一、肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮细胞移行及增生的作用（论文文献综述）
陈水龄[1]（2020）在《姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究》文中研究说明第一章目的采用 532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization,CNV）动物模型,为CNV的相关基础研究提供模型参考。方法1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威（Brown Norway,BN）大鼠建立实验性CNV模型,分别在光凝后1d、3d、5d、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影（Fundus Fluorescein Angiograph,FFA）和吲哚菁绿血管造影（Indocyanine green Angiography,ICGA）观察光凝后不同时间点 CNV 的变化情况。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。结果1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7d CNV生成率为70.18%,荧光素渗漏平均光密度值为128.30±11.21。光凝后14d CNV生成率为78.18%,平均光密度值为182.12±6.59,与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P<0.05）。光凝后21d,CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加,CNV中央厚度逐渐增加,光凝后7d CNV厚度为48.92±2.81μm,较光凝后1d显着增加（P<0.05）;光凝后14d CNV厚度为61.98±5.06μm,较光凝后7d显着增加（P<0.05）;光凝后21d CNV厚度为61.78±4.03μm,与14d组比较差异无统计学意义。3.CD105免疫组化结果显示:正常组视网膜组织CD105表达呈阴性,光凝后1d、3d、5d组光斑处可见少量棕黄色反应物表达,光凝后7d组光斑处棕黄色反应物逐渐增多（P<0.05）,光凝后14d组较光凝后7d组比较显着增加（P<0.05）,光凝后21d组与光凝后14d组比较差异无统计学意义。结论1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速,至21d逐渐稳定,此模型具有成模速度快,成模率高、重复性好、成本低的优点,可作为CNV基础研究的动物模型。3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CNV的变化。第二章目的观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用,以及对AKT/p-AKT/HIF-1 α/VEGF信号通路活性的影响,为姜黄素治疗CNV提供实验依据。方法1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型,造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。5.采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。结果1.正常组未打激光,模型组,雷珠单抗组,姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18%、73.21%、77.19%、75.86%、74.55%,组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12±6.59、119.22±8.03、166.45±8.33、164.34±5.69、149.22±6.45;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显着升高（P<0.05）,其中姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。光凝后14d,雷珠单抗组CNV中央厚度较模型组显着减少（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着减少（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性,未见棕黄色反应物。光凝后14d,模型组光斑处AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）;姜黄素低剂量组、中剂量组AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组的表达较模型组显着降低（P<0.05）;较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。4.mRNA结果显示:光凝后14d,模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。5.Westernblot结果显示:光凝后14d,AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。p-AKT蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低、中剂量与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。VEGF蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低剂量组与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。结论1.高剂量姜黄素（400mg/Kg/d）对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活,降低相关因子的表达有关。第三章目的观察姜黄素对氯化钴（CoCl2）诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19（adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19）细胞缺氧模型中 AKT、HIF-1 α 和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。方法1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型,应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度,同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。结果1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加,ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制,当CoCl2终浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。姜黄素终浓度在0-100μM时,ARPE-19细胞活性未见异常;当浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。雷珠单抗在终浓度为20μg/mL时,细胞活性较CoCl2组显着降低（P<0.05）,与正常组比较差异无统计学意义;当浓度为40μg/mL、80μg/mL时,细胞活性较CoCl2组和正常组均显着降低（P<0.05）。因此,我们选择终浓度100μM的CoCl2作为造模浓度;终浓度6.25μM、25μM、100μM的姜黄素作为低、中、高剂量组浓度;终浓度为20μg/mL的雷珠单抗作为阳性对照药物的浓度。2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）;与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。p-AKT和HIF-1α蛋白相对表达量模型组均高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）,姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。VEGF蛋白相对表达量模型组高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）,姜黄素低剂量与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。3.高剂量姜黄素（100μM）可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和 VEGF mRNA 及 p-AKT、HIF-1α 和 VEGF 蛋白的表达。4.姜黄素（100μM）对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。第四章目的观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。方法1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。结果1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响,组间差异无统计学意义。2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞水平迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组水平迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）、高（100μM）剂量组水平迁移较模型组显着减少（P<0.05）,其中,高剂量组与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞垂直迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组垂直迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组垂直迁移与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组垂直迁移较模型组显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞侵袭显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组细胞侵袭显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组细胞侵袭与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组较模型组细胞侵袭显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:模型组管腔形成较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组管腔形成较模型组显着较少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）剂量组管腔形成与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中（25μM）、高（100μM）剂量组管腔形成与模型组比较显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可显着抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显着抑制HUVEC细胞垂直迁移。2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。
