一、隐匿性乙型肝炎:免疫组织化学和S基因序列分析（论文文献综述）
包镇洁[1]（2019）在《隐匿性乙肝及相关肝癌的研究进展》文中指出隐匿性乙肝（OBI）是乙型肝炎病毒（HBV）感染的一种特殊形式,自上世纪70年代被首次报道以来,越来越多的研究证实了隐匿性乙肝的广泛存在。隐匿性乙肝常见于HBV感染高流行区的一般人群、感染HBV后HBsAg转阴的人群、患有HBsAg（-）的肝病的人群及免疫力低下的人群;其发生机制考虑与HBV基因的变异、宿主的免疫应答、合并其他病毒感染以及检测技术的灵敏度等因素有一定的相关性。因其在临床上不易被检测,故有进展为隐匿性肝硬化及肝癌的可能。隐匿性HBV感染引起肝细胞肝癌的具体作用机制尚未明确。有研究表明,乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）及Yes相关蛋白（YAP）的高表达可能使肝细胞发生恶性转化;其次,隐匿性乙肝可能通过免疫介导参与肝细胞肝癌的发生;HBV的高甲基化也可能在OBI相关肝癌的发展中起重要作用;除此之外,OBI还保留了经典乙肝感染后致癌机制。隐匿性乙肝广泛存在但不被重视,隐匿性乙肝引起的肝癌发病机制尚不完全清楚,探讨其发病机制有助于对感染科以外的临床医生以及OBI阳性人群有所警示,以便更及时规范的诊治及预防。
张卫云[2]（2018）在《献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析》文中认为背景和目的慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的发生及发展机制与乙肝病毒变异、宿主的免疫状态、宿主性别、年龄、遗传基因和肝脏内炎症活动密切相关。然而,隐匿性HBV感染（OBI）在病毒学特征、合并感染、宿主免疫应答以及表观遗传学等方面尚未阐述清楚,特别是感染宿主的分子与细胞免疫功能少有报道。本研究目的为探讨献血人群的隐匿性HBV感染状态,揭示OBI携带者HBV特异性分子细胞免疫反应特征与OBI发生的作用机制。研究对象2016年8月至2017年12月广州血液中心无偿献血者人群。建立的研究队列包括:OBI 组 37 例,CHB 组 53 例（含 CHB-HBeAg-组 42 例,CHB-HBeAg+组 11例）,HBV感染康复组47例,HBV非感染组56例（含疫苗免疫组33例,正常对照组23例）,合计193例。方法采用化学发光法对研究队列血浆样品进行乙肝表面抗原（HBsAg）检测,核酸检测法（NAT）检测HBVDNA,qPCR定量检测病毒载量,巢式PCR进行病毒基因扩增并测定其核苷酸序列。采用HBV Core和HBV Pol多肽库特异性刺激物,体外刺激研究人群外周血单个核细胞（PBMCs）,采用T细胞增殖试验（CFSE）检测T细胞增殖情况,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ的频数,细胞内细胞因子染色（ICS）检测 IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数及细胞来源,流式微球试验（CBA）检测PBMCs分泌细胞因子的总体水平。采用SPSS 20.0统计分析软件,正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,多组间比较采用One-Way ANOVA分析;非正态资料组间比较采用Mann-Whitney U检验,各组间比较采用Mann-Whitney U检验;相关性检验采用Spearman’s相关分析;P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.OBI献血者人群特征。研究发现HBcAb阳性的献血者人群OBI发生率较高,特别是在单独HBcAb 阳性者更高;OBI发生率随年龄增长而增高,男性高于女性;OBI毒株基因型以B型为主。2.T细胞增殖特征。采用CFSE方法,在非特异性刺激物PHA刺激下,以CD8+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异不显着（P=0.403）,但OBI组和CHB组的增殖率低于正常对照组（74.0%,78.1%vs.82.1%）;在特异性刺激物HBV Core和Pol多肽库刺激下,以CD4+T淋巴细胞增殖为主,总体比较六组研究对象T淋巴细胞增殖结果差异显着（P<0.001）,其中OBI组和CHB组的增殖率显着高于正常对照组（3.0%,3.3%vs.1.7%）,差异显着（3.0%vs.1.7%,P=0.016;3.3%vs.1.7%,P<0.001）。3.特异性IFN-γ分泌T细胞频数测定。采用ELISPOT检测方法,在PHA刺激下,OBI组和CHB组特异性T细胞的免疫应答高于其他三组,差异显着（P=0.004）。在三种重组蛋白（HBcAg,HBsAg-ayw,HBsAg-adw）和多肽库的刺激下,总体比较六组研究对象特异性T细胞应答强度,结果差异显着（P<0.05）。