影响 |
| 9.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠Akt mRNA表达的影响 |
| 10.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠mTOR mRNA表达的影响 |
| 11.参枝苓口服液对双侧icv-STZ小鼠S6K mRNA表达的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）Orexin能信号系统对蓝斑底核和巨细胞网状核神经元网络的调控作用及行为学效应研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Orexin能信号系统调节SLD神经元网络活动及脑功能状态的在体研究 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Orexin能信号系统对SLD调控作用的行为学效应研究 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Orexin对巨细胞网状核神经元活动的调控作用及机制研究 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Orexin神经系统维持睡眠/觉醒稳态的研究进展 |
| 参考文献 |
| 学习期间在投论文 |
| 致谢 |
（7）基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一“从心论治”阿尔茨海默病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 PI3K/Akt及其相关信号通路在AD中研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 参枝苓口服液对APP~(swe)/PS1~(dE9)双转基因AD模型小鼠认知行为及髓鞘的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 参枝苓口服液对Aβ_(42)致少突胶质细胞OLN-93损伤的保护作用机制 |
| 参考文献 |
| 实验一 UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液含药血清主要化学成分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93拟AD体外模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 参枝苓口服液含药血清及多奈哌齐对OLN-93细胞安全剂量及有效剂量筛选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 参枝苓口服液含药血清对Aβ_(42)损伤OLN-93细胞髓鞘相关蛋白及PI3K/Akt-mTOR通路的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 参枝苓口服液对Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93的乙酰化组蛋白与MBP基因相互作用影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 参枝苓口服液对Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93脂质代谢的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在问题和不足 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）腹侧中脑导水管周围灰质ATP受体神经元参与井穴刺络法干预重型颅脑创伤大鼠促醒的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 井穴刺络法改善重型颅脑创伤昏迷大鼠意识状态的效应平台研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 脑内神经投射受体P2RX3/P2RX7/TRPV1介导井穴刺络法促醒效应研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验三 井穴刺络法对腹侧中脑导水管周围灰质醒觉相关神经元的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 大鼠神经功能缺陷评分量表 |
| 综述 针刺联合间充质干细胞治疗急性中枢神经损伤性疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）小胶质细胞Tak1介导肥胖相关脑血管功能障碍的研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗体验证 |
| 2.2 营养性肥胖小鼠脑血管存在结构异常和功能障碍 |
| 2.3 营养性肥胖小鼠小胶质细胞中Tak1被激活 |
| 2.4 ob/ob小鼠脑血管发生结构异常和功能紊乱 |
| 2.5 药物抑制Tak1能够显着改善肥胖相关的脑血管功能障碍 |
| 2.6 小胶质细胞特异性敲除Tak1能够显着改善肥胖相关的脑血管功能障碍 |
| 2.7 脑干小胶质细胞中特异性活化Tak1导致脑血管结构和功能异常 |
| 2.8 肥胖导致脑干小胶质细胞产生过量的IL-18 |
| 2.9 抑制Tak1活性能够抑制IL-18的表达 |
| 2.10 敲除小胶质细胞Tak1能够抑制IL-18的表达 |
| 2.11 Tak1活化导致小胶质细胞过量分泌IL-18 |
| 2.12 IL-18 抑制内皮细胞e NOS的活性 |
| 2.13 阻断IL-18R能够明显改善肥胖小鼠的脑血管功能紊乱 |
| 2.14 敲除小胶质细胞中Tak1能显着改善肥胖相关的缺血性脑卒中的预后 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肥胖的影响因素 |
| 3.2 肥胖者机体常伴随炎症反应 |
| 3.3 肥胖引起胶质细胞增生 |
| 3.4 小胶质细胞Tak1与脑血管功能障碍 |
| 3.5 IL-18与脑血管功能紊乱 |
| 3.6 Tak1与缺血性脑卒中 |