张赫[2]（2020）在《藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的防治效果及分子机制研究》文中指出增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是孔源性视网膜脱离或严重眼外伤的严重并发症,且预后较差。PVR是视网膜脱离（retinal detachment,RD）复位手术失败的主要原因,发生于视网膜神经上皮层前、后面及玻璃体后表面形成的一层纤维细胞组织膜,膜的增生、收缩形成视网膜的固定皱褶,并发展为视网膜多种形式收缩、牵拉,其发病率为5-10%。增生性玻璃体视网膜病变实际上是一种组织损伤、修复反应的病理生理过程,其形成机制极为复杂。疾病的发病机制主要参与者视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）的增殖和移行是发病的关键,整个病理机制由多种生物因子,细胞因子和炎症因子参与。RPE细胞在眼球发育和神经视网膜正常运作和维护中发挥着重要作用,它位于Bruch膜和视网膜中间,是一种高度分化的单层细胞。可以把营养物质从脉络膜运输到光感受器,吞噬脱落的光感受器外节,维持血-视网膜屏障等重要作用。当视网膜脱离发生后,血-视网膜屏障破坏,RPE细胞暴露在血清和玻璃体中。玻璃体中多种细胞因子刺激RPE细胞移行进入玻璃体腔内,进而增殖和转化,形成视网膜前增殖膜。此外,既往研究表明PVR患者玻璃体视网膜牵拉膜中存在细胞凋亡。细胞凋亡在某些眼科疾病的发展中起重要作用。在生长因子中,血小板衍生因子（PDGF）包括:PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD,通过二硫键形成同型或异型二聚体（PDGF-AA,-BB,-AB,-CC,和-DD）。PDGF参与细胞分化、增殖、凋亡和移行等多种重要的生物学活动。在眼科学研究表明,PDGF增强了成纤维细胞和RPE细胞的收缩。各项体内研究中发现,PVR患者及动物模型的玻璃体中均能检测出PDGF含量增多,在做了激光手术后的视网膜脱离患者和PVR小鼠模型的RPE细胞中,检测出PDGF表达是提高的。PDGF-BB作用于血管细胞、RPE细胞和神经胶质细胞的增殖和迁移,而PDGF-AA作用于非血管细胞的增殖和迁移。藏红花酸,藏红花的提取物之一,是一种类胡萝卜素物质,已被证明有多种生物学功能,如对多种细胞有抗增殖,抗炎等作用。在我们之前的研究中已经证实藏红花酸对ARPE-19细胞的增殖、迁移及间质转化有抑制作用。在本次研究,我们在体外试验中为ARPE-19细胞提供稳定的病理环境即加入稳定剂量的PDGF-BB,研究藏红花酸对PDGF-BB诱导下ARPE-19细胞作用及机制,在体内试验中拟以兔眼PVR模型为研究对象,在体内和体外两个层面加以研究。第一部分藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞在PDGF-BB诱导下的增殖,迁移及凋亡的影响及机制目的:本实验研究藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞在PDGF-BB诱导下的增殖,迁移和凋亡的影响及相关机制。方法:首先设置不同的药物浓度梯度（0μM,10μM,30μM,100μM,200μM,300μM,400μM,500μM和1000μM）,通过计算IC50筛选出实验中藏红花酸的作用浓度。将不同浓度的藏红花酸（0μM、100μM、200μM、400μM）和PDGF-BB作用于ARPE-19细胞,应用CCK-8实验检测藏红花酸对被PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞增殖的影响;用Ed U试剂盒进一步证明藏红花酸的抑制作用;用划痕实验和Transwell实验验证藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞迁移的作用;用Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞凋亡的影响;用Western blot检测不同浓度的藏红花酸对PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞凋亡的相关蛋白Bax、Bak（促凋亡蛋白）和Bcl-2、Bcl-x L（抗凋亡蛋白）表达的影响。结果:低浓度的藏红花酸（100μM）的细胞增殖抑制率在72h时有明显的提高,而中浓度藏红花酸（200μM）和高浓度藏红花酸（400μM）干预后的细胞增殖抑制率升高呈浓度依赖和时间依赖性;被藏红花酸作用的细胞的Ed U转染概率比对照组降低了,且呈浓度依赖性,结果与CCK-8相符;划痕实验中,作用48小时和72小时,各种浓度的药物对细胞的迁移有明显抑制;Transwell实验结果分析,我们发现藏红花酸对细胞迁移的抑制作用呈浓度依赖;Annexin V-FITC/PI双标法流式细胞术检测发现藏红花酸诱导了PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡,且随浓度的增加促进细胞凋亡的能力越强;western blot蛋白检测藏红花酸能够显着的抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L的表达（P<0.01）,并且增加了促凋亡蛋白Bax、Bak的表达（P<0.01）,均呈浓度依赖性。小结:藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移,并且诱导PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡。第二部分藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活目的:验证藏红花酸可能参与的信号通路。方法:使用western blot蛋白检测不同浓度藏红花酸（0μM、100μM、200μM、400μM）对PDGF-BB诱导的PDGFR磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活的影响。结果:不同浓度的藏红花酸均能抑制PDGFRβ的磷酸化,且对下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活均有显着的抑制作用。小结:藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活。第三部分藏红花酸治疗兔眼玻璃体视网膜病变的实验研究目的:进一步检测藏红花酸对治疗兔眼玻璃体视网膜病变的相关研究。方法:选用20只成年色素兔,随机分为实验组和对照组,每组10只。实验组玻璃体腔内注射2×105cells/0.1ml DMEM/F12的ARPE-19细胞悬液、2.5μl 20μg/m L的PDGF-BB、0.4μmol藏红花酸,对照组玻璃体腔注射ARPE-19细胞、2.5μl 20μg/m L的PDGF-BB、0.1ml PBS（含2%DMSO）。于3天、7天、14天及28天对其进行裂隙灯和眼底镜检查。于7天、14天及28天行暗适应视网膜电图检查和OCT检查,第28天处死实验兔取眼球标本作组织学检测,检测指标为p-AKT、p-p38、p-PI3K、p-ERK和p-JNK。结果:各组实验动物眼底情况在不同的时间点根据Fastenberg分级并进行统计学分析。造模后第7天:对照组0级4只,1级3只,2级2只;实验组0级8只,1级1只。造模后第14天:对照组1级5只,2级3只,3级1只;实验组0级2只,1级6只,2级1只。造模后第28天:对照组2级1只,3级2只,4级3只,5级3只;实验组1级2只,2级5只,3级2只。眼底相和OCT显示:造模后第7天,对照组玻璃体混浊较实验组严重,可以观察到增殖膜,实验组玻璃体轻度混浊,视网膜结构正常。造模后第14天,对照组玻璃体混浊,可见灰白色纤维条索和增殖膜,髓线处视网膜有脱离,实验组玻璃体轻度混浊,可观察到增殖膜。造模后第28天,对照组可见广泛的视网膜皱褶和脱离,实验组可见增殖膜及牵拉导致的视网膜脱离。ERG检查结果:第7天注药后的眼睛b波振幅较对侧眼没有明显变化,14天和28天后注药的眼睛b波振幅较对侧眼轻度下降,而对照组在第14天和28天后b波振幅较对侧眼明显下降。组织病理学结果:HE染色对照组神经节细胞层水肿,内外核层细胞排列混乱,光感受器细胞外节丢失。实验组视网膜全层结构清晰,形态正常,视神经节细胞层、内外核层细胞排列整齐。p-Akt、p-ERK和p-JNK免疫组织化学染色,对照组视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见强表达,实验组的视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见较低表达。视网膜未见阳性染色。p-PI3K和p-p38免疫组织化学染色,对照组视盘前和脱离的视网膜前增殖膜可见弱表达,实验组除了增殖膜中的血管管壁有阳性表达外,视盘前和视网膜前增殖膜均未见阳性染色,视网膜未见阳性染色。小结:藏红花酸抑制了兔PVR的发病进展,对视功能有保护作用,并且降低了视网膜增殖膜中p-Akt、p-PI3K、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达。结论:1.红花酸抑制了PDGF-BB诱导的ARPE-19细胞的增殖和迁移,并且诱导PDGF-BB介导的ARPE-19细胞的凋亡。2.藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体（PDGFR）磷酸化和下游的PI3k/Akt和MAPK信号通路激活。3.藏红花酸抑制了兔PVR的发生进展,对视功能有保护作用,并且降低了视网膜增殖膜中p-Akt、p-PI3K、p-p38、p-ERK和p-JNK的表达。
余丰[3]（2018）在《三七防治兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:本实验通过制作兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变（traumatic proliferative vitreoretinopathy,t PVR）模型,观察中药三七对外伤性增殖性玻璃体视网膜病变兔视网膜中转化生长因子-β（TGF-β）及肝细胞生长因子（HGF）表达的影响,探讨中药三七对兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的防治作用。方法:采用巩膜穿通伤联合富含血小板的血浆玻璃体腔注入的方法制成外伤性PVR兔模型,将动物分成空白组、模型组、阳性对照组、三七低剂量组及三七高剂量组,三七治疗组给予不同剂量的三七粉混悬液进行灌胃,连续28天,阳性对照组一次性给予道诺霉素玻璃体腔注射,采用免疫组织化学分析的方法对兔视网膜中转化生长因子-β（TGF-β）及肝细胞生长因子（HGF）的表达进行检测和分析。结果:（1）各组眼底增生级数:给药后第1天,各组间的比较不具有统计学意义（P=0.296）;给药第7天后各组间的比较具有统计学意义（P<0.01）,且模型组与空白组的比较具有显着统计学意义（P<0.01）,阳性对照组及三七高剂量组的PVR分级低于模型组（P<0.01）,三七低剂量组与模型组的比较没有统计学意义（P>0.05）,三七高剂量组与阳性对照组间的比较没有统计学意义（P>0.05）。（2）各组的眼底增殖膜截面积:模型组兔眼底增殖膜截面积明显高于正常组,具有显着统计学意义（P<0.01）;阳性对照组、三七高剂量与模型组的比较具有显着统计学意义（P<0.01）,而三七低剂量组与模型组的比较不具统计学意义（P>0.05）。（3）各组视网膜中转化生长因子-β（TGF-β）表达情况:与空白组相比,模型组视网膜中TGF-β蛋白含量明显升高,具有显着统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,阳性对照组及三七高剂量组中TGF-β蛋白含量降低,具有显着统计学意义（P<0.01）,三七低剂量组中TGF-β蛋白含量亦降低,具有统计学意义（P<0.05）。（4）各组视网膜中肝细胞生长因子（HGF）表达情况:与空白组相比,模型组兔视网膜中HGF蛋白含量明显升高,具有显着统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,三七低剂量组HGF蛋白含量无明显差异（P>0.05）,阳性对照组、三七高剂量组HGF蛋白含量明显降低,具有显着统计学意义（P<0.01）。结论:本研究通过巩膜穿通伤联合富含血小板的血浆玻璃体腔注入的方法成功制成了兔外伤性PVR模型。研究发现中药三七可减轻外伤性PVR兔眼底的增生程度及抑制眼底增殖膜的形成,同时可降低TGF-β、HGF在视网膜上的表达,从而起到防治外伤性PVR的作用。
陈臻,杨峥嵘,倪宁华[4]（2016）在《增殖性玻璃体视网膜病变发生机制及治疗进展》文中指出增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）为造成牵拉性视网膜脱离,从而导致视网膜手术失败及患者失明的主要原因.造成PVR的因素复杂,因此,对PVR发生和发展机制进行探索,能够为寻找新的治疗手段奠定基础.本文就PVR形成的原因及多种因素等方面做一综述.