OBI组（160 SFC/106 PBMCs）对HBcAg重组蛋白刺激的应答强度高于正常对照组（95 SFC/106 PBMCs）,低于CHB-HBeAg-组（208 SFC/106 PBMCs）。在HBV Core和Pol多肽库刺激下,OBI组（25 SFC/106 PBMCs）和CHB-HBeAg-组（25 SFC/106 PBMCs）的应答强度均高于正常对照组（5 SFC/106 PBMCs）。比较两种多肽刺激下的总体阳性反应率,HBV Core多肽库显着高于HBV Pol多肽库（44.6%vs.16.1%）,HBV Core多肽库刺激下的T细胞ELISPOT阳性反应率以OBI组（64.0%）最高,其次是HBV感染康复组（53.2%）,显着高于正常对照组（21.7%）。4.胞内细胞因子T细胞频数及胞外分泌型细胞因子水平测定。ICS检测结果显示,在PMA刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在OBI组和CHB组中均高于正常对照组（P<0.05）,而分泌IL-17A和IL-21的T细胞频数在OBI组均低于CHB组（P<0.05）。在HBV Core多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-21 和TGF-β的CD4+和CD8+T细胞频数在HBV感染康复组中高于OBI组和正常对照组（P<0.05）;而分泌IL-2和IL-10的T细胞频数在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。在HBV Pol多肽库刺激下,分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21的CD4+和CD8+T细胞频数在CHB组显着低于其他组（P<0.05）,而分泌IL-10和TGF-β的CD4+T细胞频数在OBI组显着低于其他组（P<0.05）。胞外分泌型细胞因子水平CBA检测结果显示,在HBV Core多肽刺激下,IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）;在HBVPol多肽刺激下,IFN-γ、IL-2和IL-17A在OBI组和CHB组中高于正常对照组（P<0.05）。ICS与CBA实验检测细胞内、外因子结果基本一致。5.MDSCs水平测定。根据细胞亚群计数显示,OBI携带者外周血中M-MDSCs水平显着低于CHB患者（P<0.001）,而与正常对照组差异不显着（P=0.860）;G-MDSCs水平在五组人群中无差别（P=0.914）。OBI携带者和CHB患者外周血中 M-MDSCs 和 G-MDSCs 水平与 ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、ALB、ADA、CHE、γ-GT和TP等肝功能指标无相关性（P>0.05）。结论OBI携带者和CHB患者均呈现显着高于HBV感染康复者及非感染者的HBV特异性T淋巴细胞增殖反应;OBI携带者与HBV感染康复者及CHB患者均呈现显着的特异性分泌IFN-γ的T细胞频数增高,以OBI组阳性反应率最高,HBV感染康复组和CHB-HBeAg-组次之,CHB-HBeAg+组最低;HBV感染康复组特异性分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A和IL-21细胞因子的CD4+和CD8+效应T细胞频数显着增高,而OBI组和CHB组分泌IL-10细胞因子的抑制T细胞频数增高,CHB组效应T细胞频数较低而OBI组分泌IL-2和IL-17A的T细胞频数相对升高;CHB组分泌IL-10细胞因子水平增高,而OBI组分泌IL-17A细胞因子水平相对较高。因此,OBI携带者的HBV特异性T效应细胞反应水平居于HBV感染康复者与CHB患者之间,而CHB患者T抑制细胞反应水平较高,从而导致了三组HBV感染者的不同转归状态。创新之处1.献血者人群通常为未经抗病毒等治疗的健康人群。本论文以HBV感染不同转归状态的献血者为研究对象,排除了抗病毒治疗等干扰;采用新鲜分离的PBMCs进行实验,避免了淋巴细胞由于冻存和复融发生死亡和免疫功能的改变对结果的影响。2.与以往研究选用HBV重叠多肽不同,本研究合成的HBV Core和HBV Pol多肽是经研究证实能刺HBV产生特异性细胞免疫应答的HLA-Ⅰ型和HLA-Ⅱ型限制性多肽,结果更能反应HBV感染后不同转归人群对T淋巴细胞免疫应答状态。3.本研究根据HBV感染献血者不同转归状态,分析了 T细胞亚群分泌的七种特异性细胞因子的频数及分泌型细胞因子的水平,阐明了 OBI携带者、CHB患者及HBV感染康复者的三种转归状态的分子细胞免疫基础。