| 4 总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 脑血管疾病的研究进展 |
| 1 肥胖与心脑血管疾病的关系 |
| 1.1 流行病学 |
| 1.2 肥胖是脑血管疾病的重要危险因素 |
| 1.3 肥胖导致脑血管结构和功能发生改变 |
| 2 肥胖常伴随中枢神经系统的低水平、慢性炎症 |
| 2.1 炎症和神经炎症 |
| 2.2 肥胖与下丘脑神经性炎症 |
| 2.3 肥胖与下丘脑以外脑区的神经性炎症 |
| 3 Tak1与免疫反应 |
| 3.1 Tak1蛋白激酶 |
| 3.2 Tak1与IKK/NF-κB信号通路 |
| 3.3 Tak1在胶质细胞中的作用 |
| 3.4 Tak1对于炎症性疾病的治疗干预 |
| 4 肥胖相关脑血管疾病研究进展 |
| 4.1 脑卒中 |
| 4.2 痴呆和认知障碍 |
| 5 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 (博士研究生期间工作小结) |
| 致谢 |
（10）小胶质细胞在系统性红斑狼疮自身抗体诱导的脑认知障碍中的作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器及耗材 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 血清收集和Anti-P IgG的纯化 |
| 2.2.3 小鼠侧脑室套管植入及微量注射 |
| 2.2.4 米诺环素给药处理 |
| 2.2.5 小鼠脑血管活体显微成像 |
| 2.2.6 小鼠听皮层电极植入手术过程 |
| 2.2.7 电生理记录和声音刺激 |
| 2.2.8 BBB开放,Anti-P IgG注射及脑电图记录 |
| 2.2.9 电生理数据采集与分析 |
| 2.2.10 建立小胶质细胞消除模型 |
| 2.2.11 小鼠腹侧海马套管植入手术 |
| 2.2.12 海马vCA1区局部微量注射 |
| 2.2.13 Rapa给药处理 |
| 2.2.14 行为测试 |
| 2.2.15 脑组织取材及切片制作 |
| 2.2.16 免疫荧光染色 |
| 2.2.17 实时荧光定量PCR检测脑组织内细胞因子表达水平 |
| 2.2.18 数据分析 |
| 实验一 :侧脑室注射SLE血清对小鼠脑小胶质细胞及微血管内白细胞活动的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 ICV注射SLE血清后激活小胶质细胞 |
| 3.2 SLE血清触发白细胞向CNS募集 |
| 3.3 SLE血清注射导致脑微血管内皮细胞活化 |
| 3.4 SLE血清诱导脑组织内炎症因子和趋化因子水平升高 |
| 3.5 米诺环素治疗缓解了SLE血清诱导的小胶质细胞活化及炎症反应 |
| 实验二 :SLE患者Anti-P IgG对大脑听觉稳态反应的损害及小胶质细胞的保护作用 |
| 4 结果 |
| 4.1 Anti-P IgG造成ASSR反应一过性增强 |
| 4.2 Anti-P IgG激活小胶质细胞 |
| 4.3 当小胶质细胞缺失时Anti-P IgG造成ASSR不可逆损害 |
| 4.4 小胶质细胞缺失后Anti-P IgG导致神经元数量减少 |
| 实验三 :Anti-P IgG对腹侧海马CA1 区介导的社会认知功能的影响 |
| 5 结果 |
| 5.1 Anti-P IgG损害小鼠社会认知记忆能力 |
| 5.2 Anti-P IgG对嗅觉和运动功能无显着影响 |
| 5.3 Anti-P IgG导致海马神经元数量减少及胶质细胞活化 |
| 5.4 Anti-P IgG增加促炎细胞因子的产生 |
| 5.5 Rapa缓解Anti-P IgG导致的社交认知记忆障碍 |
| 5.6 Rapa缓解Anti-P IgG导致的神经数量减少及胶质细胞活化 |
| 5.7 Rapa抑制Anti-P IgG诱导的促炎细胞因子产生 |
| 6 讨论 |
| 6.1 SLE患者血清诱导的小胶质细胞活化及微血管内白细胞响应 |
| 6.2 ASSR与 Anti-P IgG诱导的神经电生理活动异常 |
| 6.3 小胶质细胞对Anti-P IgG诱导的神经损伤的保护作用 |
| 6.4 Anti-P IgG与社会认知功能障碍 |
| 6.5 Rapa对 Anti-P IgG诱导的脑功能障碍的防治作用 |
| 7 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、乙酰胆碱受体抗体脑室内注射影响大鼠EEG的机制探讨（论文参考文献）
- [1]下丘脑多巴胺受体参与手十二井穴刺络放血促进重型颅脑创伤大鼠苏醒的作用和机制研究[D]. 李威. 天津中医药大学, 2021(01)
- [2]下丘脑orexin神经元-蓝斑底核神经通路的活动特征及功能研究[D]. 庞钰洁. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]热敏灸对AD模型大鼠Aβ转运代谢功能的研究[D]. 岳瑞珍. 江西中医药大学, 2021(01)
- [4]下丘脑orexin-脑桥尾侧网状核和背外侧被盖底核神经通路调控肌张力的功能及机制研究[D]. 乔启城. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [5]参枝苓口服液对拟SAD小鼠的髓鞘保护作用机制研究[D]. 王亚晗. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]Orexin能信号系统对蓝斑底核和巨细胞网状核神经元网络的调控作用及行为学效应研究[D]. 冯慧. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [7]基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用[D]. 刘珍洪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]腹侧中脑导水管周围灰质ATP受体神经元参与井穴刺络法干预重型颅脑创伤大鼠促醒的作用机制研究[D]. 唐慧玲. 天津中医药大学, 2020
- [9]小胶质细胞Tak1介导肥胖相关脑血管功能障碍的研究[D]. 沈青. 华中科技大学, 2020(01)
- [10]小胶质细胞在系统性红斑狼疮自身抗体诱导的脑认知障碍中的作用及机制的研究[D]. 王雪娇. 中国医科大学, 2020(01)