任彦新[5]（2016）在《姜黄素在增殖性玻璃体视网膜病变中对表皮生长因子的作用》文中进行了进一步梳理增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是1983年由美国视网膜专家协会提出用来描述孔源性视网膜脱离（rhegmatogenous retinal detachment,RRD）等疾病后玻璃体和/或视网膜前后面特异细胞增殖形成可以收缩的细胞性膜,进而引起视网膜牵拉、脱离与固定的一种病变,是一种常见的难治性致盲性眼病。据报道,5%10%的RRD可继发PVR,而在复发性视网膜脱离（retinal detachment,RD）中,PVR的发生率增至75%。近年来,随着对PVR病理机制研究的逐渐深入,越来越多的研究发现表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）在RPE细胞的迁移、增生中起重要作用,是促进RPE细胞发生迁移进而发生PVR过程的关键因素之一。目前,临床上治疗PVR的主要方法就是玻璃体视网膜手术,但手术治疗效果并不理想,术后PVR的复发率较高。因此,随着对各种细胞和生长因子在PVR致病过程中作用机制了解的加深,针对PVR发展的不同阶段和相关因子采取不同药物来预防和治疗PVR成为目前进行研究的热点,并成为主流趋势。到现阶段为止,药物研究主要集中在西药领域,主要包括以下几类:皮质类固醇、维生素及其衍生物、抗代谢药、细胞外基质合成抑制剂和细胞信号转导抑制剂等。虽然应用西药来防治PVR的研究已有数年之久,但是由于其在眼内有较大的毒副作用、较单一的药理作用、较昂贵的价格等诸多的局限性致使迄今仍无一种特效的药物能够成功的在临床上得到广泛的应用。目前在西药上的研究难以取得突破性进展,那么应用我国传统中药来防治PVR的研究成为了充满希望的突破方向。中药具有药源丰富、作用广泛且毒副作用小等诸多优点,姜黄素是存在于姜科姜黄属植物根茎中的一种天然的中药单体成分,具有多种药理作用,例如抗炎症、抗细胞增生、抗微生物等。姜黄素的药理作用可以满足PVR防治药物的条件,并且安全性高、毒性低、药源广泛、价格低廉。我们的前期研究发现姜黄素具有抑制视网膜色素上皮细胞增殖的作用,那么姜黄素对在PVR形成过程中起重要作用的表皮生长因子是否有作用,本课题分别通过体外细胞实验和体内玻璃体腔注射姜黄素的动物实验研究姜黄素在pvr防治过程中对egf的作用和相关机制,为pvr的防治提供依据。第一部分表皮生长因子对体外培养的rpe细胞的作用及其在rpe细胞内的表达目的:研究egf对体外培养的兔rpe细胞的作用,探讨egf促进rpe细胞增殖的最佳质量浓度;观察egf在rpe细胞内的表达情况。方法:提取、培养青紫蓝兔rpe细胞,传至第三代并鉴定后,选取生长状态良好的第3代rpe细胞进行实验。将rpe细胞种植在载玻片上制备成细胞爬片,做免疫细胞化学染色进行rpe细胞鉴定和观察rpe细胞内egf的表达情况;将egf分为3、6、9、12ng/ml不同浓度组及空白对照组（10%fbs.dmem）4组;每组各设6个复孔,共接种3块培养板,加药后于24、48、72h随机抽取1块培养板采用四甲基偶氮唑盐（mtt）比色法检测不同浓度的egf在不同作用时间对rpe细胞增殖的影响。结果:rpe细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含有丰富黑色素颗粒,免疫细胞化学染色提示角蛋白表达强阳性。egf在兔rpe细胞的细胞质中表达阳性,呈棕黄色。在相同时间点、不同浓度egf作用下,rpe细胞的吸光度（od值）随egf的浓度增加而增加,且与对照组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。egf浓度≥9ng/ml的相邻浓度实验组两组间比较差异无统计学意义（p>0.05）。在相同浓度的egf作用下,rpe细胞吸光值（od值）随时间的增加而增加,且与相邻组比较差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:体外培养可以获得大量rpe细胞并可用于体外实验研究;egf在兔rpe细胞的细胞质中表达;egf对体外培养兔rpe细胞增生的调控存在一定的剂量-效应关系、时间-效应关系。egf对rpe细胞的促生长作用在9ng/ml以上逐渐达到饱和。研究结果提示:促体外培养的兔rpe细胞增殖的egf的最佳浓度为9ng/m1。第二部分姜黄素对体外培养的rpe细胞中egf表达的抑制作用目的:研究不同浓度的姜黄素对体外培养的rpe细胞中egf表达的影响,应用免疫细胞化学染色方法检测兔rpe细胞中egf的表达情况,寻找姜黄素抑制egf表达的最佳浓度;应用rt-pcr法、westernblot法检测姜黄素对兔rpe细胞中egfmrna和蛋白表达的影响,探讨姜黄素抑制egf的作用机制。方法:选取生长状态良好的兔第3代rpe细胞在盖玻片上制备成细胞爬片进行实验。分为空白对照组（含0.5‰dmso的10%fbs.dmem）和10、15、20ug/ml姜黄素4组;每组各设6个复孔,共接种3块培养板,加药后24、48、72h时随机抽取1块培养板行免疫组织化学染色,观察rpe细胞内egf的表达情况。rt-pcr、westernblot分别检测空白对照组（含0.5‰dmso的10%fbs.dmem）、姜黄素（15ug/ml）、egf（9ng/ml含0.5‰dmso）、egf（9ng/ml）+姜黄素（15ug/ml）作用24、48、72h后rpe细胞中egfmrna和蛋白表达的影响。结果:1不同浓度姜黄素对rpe内egf表达的抑制作用:时间依赖性:姜黄素各浓度组对rpe细胞内egf表达的抑制作用均随作用时间的延长而增强,各时间点之间差异均有统计学意义（p<0.05）,姜黄素对rpe细胞内egf表达的抑制作用具有时间依赖性。剂量依赖性:姜黄素各时间点对rpe细胞内egf表达的抑制均随药物质量浓度的增高而增强,除姜黄素15ug/ml和20ug/ml组之间差异无统计学意义（p>0.05）外,其余各质量浓度之间差异均有统计学意义（p<0.05）。2姜黄素对rpe细胞内egfmrna转录的影响:向培养液中加入姜黄素使其浓度为15ug/ml,在24h、48h、及72h检测egf的mrna含量,可见随时间延长细胞内egf的mrna表达量下降,和对照组相比较,差异有统计学意义（p<0.05）;不同时间点间做比较,相邻时间点组间相比差异均有统计学意义（p<0.05）。姜黄素对egf作用下rpe细胞中egfmrna表达量在各时间点和对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）,不同时间点间,相邻的时间组相比较差异均有统计学意义（p<0.05）。3姜黄素对rpe细胞内egf蛋白表达的影响:向培养液中加入姜黄素使其浓度为15ug/ml,作用24h、48h、及72h,随着时间的延长细胞内egf蛋白表达量逐渐下降,与对照组相比较差异有统计学意义（p<0.05）;不同时间点间,相邻的时间组间相比较差异均有统计学意义（p<0.05）。姜黄素对egf作用下rpe细胞中egf蛋白表达量在各时间点和对照组比较差异有统计学意义（p<0.05）,不同时间点间,相邻的时间组相比差异均有统计学意义（p<0.05）。结论:姜黄素在体外抑制兔rpe细胞内egf的表达,最佳抑制浓度是15ug/ml,姜黄素在体外可显着抑制兔rpe细胞内egfmrna和蛋白的表达。第三部分姜黄素在兔眼增殖性玻璃体视网膜病变中对egf作用的实验研究目的:研究姜黄素在体内兔眼增殖性玻璃体视网膜病变形成过程中对egf的作用及对pvr的防治作用。方法:选择正常青紫蓝兔30只,所有兔在玻璃体注射前均抽出0.2ml玻璃体,随机选取一眼纳入对照组:共30眼,玻璃体腔注射0.1ml（2×106）培养的生长状态良好的第三代同种rpe细胞和含0.5‰dmso的生理盐水0.1ml;另一眼纳入实验组:共30眼,玻璃体腔注射0.1ml（2×106）培养的生长状态良好的同种第三代rpe细胞和质量浓度为1mg/ml的姜黄素0.1ml。注射后3、7、14、21、28天进行裂隙灯显微镜检查观察眼前节和前部玻璃体情况,间接眼底镜检查观察眼底情况,眼底彩色照相,眼部b超检查观察玻璃体浑浊情况和视网膜有无脱离及脱离的程度,检查完毕后,在每个时间点随机抽取6只兔,12只眼,对照组6只眼,实验组6只眼,分别抽取玻璃体,采用兔表皮生长因子elisa试剂盒检测玻璃体液中egf的含量。结果:1前房反应:玻璃体腔注射后第3天对照组和实验组兔眼前房内均可见少量浮游物,第7天时均消退。2玻璃体和视网膜情况:第3天两组玻璃体均有浑浊,实验组玻璃体混浊轻,第7天时玻璃体内有增殖膜形成,对照组增殖膜多且厚,实验组增殖膜局限且薄;第14天时对照组视网膜脱离发生率（11/18）61%,实验组玻璃体内增殖膜较薄,视网膜脱离发生率（2/18）11%;第21天时对照组视网膜脱离发生率（8/12）67%,增殖膜上可见新生血管,实验组视网膜脱离发生率（2/12）16%,视网膜脱离范围小,第28天对照组视网膜脱离渐加重,并有新生血管生长,视网膜脱离发生率（5/6）83%,实验组视网膜脱离局限,发生率（1/6）16%;视网膜脱离发生率实验组和对照组比较差异显着,有统计学意义（p<0.05）。3玻璃体中egf含量测定（elisa结果）:玻璃体液中egf含量对照组较高,实验组较少,各时间点实验组和对照组比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:玻璃体腔内注射姜黄素可以有效抑制RPE细胞诱导的兔眼实验性PVR形成过程中表皮生长因子的水平,进而抑制PVR的发生和发展。