刘克敏[3]（2018）在《乙肝表面抗原和表面抗体双阳性的流行率及突变分析》文中研究指明研究背景乙型肝炎病毒（HBV）是引起乙型肝炎的病原体,在全球范围内广泛流行,据估算大约有20亿人口被感染,其中接近3亿为慢性的乙肝病毒携带者。乙肝病毒表面抗体的出现表明患者曾经接种过乙肝疫苗,或者曾经感染过乙肝病毒,现处于感染的恢复期和具有一定的免疫力。回顾既往研究,曾有报道指出,在慢性乙肝病毒携带者中,可在患者血清中同时检测到乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝表面抗体（HBsAb）,全球报道出现双阳性的概率约为2.43%-8.90%[1-7]。有报道称HBV表面抗原和抗体的双阳性是由于HBV突变引起,这种突变可能是由于免疫逃逸所造成的选择性作用[4,6,8-11]。然而,也有研究者发现HBsAb阳性与阴性的乙肝患者中发生HBsAg突变的情况没有显着性差异,因此认为双阳性可能与患者同时感染不同亚型的HBV有关联[12]。因此HBsAg和HBsAb双阳性的潜在机制仍然是模糊和有争议的。研究目的分析2014-2016年间,广州地区乙型肝炎表面抗原和表面抗体双阳患者的流行率及其血清学特征,分析出现双阳性流行率差异的影响因素。并评估中国慢性乙肝患者S基因主要亲水区域突变与表面抗原和表面抗体双阳性血清学资料之间的关系,探究其发生的可能机制及临床意义,对慢性乙型肝炎的诊断、治疗方案及病情评估具有重要意义。研究方法1.利用雅培I2000化学发光微粒免疫自动检测平台对HBV血清学标志物五项指标进行检测,患者的五项乙肝标志物为HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。标本来源为2014-2016年间,在广州医科大学附属第一医院就诊的慢性HBV感染患者。采用统计软件SPSS 22.0对结果进行统计、分析,得出广州地区乙型肝炎表面抗原和表面抗体双阳患者的流行率。2.采用巢式PCR对2015年的两组Ⅰ组（44例）HBsAg（+）/HBsAb（+）,Ⅱ组（88例）HBsAg（+）/HBsAb（-）共132例患者的血清病毒DNA进行扩增,通过直接测序技术检测乙肝病毒的S基因序列。并用序列比对软件MEGA6、统计软件SPSS 22.0对S基因突变结果进行分析。研究结果1.本研究统计了2014-2016年13,369名HBsAg阳性病人,HBsAg和HBsAb双阳患者559名,流行率分别为4.52%、4.02%和4.04%;HBsAg和HBsAb双阳病人中,男性患者所占比例更高,主要表现为“HBsAg（+）、HBsAb（+）、HBeAg（-）、HBeAb（+）、HBcAb（+）”模式,HBeAb阳性的病人出现的概率更大,占68.34%,并且以低浓度HBsAb10.00100.00 mIU/ml为主,占89.44%。2014年、2015年和2016年双阳性患者的年龄、性别差异有统计学意义（p<0.05）,HBeAg阳性率差异无统计学（p>0.05）,其中,2015年的平均年龄显着高于2014年和2016年,2015年的男性比例显着低于2014年和2016年。2.在两组患者中,HBV基因型主要为B型（56.82%）和C型（43.18%）;两组患者的年龄、性别和HBV基因型分布,差异没有统计学意义（p>0.05）。但是Group I患者的HbeAg阳性率明显高于Group II,差异有统计学意义（p<0.001）。I组患者中以低浓度HBsAb 10.00100.00 mIU/ml为主,占86.36%;主要亲水区域（MHR）发生突变的比例为59.09%;I组患者MHR每100个氨基酸的变异数约为II组患者的7.1倍（2.50vs0.35,p<0.001）,至少发生两个氨基酸突变的有16名患者,其中12名患者（31.82%,12/44）来自I组,只有2名患者（2.27%,2/88）来自II组（p<0.001）;突变主要发生在“α”决定簇（3.41vs0.90,p<0.001）。此外,两组还存在下列差异有统计学意义,MHR1（2.81vs0.05,p<0.001）、MHR3（4.38vs1.06,p<0.001）、MHR4（2.05vs0.68,p<0.05）、MHR5（1.24vs0,p<0.001）。但是两组在MHR2差异没有统计学意义（2.27vs0.57,p=0.099）。两组患者的点突变也存在显着差异,I组中突变点主要是s101Q、s114S、s120P、s126T/I、s129Q、s131T、s133M和s145G,突变频率更高且差异有统计学意义的是sQ101K、sT131N和sM133L（p<0.05）。研究结论1.广州地区HBsAg和HBsAb双阳性的流行率为4.18%。HBsAg与HBsAb双阳模式出现在男性患者的概率更高,HBeAg转换为HBeAb其传染性并未减弱;以低浓度HBsAb为主,可能说明双阳患者的HBsAb是在感染期间形成的。2.在两组患者中,Group I组患者的HbeAg阳性率更高,说明其传染性比Group II组更强;但是ALT水平低,可能说明双阳患者对机体的影响是长期作用的结果;I组发生S基因突变的频率更高,提示S区基因尤其是“α”决定簇的突变造成了双阳的发生;突变主要位于“α”决定簇的第1环（MHR3）,可能说明HBV突变不是受到人工主动免疫和/或者人工被动免疫、或者接受核苷类似物治疗的影响,而是患者在感染期间形成的HBsAb对乙型肝炎病毒长期的筛选压力致使HBV选择免疫逃逸突变引起的,并最终导致HBsAg与HBsAb双阳性的出现。
杨柳[4]（2017）在《肝纤维化和高脂血症患者隐匿性乙型肝炎病毒感染特征分析》文中提出肝纤维化（hepaticfibrosis）与高脂血症（Hyperlipidemia,HLP）影响数百万人健康,其原因尚未清楚。乙型肝炎是一种常见的疾病,与众多疾病发展相关。国际上把乙型肝炎病毒感染者血清中表面抗原阴性（HBsAg-）,而血清或肝组织HBV DNA 阳性的人群定义为隐匿性 HBV 感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）。据报道,高脂血症和乙肝、肝纤维化两两之间有关系。但是关于OBI和高脂血症及肝脏纤维化之间关系尚未见报道。目的:研究肝纤维化或高脂血症患者中OBI流行率,检测OBI患者组织病理学变化和OBI病毒株的分子生物学特征。方法:研究对象为江西中医药大学附属医院就诊患者。第一章研究对象为2010年4月-2014年6月高脂血症患者1273人;第二章选取肝纤维化四项指标异常患者1814人（2015年6月-2016年4月）。均进行AST,ALT,GGT以及HBsAg,HBsAg,抗HBc,抗HBs,抗HCV和抗HIV检查。检测样本中HBV-DNA的载量。随后分别对其中确诊为OBI的36例和非OBI的8例患者进行肝穿刺,影像学检查,免疫组化和荧光原位杂交等检测分析。结果:第一章高脂血症患者隐匿性乙型肝炎感染特征1.分别在9.5%的HLP组和2.4%的对照组中检测到OBI（P= 0.001）,两者对比有差异。OBI-HLP患者疫苗接种率显着低于非OBI-HLP患者（2.3%vs.52.2%,P= 0.0001）。2.OBI-HLP患者病毒载量中位数值显着高于对照组（P = 0.023）。3.OBI-HLP患者血清中,IL-2高于对照组,IL-10水平低于对照组（P=0.02）。4.OBI-HLP患者中,总胆固醇TC水平与HBV-DNA载量呈正相关。5.19名患者BCP/PC片段扩增结果为阳性（79.17%）。其中9个为B型（47.37%）,10 个为 C 型（52.63%）。第二章肝纤维化患者隐匿性乙型肝炎感染特征1.1814例肝纤维血清四项阳性患者中有148例OBI携带者（8.15%）。肝穿刺36份样本均为OBI阳性,其中分别扩增出12份BCP/PC、13份PreS/S DNA片段。PreS/S区域氨基酸位点变异与OBI发生机制有着密切关系。2.OBI 患者肝纤维四项均值（ng/ml）分别为 HA100.3±33.5,LN38.5± 14.8,PCIII22.5± 13.5,CIV35.7± 10.7。OBI组和对照组之间LN水平没有统计学差异（p>0.05）,OBI 组血清中 HA,PCIII,CIV 水平均高于 Control 组（p<0.05）。3.肝穿刺患者肝脏硬度LSM值均值12.3 ± 3.6 Kpa;FISH光密度值均值为16.3 ± 3.6。肝穿刺组织中HBsAg,HBcAg表达阳性率分别为2.8%和52.8%。4.OBI患者血清中透明质酸（HA）和HBVDNA载量之间、组织病理评分和HBVDNA载量之间、HBcAg组化评分和HA之间、肝脏硬度值（LSM）和HBV-DNA载量之间均呈正相关。结论:1.高脂血症及肝纤维化人患者中OBI流行率显着高于正常献血或对照人群。2.控制患者血脂水平可能对抑制乙肝病毒复制有效。3.肝纤维化的OBI患者中,组织病理以及肝脏影像值和HBVDNA水平正相关,及早发现OBI,控制OBI发展对控制肝纤维化尤为重要。4.一部分肝纤维化-OBI患者中,扩增出BCP/PC和PreS/S片段,发现了一些有意义的突变位点。有望阐述OBI在特定人群中的发病机制。
李媛媛[5]（2017）在《1-3岁儿童乙肝疫苗无应答与接种剂量、隐匿性乙肝感染的关联研究》文中指出目的:了解乌鲁木齐市乙肝疫苗剂量由5μg提高到10μg后的疫苗无应答情况,探讨疫苗接种剂量、婴儿期体重、隐匿性乙肝感染（OBI）对乙肝疫苗无应答的影响,为降低婴幼儿乙肝疫苗无应答率做出贡献。方法:连续纳入新疆医科大学第一附属医院预防保健科2013年12月—2015年6月完成乙肝疫苗免疫接种的1-3岁常规体检儿童,监护人知情同意后查看疫苗接种本确定乙肝疫苗接种剂量,面访填写问卷,采集静脉血样本。使用ELISA法检测乙肝六项、巢式PCR扩增HBV S区并测序,使用MEGA7.0进行分子进化特征分析。应用SPSS17.0进行一般统计学分析,使用R软件建立Logistic回归模型分析并计算交互作用指标RERI（相对超危险度比）、AP（归因比）、S（交互作用指数）,Bootstrap法估计其可信区间。