陈臻[6]（2016）在《LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究》文中进行了进一步梳理研究背景增殖性玻璃体视网膜病变（Proliferative vitreoretinopathy,PVR）是孔源性视网膜脱离（rhegmatogenous retinal detachment,RRD）以及行视网膜复位手术后的一种并发症。PVR的病理变化涉及细胞去极化、迁移、黏附、增殖等一系列细胞活动过程,此外还与分泌胶原等细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的异常有关;经过上述病理过程之后,在视网膜前后表面以及玻璃体中将形成具有收缩能力的增殖膜,由于后者的收缩,从而造成牵拉性视网膜脱离（tractional retinal detachment,TRD）。在近年来的研究中,PVR的发生以及其机制一直是眼底病研究的热点及难点。视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）处于视网膜光感受器细胞层的外围,其结构由一层排列整齐的六角形细胞组成。目前的研究已证实,RPE细胞对PVR的发生和发展至关重要。上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）为PVR的发生和发展过程中的重要环节。EMT是指具有上皮样表型的细胞,当其失去极性后活动能力增强,在细胞间质之间能够自由移动并且表现出纤维样表型的转化过程。EMT通常分为三种亚型:其一,是原肠胚形成,机体中原始的上皮细胞通过EMT参与多种细胞的生物胚胎发育及器官的形成中;其二,为内皮或者第二上皮转化为组织成纤维细胞,从而在机体的伤口愈合以及器官的纤维化过程中发挥重要作用;其三,是上皮来源的细胞失去极性,从而转化为具有侵袭能力的细胞。转化生长因子β活化激酶-1（transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1）为MAP3K家族中的主要成员之一,属于色氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其活性受到TGF-β以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）的调控。在生物机体中,TAK1经由P38、JNK以及NF-κB通路活化实现对一系列特异性细胞转录因子的调控,从而影响细胞的生存、分化等生理病理过程,同时还对炎症反应具有调控作用。由于tak1功能具有多样性,因此tak1在炎症性疾病中成为了主要的靶激酶。除此之外,tak1还参与了mkk3/4-p38/jnk-ap-1以及ikk-nf-κb等重要信号转导通路的活化,对细胞的存活、分化以及炎症应答具有十分重要的调控作用。转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,tgf-β）为一类新发现的具有对细胞分化和生长起调节作用的多功能细胞因子,大量研究证实,tgf-β是目前已知的具有促进组织纤维化的最重要的细胞因子,其在肾纤维化、肝纤维化和肺纤维化的患者血液中高表达。研究表明,tgf-β在pvr的发生和发展过程中发挥了重要作用,但其具体作用和机制并不十分清楚,尚需进一步深入研究。目的本课题旨在明确:1.tak1在tgf-β1诱导的人rpe细胞间质化过程中的作用;2.探讨tak1抑制剂lytak1对rpe细胞间质化的作用;3.研究lytak1对rpe细胞间质化的作用机制,旨在为pvr的治疗奠定实验基础。方法1.采用elisa法检测2014年6月2014年12月期间在云南省第一人民医院眼科30例pvr患者、20例imh患者以及同期15例正常志愿者,分别检测玻璃体液和/或外周血中tgf-β1和tak1的表达水平。所有患者的年龄均在4565岁之间。其中,pvr患者中有男性为18例,女性为12例;imh患者中男性为8例,女性为12例;健康志愿者中男性为9例,女性为6例。2.将0.01ng/mltgf-β1作用于人rpe细胞株arpe-19,培养24h后采用荧光定量pcr法检测细胞中tak1mrna的表达;分别用不同浓度的lytak1（0μm、1μm、10μm、25μm、50μm）作用于0.01ng/mltgf-β1诱导后的arpe-19细胞,westernblot法检测细胞中tak1蛋白的表达;transwell小室法检测细胞的侵袭能力;流式细胞术（annexinv-fitc/pi双染色法）检测细胞的凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞的迁移能力。3.采用荧光定量pcr法分别检测对照组、tgf-β1+dmso组以及tgf-β1+lytak1组arpe-19细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-sma）和纤维粘连蛋白（fibronectin）mrna的表达。采用westernblot法分别检测对照组、tgf-β1+dmso组以及tgf-β1+lytak1各浓度组（0μm、1μm、10μm、25μm、50μm）arpe-19细胞中a-sma、fibronectin、p-smad2、p-smad3、ikkα、nf-κbp65蛋白的表达。结果1.pvr和imh两组间tak1的浓度存在显着差异（t=3.114,p=0.035<0.05）,即pvr患者玻璃体中tak1的浓度显着高于imh组;对pvr和正常组两组的间血清tak1浓度是否存在差异性进行比较分析,结果表明两组间tak1的浓度存在显着差异（t=3.156,p=0.034<0.05）,即pvr患者血清中tak1的浓度显着高于imh组。上述结果表明,pvr患者玻璃体以及血清中tak1的含量均显着高于imh患者,血清中的tak1含量也明显高于健康人群,提示其可能对pvr的发生以及发展过程具有促进作用。pvr患者、imh患者以及健康志愿者的玻璃体液和/或血清中tgf-β1的浓度存在显着差异（t=2.319,p=0.033<0.05）,即pvr患者玻璃体中tgf-β1的浓度显着高于imh组。对pvr和正常组两组间的血清tgf-β1浓度是否存在差异性采用t检验进行比较分析,结果表明两组间tgf-β1的浓度存在显着差异（t=3.312,p=0.037<0.05）,即pvr患者血清中tgf-β1的浓度显着高于imh组。上述结果表明,pvr患者玻璃体和/或血清中tgf-β1的含量均显着高于imh患者以及健康人群,提示其与pvr的发生以及发展过程有关。2.荧光定量pcr检测结果表明,tgf-β1处理组arpe-19细胞中tak1mrna的表达显着高于对照组,tgf-β1能够明显增高tak1蛋白的表达,而当用不同浓度的lytak1作用细胞后,细胞中tak1蛋白的表达量均发生不同程度的降低（p<0.05）,其中当lytak1的浓度为25μm时tak1蛋白的表达量最低。cck-8检测表明,当lytak1作用24h时,各浓度组细胞的增殖活性均未见显着变化（p>0.05）;而当lytak1作用48h以及72h之后,随着lytak1作用浓度的增加,当lytak1作用浓度为50μm时对arpe-19细胞的增殖活性的抑制率最高。arpe-19细胞的增殖活性逐渐降低,表明lytak1对arpe-19细胞的活性呈剂量依赖性。transwell小室法检测结果表明,lytak1各浓度组与对照组相比视野平均侵袭细胞数量显着减少,且随着lytak1浓度的增高其侵袭细胞数量逐渐降低,提示lytak1对arpe-19细胞的侵袭具有抑制作用,且呈剂量依赖性。流式细胞术检测结果表明,随着lytak1作用浓度的升高,arpe-19细胞的凋亡率也随着上升,提示lytak1诱导arpe-19细胞凋亡呈现一定的剂量依赖性。细胞划痕实验结果表明,48 h后各浓度LYTAK1作用组ARPE-19细胞的迁移距离较对照组明显缩短（P<0.05）;且随着LYTAK1浓度的增高,细胞的迁移距离逐渐降低,提示LYTAK1抑制ARPE-19细胞迁移呈现一定的剂量依赖性。3.与对照组相比,TGF-β1+DMSO组以及TGF-β1+LYTAK1组中a-SMA和fibronectin mRNA的表达均明显增高;而相较于TGF-β1+DMSO组,TGF-β1+LYTAK1组中a-SMA和fibronectin mRNA的表达量显着降低。Western blot法检测结果表明,TGF-β1+DMSO组细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达均显着高于对照组。TGF-β1+LYTAK1各浓度组细胞中a-SMA、fibronectin、p-Smad2、IKKα、NF-κBp65蛋白的表达随LYTAK1浓度的增高而逐渐降低,呈剂量依赖性,而LYTAK1对p-Smad3蛋白的表达无显着影响。结论1.PVR患者血清以及玻璃体中TAK1和TGF-β1的表达量显着增高,其表达上调可能与PVR的发生和发展有关。2.TGF-β1能够显着上调ARPE-19细胞中TAK1的表达;3.LYTAK1能够明显抑制ARPE-19细胞中TAK1的表达,且呈剂量依赖性;4.TGF-β1能够通过上调ARPE-19细胞中TAK1、a-SMA、fibronectin、p-Smad2、p-Smad3、IKKα、NF-κBp65的表达,促进EMT的发生和发展;而LYTAK1能够通过抑制TAK1、a-SMA、fibronectin、p-Smad2、IKKα、NF-κBp65的表达发挥抑制EMT的发生和发展。5.LYTAK1能够明显抑制ARPE-19细胞的增殖活性、细胞凋亡、侵袭及迁移,且呈剂量依赖性。