结果:共调查1023名儿童,平均年龄1.26±0.47岁,乙肝疫苗无应答率为15.44%（158/1023）。1.不同累积接种剂量间无应答率差异有统计学意义,P<0.001;20μg、25μg、30μg组相对于15μg的OR分别为:0.463（0.293-0.732）,0.259（0.126-0.530）,0.217（0.132-0.356）。2.应答组与无应答组:42天、3月龄、6月龄、12月龄平均体重差异有统计学意义（P<0.05）。42天、3月龄、6月龄体重右偏离者（即超重）较正常者OR分别为1.260（1.135-1.398）,1.515（1.246-1.842）,1.414（1.171-1.708）。控制出生体重进行协方差分析发现:应答与无应答组之间接种期（0-6月）体重增长量差异有统计学意义,P<0.001,无应答组大于应答组。3.使用R软件,建立Logistic回归模型结果表明:乙肝疫苗累积接种剂量与接种期体重增长量均对乙肝疫苗无应答有影响,而后计算相加交互作用指标RERI=16.358（0.331230.885）AP=0.673（0.1230.846）,S=3.231（1.2196.553）,表明两者存在相加的交互作用即协同作用。4.儿童OBI感染率为7.82%（80/1023）,应答组与无应答组间OBI感染率差异无统计学意义。5.可以分型的79例OBI中,C基因型为优势基因型;在HBV S区共发生27次突变,其中10次发生在―a‖决定簇。6.对乙肝疫苗无应答的158名儿童进行随访,补种率87.34%（138/158）,再次抽血检测的随访率36.08%（57/158）;复测57名儿童乙肝表面抗体均为阳性,其中63.16%（36/57）的儿童呈高应答状态。7.了解未随访的儿童家长64.92%（101/158）拒绝随访的原因,经过故障树分析发现:拒绝随访以主观因素为主,对随访人员的不信任,认为研究人员专业素质较弱,对课题的不了解为主要原因。结论:乙肝疫苗接种剂量、接种期体重增长量均影响乙肝疫苗无应答,且疫苗剂量低、接种期体重增长过快两者同时存在时可协同增加乙肝疫苗无应答的风险;需重视1-3岁儿童中隐匿性乙肝感染的危害性。
赵月[6]（2014）在《人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究》文中研究说明乙型肝炎（HB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种以肝脏损伤为主要特征的严重危害人类健康的传染病之一。由于HBV具有严格的宿主特异性,因而缺乏理想的细胞模型或动物模型,从而阻碍了HBV的研究。本研究采用人源HBV对沙鼠和C57BL/6小鼠进行感染试验,目的在于探讨人源HBV能否引起小鼠感染,并探讨小鼠作为研究HBV传播和致病机制的动物模型的可能性。本研究选取沙鼠和C57BL/6小鼠用作人源HBV阳性血清的人工感染试验动物,采用ELISA、PCR、Real-time PCR、免疫组织化学和Western blot等方法对人源HBV感染后沙鼠和C57BL/6小鼠的血清、粪便和肝脏等组织进行HBV相关病原和抗体的检测,来探讨HBV在沙鼠和C57BL/6小鼠体内的感染情况,并通过沙鼠和C57BL/6小鼠体内细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的定位和表达,初步揭示HBV感染致肝细胞损伤的机制。研究结果如下：1、人源HBV感染沙鼠后1d,在肝脏和肾脏组织中可检测到HBV DNA;感染后2d和4w,只在肝脏中检测到HBV DNA。感染C57BL/6小鼠后1d,肝脏中可检测到HBV DNA。在血清、粪便、脑组织和唾液腺中,未能检测到HBV DNA。血清ELISA检测结果表明,在感染后1w内,HBsAg和HBeAg在小鼠血清中呈一过性出现；感染后1w,在沙鼠和C57BL/6小鼠的血清中均可检测到HBsAb和HBcAb,而且HBsAb能够在整个试验过程中持续性在血清中被检测到。肝脏组织中HBV相关抗原免疫组化染色结果表明沙鼠和C57小鼠感染人源HBV后肝脏中可检测到抗原阳性信号,且强度随感染时间的延长而增强。Western blot检测发现在感染后7d沙鼠肝脏中HBV抗原PreS1蛋白有明显的表达。2、沙鼠和C57BL/6小鼠感染人源HBV后均出现明显的组织病理学变化,呈现典型的病毒性肝炎的病理学变化。主要表现为肝窦扩张、淤血,肝细胞胞浆疏松、颗粒变性,汇管区淋巴细胞浸润和胆管增生等,病变程度随感染时间的延长而显严重。电镜观察发现,试验组小鼠肝细胞结构松散,内质网扩张,线粒体出现严重肿胀、空化。肾小管.上皮细胞胞质疏松,线粒体肿胀、嵴消失,内质网囊泡化,可见髓鞘样小体,胞浆内可见病毒包涵体,胞核内可见病毒样粒子。