张晓光[7]（2010）在《甲酰肽受体在电场引导人视网膜色素上皮细胞层损伤修复中的作用》文中认为【研究背景】视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞层位于视网膜光感受器细胞与Bruch膜及脉络膜之间,支持着视网膜光感受器细胞,是维持视网膜结构和功能的重要组成部分。人RPE （human RPE,hRPE）细胞损伤性疾病,如年龄相关性黄斑病变（age-related macular degeneration,AMD）、增殖性玻璃体视网膜病变（proliferation vitreoretinopathy,PVR）以及视网膜色素变性等,是造成视力丧失的重要原因。RPE层一旦损伤,由病变区周围健康的RPE细胞向损伤区移行增生,以修复损伤区,这一过程对结构和功能的恢复十分重要。在细胞修复的过程中,有多种复杂的因素参与,其中伴有电场的作用。外加电场可以明显促进皮肤和角膜上皮损伤的修复。我们研究组前期的研究结果表明,在较短的时间内,电场能够引导hRPE细胞向负极移动,而且低于10 V/cm的电场强度对hRPE细胞的正常活性及分裂功能无明显不良影响。但是,单有外加电场的作用,似乎不足以促进hRPE细胞较快地移行修复缺损区。因此,我们试图寻找能够加快细胞在电场中移行的因子。有许多分子与细胞的移行有关。而人类甲酰肽受体（Formyl Peptide Receptor,FPR,1976年发现）是一种化学趋化受体,是介导细胞在一系列细胞因子的作用下移行的G蛋白偶联受体,与激动剂结合可以使PI3K,NF-κB和MAPK等激活,调节细胞的活化和移行。根据我们前期电场实验的结果,以及对FPR的文献回顾,推测可以将两者结合共同引入到促进RPE细胞移行修复的过程中,为RPE损伤性疾病的治疗提供一个新的治疗途径。【目的】1.确定FPR在hRPE细胞的表达及定位;观察激活FPR,电场引导hRPE细胞层的移行修复,以及在此过程中细胞间连接mRNA的表达和其超微结构的变化,细胞骨架的变化。2.研究此移行修复过程中PI3K/Akt信号通路的变化,Rho GTP ases家族蛋白的表达。3.研究此移行修复过程中细胞因子,如表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、白介素（interleukin 8,IL-8）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1）和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1 ）的表达和分泌。【方法】1.将hRPE细胞培养于含有fMLF（FPR经典激动剂）的培养液中,应用RT-PCR方法确定hRPE细胞表达FPR,免疫荧光染色方法着染FPR,从而进一步确定FPR在细胞上的表达与定位。根据本研究的前期实验结果,直接将细胞置于6 V/cm电场下,应用免疫荧光三标染色法着染FPR、F-actin以及胞核,通过激光共聚焦显微镜观察电场作用的hRPE细胞骨架F-actin和FPR的变化及定位关系。免疫荧光三标染色法着染细胞骨架F-actin、Vimentin及胞核,观察激活FPR促进电场引导hRPE细胞层的损伤修复以及电场引导下细胞骨架F-actin和Vimentin的变化。显微镜照相系统连续记录每1 h细胞移行的距离和细胞损伤范围的变化。并通过RT-PCR检测细胞间连接mRNA的表达,透射电子显微镜来观察细胞间连接的超微结构改变。2.初步研究激活FPR受体通过PI3K / Akt信号转导通路激活Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA,促进电场引导下hRPE细胞层移行修复。应用RT-PCR检测Cdc42、Rac和RhoA mRNA的变化,应用Western blotting检测PI3K / Akt,以及RhoA GTPases家族中Cdc42、Rac1和RhoA蛋白表达的变化。3.观察激活FPR在电场作用下,采用RT-PCR和ELISA方法检测EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表达和分泌,以及加入FPR拮抗剂,PI3K/Akt阻断剂和Rho GTP ases阻断剂后因子的表达和分泌变化。【结果】1.首次确定了hRPE细胞表面存在FPR。应用FPR经典激动剂fMLF激活hRPE细胞的FPR,通过RT-PCR检测到hRPE细胞的FPR mRNA表达。同时揭示FPR与F-actin之间存在共定位关系。在电场作用下,hRPE细胞向阴极方向伸出伪足,朝向阴极的方向移行,FPR与F-actin在细胞的伪足上共定位,而在拮抗剂Boc和激动剂fMLF作用下,hRPE细胞的FPR表达减少。在电场和FPR的作用下,可以明显促进hRPE细胞层的移行和损伤修复。将hRPE细胞培养于无血清培养液组,20%血清培养液组及fMLF培养液组,电场作用3 h后,hRPE细胞层的移行距离分别为24.262±6.82μm,40.243±5.069μm（1.7倍）,和56.926±7.821μm（2.4倍）。在无血清培养液组,20%血清培养液组和fMLF培养液组中可检测出CX-43和ZO-1 mRNA的表达,而E-cadherin mRNA的表达却分别在2 h,30 min和1 h时检测到。透射电镜可以观察到细胞间连接的的超微结构:包括紧密连接,缝隙连接,桥粒样结构和粘着斑。电场下细胞骨架的空间结构发生改变,细胞伪足朝向阴极方向,并表达F-actin,其荧光亮度在1 h时,达到峰值106.49±8.21,随后逐渐下降。2.在电场作用下,Western blotting结果显示pAkt在hRPE细胞中的表达,均在30 min时达到最高,无血清培养液组为0.6±0.012,20%血清培养液组1.36±0.093,含fMLF培养液组为2.44±0.089。加入FPR拮抗剂Boc后,发现pAkt蛋白的表达量明显降低。通过RT-PCR检测到Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA mRNA的表达在激活FPR受体后在30 min时明显增加,Western blotting的结果提示其蛋白表达量在电场作用1 h时明显增加,在含fMLF培养液组增加明显,分别为3.5±0.2,5.5±0.21,4.78±0.22,加入PI3K/Akt通路阻断剂LY294002后,Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA的表达明显降低。3.在电场作用下,RT-PCR结果显示EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1 mRNA表达在1 h时达到高峰,而ELISA结果提示培养液上清中四种因子的分泌量在2 h时,达到高峰,含fMLF培养液组四种因子的表达量和分泌量较其他组升高明显。加入FPR拮抗剂Boc,PI3K/Akt信号转导通路阻断剂LY294002以及Rho GTP ases阻断剂Y27632,发现EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表达量和分泌量下降。【结论】1.首次确定hRPE细胞表达FPR,并与细胞骨架F-actin共定位表达。激活FPR,在电场作用下,hRPE细胞发生形态和极性的改变,朝向阴极伸出伪足,向阴极移行,在细胞伪足上可见FPR与F-actin共定位,说明FPR的激活与hRPE细胞的移行修复有关。激活hRPE细胞FPR,显着促进了RPE细胞层在电场作用下的移行,并能引起细胞骨架蛋白F-actin的改变。细胞间连接mRNA的表达及其超微结构的观察,说明hRPE细胞层的损伤修复是成层移行的。2.激活hRPE细胞FPR,在电场作用下,通过PI3K/Akt信号转导通路的激活,活化Cdc42、Rac1和RhoA蛋白,说明FPR的作用至少是通过PI3K/Akt的信号转导通路实现的。3.激活hRPE细胞FPR,在电场作用下,诱导EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表达和分泌,而且与FPR激活、PI3K/Akt激活、Rho GTP ases活化相关。以上研究国内外未见相关报道。
郑炜[8]（2009）在《靶向HGF RNA干涉抑制增生性玻璃体视网膜病变中RPE细胞增殖的实验研究》文中指出增生性玻璃体视网膜病变（ Proliferative vitreoretinopathy,PVR）是指在孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后,以及眼外伤后,由于视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium,RPE）、神经胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞的迁移、增生、转分化和收缩,在视网膜前、后面及玻璃体内形成的可以收缩的细胞性膜,造成牵拉性视网膜脱离病变。大多数学者认为视网膜色素上皮细胞和神经胶质细胞的增殖和移行是PVR的发生的关键因素,目前越来越多的研究表明,肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对诱发RPE的增殖、移行,并最终导致PVR起到了重要作用。本实验针对HGF基因,应用RNA干涉（RNA interference,RNAi）技术,在HGF基因的mRNA序列上寻找三个干涉靶点,分别通过化学合成的siRNA和小发夹RNA质粒表达载体转染人视网膜色素上皮细胞及大鼠玻璃体腔,经逆转录PCR（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）、蛋白免疫印迹技术（Western-blot）等方法来检测其HGF干涉效果,筛选有效干涉靶位点,并进一步研究HGF与视网膜色素上皮细胞及PVR的关系。本研究的创新性包括:（1）成功筛选出HGF基因有效干涉靶点序列;（2）构建高效转录该靶序列的pGCU6/GFP/Neo-shRNA质粒载体;（3）利用pGCU6/GFP/Neo-shRNA抑制RPE细胞的增殖和迁移,为最终预防和治疗PVR奠定实验基础。
韩静[9]（2008）在《电场对人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究》文中研究表明【背景】组织的损伤修复对于维持组织正常结构和功能至关重要,在这一过程中,电场可能发挥着不容忽视的作用。当上皮细胞层受到破坏时,跨细胞层的离子流驱动电流流出,形成局部内源性电场。已证实多种细胞能够在与这种内源性电场大小相当的外加直流电场中呈现生物学特性的变化,尤其以移行能力的变化最为显着。研究显示,多种属、多组织来源的细胞在电场作用下可出现向阴极或阳极方向的定向移行,即具有趋电性;电场可明显促进皮肤、角膜上皮损伤的修复。因此,电场可能作为细胞移行的重要刺激因素参与损伤修复的调节。目前关于电场对细胞作用的机制仍处于探索中,一些研究认为细胞骨架蛋白和细胞膜表面生长因子受体的不对称分布、相关第二信使的激活均可能参与其中。在另一方面,细胞与细胞外基质（cell-extracellular matrix, ECM）间的粘附和相互作用是移行过程中的关键环节,而整合素家族在该过程中至关重要。整合素是细胞表面兼具粘附和信号传导功能的受体,通过胞外域与ECM、胞内域与信号传导分子结合,介导了细胞内外之间的双向信号传导,在调节细胞粘附、迁移、增生、分化等方面发挥重要作用。局部粘附激酶（focal adhesion kinase, FAK）是细胞内一种非受体型酪氨酸激酶,是整合素介导的胞外-胞内信号传导通路的基础性信号传递分子。它与整合素受体相连接并聚集其它分子于连接位点,形成信号复合体,将细胞外信号向细胞骨架传递,调节细胞的粘附、移行。PTEN （phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）为一种新发现的抑癌基因,能对FAK及其信号通路中多种信号分子进行脱磷酸调节,影响其正常细胞信号转导,导致细胞局部粘附和运动迁移功能受到抑制。了解整合素及其相关信号通路在电场中的变化情况有望为深入理解电场作用的机制开辟新领域。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）位于视网膜光感受器细胞与Bruch膜之间,是维持视网膜结构和功能的重要组成部分,RPE损伤相关的病变可导致严重的视力丧失。然而RPE细胞所处位置的特殊性,使它易于同时受到神经视网膜和脉络膜的双重影响,同时由于各种外来干扰措施不易直接对其产生作用,因此造成相关疾病的治疗面临重重困难。在与RPE损伤相关的疾病中,年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）是患病率较高且危害较大的一种。AMD是50岁以上人群中视力障碍的主要原因,并随着人口老龄化趋势,该疾病的高危人群数量还在迅速扩大。AMD的发病中,在物质代谢异常、细胞功能变化、遗传和环境等因素的共同作用下,黄斑区脉络膜毛细血管、Bruch膜、RPE和光感受器细胞的结构发生慢性进行性改变。由于发病机制复杂,目前针对AMD的各种治疗措施效果均十分有限。分析AMD的组织病理学特点,认为其治疗关键在于促进病变区受损RPE细胞正常组织结构和功能的恢复。结合电场在其它组织损伤修复中的作用,推测可以将电场引入对RPE细胞诱导和AMD治疗的研究中来。【目的】建立电场对人RPE （hRPE）细胞的体外作用模型,观察电场对hRPE细胞生物学活性、移行、增生的影响,并检测此过程中整合素、FAK信号通路的变化以及PTEN基因对上述通路的调节作用。【方法】1)原代培养hRPE细胞,并根据文献描述建立电场对hRPE细胞的作用模型;细胞暴露于电场强度为010V/cm的电场中,显微照相系统记录电场作用前、作用3h及停止作用后12h的细胞图像;利用台盼蓝拒染活细胞计数法计算各时间点活细胞率;细胞核仁组成区嗜银蛋白（AgNORs）染色法计数细胞核内AgNORs颗粒数目;流式细胞仪检测各时间点细胞凋亡情况。2)观察电场对细胞移行的影响:hRPE细胞接受电场作用,选取电场强度分别为2、4、6、8、10V/cm,作用时间为3h,细胞分为无血清培养液组、无血清培养液+表皮生长因子（EGF）组、正常培养液组及正常培养液+EGF组。另选取部分正常培养液组细胞,于6V/cm电场强度中暴露3h后转换电极方向,继续暴露3h。显微照相系统连续记录每15min细胞图像,标记每个观察细胞核的中心,测量细胞移行距离、细胞移行方向与场线间的夹角,追踪细胞位移,用cosineФ描述细胞移行方向。观察参数包括:平均cosineФ、平均移行距离、平均移行速度、实际移行速度及移行指数。观察电场对细胞增生的影响:电场作用条件为6V/cm、12h,计数电场作用前后hRPE细胞的细胞密度、细胞生长速度;流式细胞仪测定细胞周期;采用Western blot检测细胞内cyclin E的表达情况。3)电场作用条件为6V/cm、3h,细胞松弛素B作为抑制剂,电场作用前与正常hRPE细胞共培养30min;免疫荧光染色方法检测正常hRPE细胞和细胞松弛素B处理细胞内F-actin、β1 integrin在电场作用前后的分布情况;RT-PCR、Western blot方法分别检测电场作用前后细胞内β1 integrin的mRNA和蛋白含量变化;Western blot方法检测细胞内FAK、pFAK（phosphorylated FAK）蛋白含量。4)利用脂质体转染法将PTEN的真核表达载体及其空载体转染hRPE细胞,经G418筛选（浓度为400mg/L）后获得稳定的克隆并进行鉴定;挑选细胞克隆扩大培养,接受电场作用,作用条件与第二部分实验相同;记录每15min细胞图像,标记每个观察细胞核的中心,测量细胞移行距离、细胞移行方向与场线间的夹角,追踪细胞位移,用cosineФ描述细胞移行方向;采用流式细胞仪测定电场作用前后的细胞周期;采用Western blot方法检测电场作用前后转染细胞中FAK、pFAK的表达。【结果】1)成功建立了电场对hRPE细胞的作用模型,各电场参数稳定,重复性好。电场强度小于2V/cm的电场暴露对hRPE细胞的形态无明显影响。暴露于210V/cm的电场后,hRPE细胞胞体伸长、细胞长轴垂直于场线方向排列;细胞暴露于电场3h后停止作用,继续培养12h,细胞恢复正常状态下的多角形或不规则形。台盼蓝和AgNORs染色显示各电场强度下各组细胞平均活细胞率和AgNORs颗粒数无显着差别（P>0.05）。流式细胞仪检测分析,电场作用前后hRPE细胞均未出现明显的凋亡现象。2)未受电场作用的正常对照组细胞随机分布,平均cosineФ值为0.02±0.10。电场作用后,hRPE细胞出现朝向电场阴极方向的定向移行,此现象随电场作用时间的延长和电场强度的升高更为明显,平均cosineФ值持续增大并趋近于1。血清能够影响hRPE细胞在电场中的定向移行。无血清培养液组中,电场强度低于6V/cm时细胞无明显的形态及移行变化,在6V/cm电场强度中方出现朝向垂直于场线方向的转位及微弱的阴极方向位移,平均cosineФ值为0.21±0.13。正常培养液组中,6V/cm电场强度中细胞出现明显的阴极方向移行趋势,平均cosineФ值为0.63±0.04,并随电场强度升高而增强,该组细胞各电场强度下移行分布指标均高于无血清组（P<0.001）。EGF可增强hRPE细胞对电场作用的反应,在同时有血清存在时此作用更为明显。无血清组培养液中加入EGF后,在4V/cm电场中细胞平均cosineФ值为0.35±0.09,随电场强度的增高,此定向移行逐渐增强。细胞培养液中同时加入血清和EGF后,hRPE细胞在各电场强度中移行分布指标均较无血清组和正常培养液组升高。hRPE细胞移行方向随电极方向转换而改变,表现为始终朝向电场阴极一侧运动。对细胞增生情况的观察结果显示,电场作用12h后hRPE细胞密度和生长速度均较对照组上升,组间差异显着（P<0.05）;流式细胞仪检测显示实验组G0/G1期细胞比例下降,S期和G2/M期细胞比例明显增多,与对照组间差别有统计学意义（P<0.05）;Western blot结果表明电场作用下细胞内cyclin E的蛋白量较对照组升高。3)免疫荧光染色结果显示,正常hRPE细胞内F-actin在胞浆成网状分布;电场作用3h后actin纤维束向细胞周边聚集,尤其是朝向电场阴极一侧;β1 integrin在正常hRPE细胞内有弱表达,电场作用3h之后荧光强度明显升高并集中于细胞朝向电场阴极的一侧。细胞松弛素B预处理细胞内F-actin和β1 integrin均形成散在分布于胞浆内的点状沉积物,电场作用后未见有明显变化。RT-PCR检测结果显示,电场作用后β1 integrin的mRNA和蛋白表达均升高,该现象可被细胞松弛素B抑制。FAK蛋白在hRPE细胞中稳定表达,各组间未见显着性差异。pFAK在未受电场作用的细胞中有微弱表达,电场作用后表达迅速、持续上升,两组间差别显着（P<0.05）。4) PTEN基因被成功转染入hRPE细胞,转染有PTEN的hRPE细胞在电场作用前后细胞形态和移行均未发生明显变化,正常对照组细胞在10V/cm电场作用3h后平均cosineФ值为0.78±0.02,PTEN转染细胞降至0.19±0.02,组间差异显着（P<0.01）。流式细胞仪检测结果显示,PTEN转染后G1期细胞百分比上升,S期和G2/M期细胞数量下降,与对照组相比差异显着（P<0.01）;6V/cm电场作用12h后,细胞周期的上述表现无明显变化（P>0.05）。Western blot检测结果显示,hRPE细胞中FAK蛋白的总水平在PTEN转染和电场作用前后均无显着变化;电场作用后细胞pFAK的蛋白量明显升高,PTEN转染则抑制了该现象,表现为仅有微弱的蛋白表达。【结论】1)短时间、低于10V/cm的电场作用对hRPE细胞的正常活力及分裂无明显不良影响,保证了进一步体外和在体实验的安全性。2)电场作用能够引导hRPE细胞的定向移行,该作用与电场强度、血清和生长因子有关;一定时间内电场作用能够通过上调cyclin E的表达促进hRPE细胞的增生。3)电场对hRPE细胞的作用可引起细胞骨架蛋白的聚合反应,进而触发整合素及整合素相关信号通路FAK的活化,说明电场作用至少部分的通过整合素及FAK信号通路进行调节。4) PTEN转染能够明显抑制hRPE细胞在电场作用后的移行、增生能力及FAK信号通路的活化,说明PTEN通过调节FAK信号传导通路参与调控hRPE细胞在电场中的移行、增生。以上研究在国内外尚未见报道。
张妍,苏冠方,吴宏[10]（2007）在《生长因子对视网膜色素上皮的作用》文中指出RPE对多种生长因子敏感,本文主要介绍几种常见的生长因子对RPE细胞及其相关疾病所起的作用,以期从该角度研究治疗疾病的相关方法。
二、肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮细胞移行及增生的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮细胞移行及增生的作用（论文提纲范文）