3、肝脏组织中增殖与修复相关蛋白免疫组化染色结果表明HBV感染后,沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PCNA和HSP70蛋白在体内表达出现先升高后下降的趋势,攻毒后蛋白表达显着高于对照组（P<0.05）,表明HBV感染后机体出现了相应的抗损伤机制来减少损害。4、细胞凋亡相关分子的免疫组化染色结果表明感染后沙鼠和C57BL/6小鼠体内Bax、Bcl-2、 Caspase-3和Fas/FasL的表达量均有不同程度的升高,显着高于对照组（P<0.05）,表明HBV感染后细胞凋亡的线粒体途径被激活,细胞凋亡在HBV感染导致肝细胞损伤的机制中发挥了重要作用。5、内质网应激（ERS）相关分子免疫组化染色结果表明感染后沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中GRP78、CHOP、JNK及Caspase-12的表达均显着高于对照组（P<0.05）。Western blot结果也证实感染后肝脏ERS相关分子的表达量较对照组均有所升高。ERS相关蛋白表达量的升高表明HBV感染后启动了内质网应激反应,促进了肝细胞的凋亡。6、对沙鼠肝脏线粒体DNA不同区域基因序列扩增,观察、分析比较了人源HBV感染8w后,沙鼠肝脏线粒体DNA水平的变化,发现人源HBV感染后在沙鼠肝脏线粒体DNA的D-loop、 CytB和CytC三个区域均出现了一个碱基位点的改变,这些改变可能与线粒体结构或功能的变化相关。上述研究结果表明,人源HBV感染可引起沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织发生明显的病理损伤和炎症反应,采用PCR、血清ELISA和肝脏免疫组织化学检测在感染鼠体内检到HBV DNA及其相关抗原的存在,HBV可在小鼠体内进行短期的复制表达,表明沙鼠和C57BL/6小鼠具有作为HBV感染动物模型的潜质。通过对HBV感染后沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏的细胞损伤、细胞凋亡和内质网应激等相关因子表达量的变化初步观察研究发现,HBV感染后可通过激活线粒体途径和内质网应激途径促进肝细胞的凋亡,这可能是HBV感染引起肝细胞损伤的重要机制。
贾晓坤,贾晓晖,杨鹏华,李双霞,李银[7]（2013）在《张家口地区献血者隐匿性乙肝病毒感染研究》文中进行了进一步梳理目的:对张家口地区无偿献血者中隐匿性乙肝病毒感染情况进行流行病学调查,为当地血液安全筛查提供指导意义。方法:应用HBsAg ELISA检测试剂盒对回库无偿献血者标本进行检测;对血浆标本采用nested-PCR技术进行HBV核酸检测;对阳性标本进行HBV DNA序列分析。结果:在总计5498例次标本的检测中,共有5417例为HBsAg阴性;HBsAg阴性标本中nested-PCR方法检出13例HBV DNA阳性（0.24%,13/5417）;测序结果显示隐匿性HBV感染者中C基因型所占的比例为61.5%（10/16）,明显高于HBsAg阳性的HBV感染者（28.2%,11/39,P<0.01）。结论:张家口地区无偿献血者中存在较高比例的隐匿性乙肝病毒感染。
孙波[8]（2013）在《输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析的研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的输血是挽救人类生命的重要手段,输血前对血液进行一系列生物学筛查和安全性评价,对保障安全用血和生命健康具有重要意义。目前我国输血前血液筛查大多仍采用传统的酶联免疫吸附分析（ELISA）检测血液中的病原生物及其成分。近年来随着检测试剂盒灵敏度的不断提高,经输血传播病原微生物的危险性已经处于较低水平。然而,由于病毒感染者“窗口期”献血、隐匿性感染现象与病毒变异的存在,病毒反应性（阳性）献血者的漏检问题依然存在,输血或输注血液制品仍有一定的传播病毒的残余风险,对接受输血者的生命安全造成极大危害。因此探索新的血液筛查方法,采用更加敏感特异方法消除漏检,对于增强输血及血液制品安全性具有重要的实际意义。乙型肝炎是由感染乙型肝炎病毒（HBV）引起的乙类传染病。我国是乙型肝炎的高发区,一般人群HBV感染率高达57.6%,HBV携带率高达9.09%,HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）阴性的隐匿性HBV感染在我国普遍存在。HBV感染可引起肝硬化和肝癌,严重危害机体健康和生命安全。因此在输血前血液安全筛查中,乙型肝炎抗原及核酸成分的检测就成为主要靶点。利用ELISA检测HBsAg是应用最早,开展最广的检测方法,但由于该技术是利用酶催化底物显色的方法,灵敏度较低,操作误差大,易出现假反应性或假非反应性,给血液安全检测带来不确定性。目前我国地市级血站系统采用由双人两次通过ELISA法检测HBV的方法以减少误差,但实际上此方法仅仅是增加了检测的次数,虽可减少操作者方面的实验误差,但不能避免因加样、洗板、变异系数较大等引起的方法学上的固有误差。