（1）姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 532nm倍频激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型的建立 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 532nm倍频激光建立CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 制备病理学标本 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA及ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 CD105免疫组化结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 CNV模型建立的方法 |
| 5.2 532nm倍频激光诱导BN大鼠建立实验性CNV模型的机制 |
| 5.3 532nm倍频激光诱导BN大鼠CNV模型的评价 |
| 6. 结论 |
| 第二章 姜黄素通过AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路抑制BN大鼠CNV的实验研究 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.0 实验药物配制 |
| 2.1 实验分组及给药 |
| 2.2 532nm倍频激光建立实验性CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 病理学标本制备 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 2.7 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 2.8 Westernblot检测蛋白表达 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA与ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 RT-qPCR结果分析 |
| 3.5 Westernblot结果分析 |
| 3.6 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 免疫组化结果 |
| 4.4 RT-qPCR结果 |
| 4.5 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 新生血管与中药单体 |
| 5.2 姜黄与姜黄素 |
| 5.3 姜黄素与眼部新生血管 |
| 5.4 CNV的中医认识 |
| 5.5 姜黄素抑制CNV的机制 |
| 6. 结论 |
| 第三章 姜黄素对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子的影响 |
| 1. 实验细胞、试剂、药物及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验药物及溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ARPE-19细胞复苏、传代与冻存 |
| 2.2 造模试剂CoCl_2、实验药物姜黄素及阳性对照药雷珠单抗浓度的筛选 |
| 2.3 实验分组与干预 |
| 2.4 CCK-8法检测实验各组ARPE-19细胞的活性 |
| 2.5 RT-qPCR检测 |
| 2.6 Westernblot检测 |
| 3. 结果分析与统计学方法 |
| 3.1 CCK-8检测细胞活性结果分析 |
| 3.2 RT-qPCR结果分析 |
| 3.3 Westernblot结果分析 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常ARPE-19细胞形态 |
| 4.2 CoCl_2对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.3 姜黄素对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.4 雷珠单抗对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.5 RT-qPCR结果 |
| 4.6 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞缺氧模型的建立 |
| 5.2 CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧模型的机制 |
| 5.3 姜黄素对CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧的保护作用 |
| 6. 结论 |
| 第四章 非接触共培养体系观察ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对HUVEC细胞形态学的影响 |
| 1. 实验细胞、药物、试剂及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验试剂的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HUVEC细胞株复苏培养、传代与冻存 |
| 2.2 CCK-8检测 |
| 2.3 划痕实验检测细胞水平迁移 |
| 2.4 Transwell小室法检测细胞垂直迁移 |
| 2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭 |
| 2.6 Matrigel基质胶法检测细胞管腔形成 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常HUVEC细胞形态 |
| 4.2 CCK-8结果 |
| 4.3 划痕实验细胞水平迁移结果 |
| 4.4 Transwell小室实验细胞垂直迁移结果 |
| 4.5 Transwell小室实验细胞侵袭结果 |
| 4.6 Matrigel基质胶实验细胞管腔形成结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞迁移 |
| 5.2 细胞侵袭 |
| 5.3 细胞管腔形成 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 综述一 脉络膜新生血管的发病机制及中西医治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 姜黄素在眼科疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间学术表现 |
| 致谢 |
| 附: 查新报告 |
（2）藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的防治效果及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 藏红花酸对体外培养的ARPE-19 细胞在PDGF-BB诱导下增殖,迁移及凋亡的影响及机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 藏红花酸抑制了PDGF-BB诱导的血小板衍生因子受体(PDGFR)磷酸化和下游的PI3k/Akt和 MAPK信号通路激活 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 藏红花酸治疗兔眼玻璃体视网膜病变的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 增生性玻璃体视网膜病变模型的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）三七防治兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 1.外伤性PVR动物模型的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.1.3 主要试剂配制方法 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组 |
| 1.2.2 富含血小板的血浆(PRP)制备 |
| 1.2.3 造模方法 |
| 1.2.4 观察指标及方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 1.4 实验结果与分析 |
| 1.4.1 一般情况 |
| 1.4.2 眼底观察情况 |
| 1.4.3 兔眼球常规组织病理学检测结果 |
| 1.4.4 兔眼底增殖膜截面积检测结果 |
| 第二部分 |
| 2.三七对外伤性PVR兔视网膜中TGF-β及HGF表达的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验药品及相关试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配制方法 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组方法 |
| 2.2.2 富含血小板的血浆制备方法 |
| 2.2.3 兔外伤性PVR模型制作 |
| 2.2.4 给药方式 |
| 2.2.5 标本的采集 |
| 2.2.6 观察指标及方法 |
| 2.2.6.1 眼底观察 |
| 2.2.6.2 兔视网膜常规组织病理学观察 |
| 2.2.6.3 兔视网膜中转化生长因子(TGF-β)表达的观察检测 |