近年来,核酸检测技术（NAT, Nucleic Acid Test）在输血前血液筛查中的应用受到高度关注。NAT是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称,利用该技术可在病毒感染后数天后即能检出标本中极微量的核酸,大大缩短“窗口期”。NAT敏感性高,与传统的ELISA方法相比,虽然不能完全消除感染“窗口期”但由于病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,通过NAT检测,能够明显减少隐匿性感染和病毒变异株,最大限度地预防经输血传播病毒性疾病,因此,NAT可使经输血传播疾病的危险性降到最低,有望成为一种新型的血液筛查传染病的检测技术。隐匿性HBV感染（OBI）即血清HBsAg阴性而HBV-DNA阳性的HBV感染,表现为病毒载量持续处于低水平复制状态。OBI血液可以通过输血导致受血者感染HBV,其感染率与各地区的HBV感染率和基因型相关。HBsAg阴性的隐匿性HBV感染在我国普遍存在,约有3%的正常人或献血员为HBsAg阴性的HBV携带率者,在单一抗HBc阳性人群中有30%-35%血清HBV DNA阳性,是形成隐匿性乙肝病毒感染的基础。多种原因可能造成隐匿性HBV感染,位于aa124-147的“a”表位是HBsAg的免疫优势表位,是当前HBsAg检测的主要靶点,HBsAg表位基因突变是导致HBsAg漏检是最主要原因之一。有报道aa100-160氨基酸突变可引起HBsAg抗原活性的明显改变。由于“a”表位也是乙肝疫苗的主要保护性表位以及抗乙肝免疫球蛋白的主要靶点,“a”表位突变可使现有乙肝疫苗及诊断试剂的灵敏度下降,因此研究HBsAg "a"表位对应的HBV S区基因序列具有特别重要的理论和实际意义。本课题以省级血液中心为研究基地,选择93613份无偿献血标本,采用NAT、基因突变检测和化学发光免疫技术对血液中乙型肝炎病毒的核酸和抗原、抗体联合检测,并与传统的ELISA对比研究；对HBsAg酶联免疫法检测阴性但NAT检测DNA阳性的血清标本进行DNA序列分析和抗体蛋白的确认与分型,探讨HBsAg阴性血清模式与HBV DNA的关系,寻找窗口期和隐匿性HBV感染者；对隐匿性HBV感染者病毒株基因变异进行分析,对病毒株的“a”表位区域进行基因序列测定,分析“a”表位基因突变情况。本论文旨在了解目前我国HBV筛查体系下献血者隐匿性HBV感染及HBsAg突变株流行状况,建立更为灵敏、准确、符合国际标准要求的输血前血液筛查新模式,并根据筛查结果计算输血传播传染性疾病的残余风险。此外,本文还初步探讨了肝癌细胞PI3K/PKB信号转导通路对细胞凋亡抑制蛋白Survivin变化的影响,旨在为HBV密切相关的肝癌诊断及治疗提供实验依据。第一部分输血前应用NAT大规模筛查乙肝病毒的模式构建及应用研究研究方法：1.核酸检测实验室体系的构建：按照卫生部颁发的《临床基因扩增实验室管理暂行办法》,建立标准核酸检验实验室,之后所有NAT检测均在此实验室进行。2.不同采血点血液标本的汇集和处理：将不同采血点冷链运送来的标本信息录入采供血及临床输血管理网络体系平台。样品处理：采用血清或抗凝血浆,离心后,取上清用于核酸检测。收集的样品置4℃保存,24小时内进行检测。3.建立健全样品采集-预处理-保存-使用的标准化流程。标本离心后,经全自动加样仪自动读取标本条码并加样,生成加样文件,发送至实验室服务器的相应加样数据目录下,由全自动酶免分析仪和核酸检测仪处理,将其检测结果相关数据发送至实验室服务器的相应检测数据目录下,实验室信息管理系统（LIS）将对应的加样数据与检测结果相关数据进行处理后,生成每个标本相应检测项目的检测结果释放至血站信息管理系统（Blood Station Information Management System, BIS）。通过深孔板的同步留样,避免人工误差和传统辫血留样错误,配以信息化的管理方式取代人工保存,保证血样检测结果的还原性。4. ELISA法检测相应的抗原或抗体：ELISA法采用双抗原夹心法或双抗体夹心法检测相应的抗体或抗原。最后在450/630nm处测读吸光度值。按照试剂说明书设立临界值。检测孔A值大于临界值则为反应性,否则为非反应性。酶联免疫法的操作严格按照使用说明书进行,其中核心抗体检测时用生理盐水作1：30稀释。5.标准NAT检测自动化流程建立：初期采用半自动化设备进行测试,探索出试剂准备、样品核酸提取到检测的适宜条件,最后形成样品自动汇集、检测的标准自动化流程。配套条码扫描,测试过程可全程监控。6.核酸测定：采用合并检测方式进行。选择ALT阴性,ELISA测定HBsAg阴性、抗HCV Ab阴性、抗HIV Ab阴性的样品以及仅1种ELISA试剂为阴性的标本进行HBV、HCV和HIV病原体核酸的检测。初筛检测方式为合并检测（6个样本混合）。