| 2.2.6.4 兔视网膜中肝细胞生长因子(HGF)表达的观察检测 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 一般情况 |
| 2.4.2 眼底观察情况 |
| 2.4.3 兔眼视网膜常规组织病理学检测结果 |
| 2.4.4 兔眼底增殖膜截面积检测结果 |
| 2.4.5 TGF-β的观察测定结果 |
| 2.4.6 HGF的观察测定结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 PVR模型建立方法的研究 |
| 3.1.1 玻璃体腔内注入细胞成分诱发PVR的动物模型 |
| 3.1.2 外伤制成的PVR模型 |
| 3.1.3 眼内植入铁质异物建立外伤性PVR动物模型 |
| 3.1.4 利用眼外伤联合玻璃体腔内注入血液成分建立PVR动物模型 |
| 3.2 阳性药物对照组的选择 |
| 3.3 阳性指标的选择 |
| 3.4 PVR的发病机制研究 |
| 3.4.1 PVR相关细胞学研究 |
| 3.4.2 PVR相关细胞因子研究 |
| 3.4.3 PVR与细胞外基质(ECM) |
| 3.4.4 PVR与基质金属蛋白酶(MMPs)的研究 |
| 3.4.5 PVR的蛋白组学研究 |
| 3.5 中医学对PVR及其治疗的认识 |
| 3.6 三七的药理作用研究及实验用药选择依据 |
| 3.6.1 止血作用 |
| 3.6.2 活血化瘀作用 |
| 3.6.3 抗炎作用 |
| 3.6.4 抗纤维化作用 |
| 3.7 三七对兔外伤性PVR的防治作用及机理 |
| 3.7.1 减轻外伤性PVR兔眼底增生情况 |
| 3.7.2 抑制外伤性PVR兔眼底增殖膜的形成 |
| 3.7.3 抑制外伤性PVR兔视网膜中TGF-β的表达水平 |
| 3.7.4 抑制外伤性PVR兔视网膜中HGF的表达水平 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）增殖性玻璃体视网膜病变发生机制及治疗进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 PVR发生、发展的影响因素 |
| 1.1 临床及病理因素 |
| 1.2 细胞因子的参与 |
| 1.3成纤维细胞生长因子 |
| 1.4 转化生长因子 |
| 1.5 表皮生长因子 |
| 1.6 血小板源性生长因子 |
| 1.7 肿瘤坏死因子 |
| 1.8 肝细胞生长因子 |
| 1.9 色素上皮衍生因子 |
| 1.1 0 胰岛素样生长因子 |
| 1.1 1 视网膜色素上皮细胞 |
| 2 其他因素 |
| 2.1 内皮素 |
| 2.2 生存素 |
| 3 PVR的治疗 |
| 3.1 手术治疗 |
| 3.2 药物治疗 |
| 3.3 基因治疗 |
| 4 总结与展望 |
（5）姜黄素在增殖性玻璃体视网膜病变中对表皮生长因子的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 表皮生长因子对体外培养的RPE细胞的作用及其在RPE细胞内的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 姜黄素对体外培养的RPE细胞中EGF表达的抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 姜黄素在防治兔眼增殖性玻璃体视网膜病变中对EGF作用的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 增殖性玻璃体视网膜病变的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 TAK1和TGF-β1 在PVR患者玻璃体液以及血清中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 LYTAK1对TGF-β1 诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖和移行的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 LYTAK1抑制TGF-β1 诱导的人视网膜色素上皮细胞间质化机制的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 在读期间发表文章 |
（7）甲酰肽受体在电场引导人视网膜色素上皮细胞层损伤修复中的作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验部分 |
| 实验一 甲酰肽受体在视网膜色素上皮细胞的表达及定位 |
| 0 序言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 激活甲酰肽受体促进电场引导视网膜色素上皮细胞层损伤修复及细胞骨架的改变 |
| 0 序言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 激活甲酰肽受体经 PI3K / AKT信号转导通路激活RHO GTPASES蛋白家族促进电场下视网膜色素上皮细胞层损伤修复 |
| 0 序言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 激活甲酰肽受体促进电场引导视网膜色素上皮细胞层损伤修复中EGF、IL-8、MCP-1 和TGF-β_1 的表达与分泌 |
| 0 序言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）靶向HGF RNA干涉抑制增生性玻璃体视网膜病变中RPE细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 第一篇 绪论 |
| 第一章 肝细胞生长因子与增生性玻璃体视网膜病变的研究进展 |
| 第二章 基因治疗PVR 研究进展及应用RNAi 治疗PVR 的理论意义与实用价值 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 不同诱导条件对体外培养的人视网膜色素上皮细胞表达肝细胞生长因子的影响 |
| 第二章 化学合成siRNA 靶向抑制人视网膜色素上皮细胞 HGF表达 |
| 第三章 靶向干涉HGF shRNA 表达载体的构建 |
| 第四章 pGCU6/GFP/Neo/shRNA 对RPE 细胞表达HGF 的影响 |
| 第五章 pGCU6/GFP/Neo/HGF 干扰载体对人 RPE 细胞增殖及迁移的影响 |
| 第六章 pGCU6/GFP/Neo/HGF1 质粒转染抑制大鼠PVR 形成的实验研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录（图片） |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（9）电场对人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 电场对人视网膜色素上皮细胞作用模型的建立及细胞生物学活性的观察 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 电场对人视网膜色素上皮细胞移行和增生的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 电场作用对人视网膜色素上皮细胞中整合素及局部粘连激酶表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 PTEN 与电场对人视网膜色素上皮细胞作用的关系 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）生长因子对视网膜色素上皮的作用（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 血小板源性生长因子 |
| 2 转化生长因子 |
| 3 成纤维细胞生长因子 |
| 4 胰岛素样生长因子 |
| 5 血管内皮生长因子 |
| 6 肝细胞生长因子 |
四、肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮细胞移行及增生的作用（论文参考文献）
- [1]姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究[D]. 陈水龄. 中国中医科学院, 2020(01)
- [2]藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的防治效果及分子机制研究[D]. 张赫. 河北医科大学, 2020(01)
- [3]三七防治兔外伤性增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究[D]. 余丰. 成都中医药大学, 2018(02)
- [4]增殖性玻璃体视网膜病变发生机制及治疗进展[J]. 陈臻,杨峥嵘,倪宁华. 昆明理工大学学报(自然科学版), 2016(04)
- [5]姜黄素在增殖性玻璃体视网膜病变中对表皮生长因子的作用[D]. 任彦新. 河北医科大学, 2016(08)
- [6]LYTAK1抑制人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移和间质化机制的研究[D]. 陈臻. 重庆医科大学, 2016(02)
- [7]甲酰肽受体在电场引导人视网膜色素上皮细胞层损伤修复中的作用[D]. 张晓光. 第四军医大学, 2010(06)
- [8]靶向HGF RNA干涉抑制增生性玻璃体视网膜病变中RPE细胞增殖的实验研究[D]. 郑炜. 吉林大学, 2009(08)
- [9]电场对人视网膜色素上皮细胞作用的实验研究[D]. 韩静. 第四军医大学, 2008(01)
- [10]生长因子对视网膜色素上皮的作用[J]. 张妍,苏冠方,吴宏. 国际眼科杂志, 2007(03)