当合并检测汇集池样品中HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA任何1项为反应性时,对该汇集池样品再进行拆分检测,挑选出对应的单份反应性样品。合并检测方式同时需满足单份样品临床检测的敏感性要求。7.NAT体系的方法学评价：采用卫生部临检中心及国际血筛标准品对检测结果的有效性进行评估。当发现检测结果出现偏差时,立即停止试验,查明原因后再继续进行,确保实验结果准确有效。使用该体系对本中心近30000份样本进行连续检测,有效评估实验整体的性能及稳定性。3.8复检及确认：所有ELISA非反应性,NAT反应性标本都将备份管寄送至中国卫生部临检中心作HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA分项定量检测。并对献血者进行随访,以观察是否为抗体检测窗口期标本。3.9统计学处理数据处理分析采用SPSS10.0软件进行方差分析,Student’t检验来判断差异的统计学意义,P<0.05具有显着性意义。研究结果1.NAT检测模式和流程的设计：构建了NAT大规模筛查乙肝病毒的检测模式和流程。2.NAT检测的数据统计：93613份无偿献血的标本中,经ELISA筛查HBsAg、抗HCV和抗HIV-1/2非反应性及仅1种ELISA试剂为非反应性的标本共91271份,经NAT检测其中有60例反应性标本,反应性检出率为0.066%。3.NAT反应性标本定量检测：NAT分项鉴别实验反应性率为63.33%（38/60）在我国经血传播疾病病毒酶免试剂阴性核酸试剂阳性献血者标本中,以HBV为主,不同于国外HIV为主的流行模式。4. HBV DNA反应性标本病毒含量分布：38例HBV DNA反应性标本中病毒含量<20IU/ml的标本28例,占73.68%；20～100IU/ml的标本4例,占10.53%。5.HBV检测单试剂反应分析：HBV38例单试剂反应性样本中,使用中国产试剂16例,使用美国雅培公司试剂22例；经NAT确认反应性2例,为美国雅培公司试剂单试剂检出。6.血液筛查核酸检测系统指标：血液筛查核酸检测系统的单项检测灵敏度≥95%,单项检测特异性≥95%,单项检测检测下限是50IU/ml,单项检测下限检出率≥95%。检测通量≥300例样本/每日。第二部分HBsAg ELISA-/NAT+的HBV血清学模式和病毒变异分析研究方法1. HBV DNA提取：使用QIAamp MinElute病毒核酸提取试剂盒提取血清标本中病毒DNA。2.PCR扩增：PCR扩增使用Prime STAR高保真DNA聚合酶在BIO-RAD IC-Cycler梯度PCR扩增仪或PE2400PCR扩增仪上进行目的片段PCR扩增。引物HBSSWF: AACATCAGGATTCCTAGGAC; HBSSWR:CCTTGTAAGTTGGCGAGAA; HBSS-F TTCATCCTGCTGCTATGCC; HBSS-R:ACGTTTGGTTTTATTAGGGTTC,扩增产物理论上包含HBV pre-S和S区基因。50μl PCR反应体系中加入5×Prime STARTM Buffer （Mg2+plus）10μl, dNTP Mixture（各2.5mM）4μl, Primer1（10μM）1μl, Primer2（10μM）1μl,上述提取的模板DNA2-4μl, Prime STARTM HS DNA Polymerase（2.5U/μl）0.5μl,灭菌蒸馏水加至50μl。PCR反应条件为95℃预变性2min。94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸55s,共40个循环。72℃2min。反应体系：10×buffer1.0μl, primer F1.0μl, R1.0μl, dNTP1.0μl, Taq0.4μl, ddH2O3.6μl, cDNA2.0μl。每轮PCR均设阴阳性对照,以不同拷贝数的HBV标准质粒为阳性对照,敏感度为50copy/ml。PCR产物取2μl用2%琼脂糖凝胶电泳观察。3.PCR产物纯化：使用TBE缓冲液制作1.5%琼脂糖凝胶,然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,载样液中加入SYBR Green Ⅰ。对于扩增产物量大（电泳条亮带）的标本扩增50μl体系后电泳,对于扩增产物量小的标本扩增100μl体系后电泳,使用胶纯化试剂盒纯化扩增产物。4.DNA测序：PCR产物克隆,质粒抽提,使用Big Dye测序反应试剂盒在ABI PRISM3730型全自动DNA测序仪上进行双向测序。5.HBV基因分型和序列分析：对扩增阳性的PCR产物进行序列测定和进化分析,确定所携HBV的基因型。6.生物信息学软件处理：测序结果采用ContigExpress、MEGA4生物信息学软件进行分析处理。测得基因片段序列与各基因型参比序列用Blast进行同源列队,比较分析基因突变情况。研究结果1.HBV pre-S/S基因PCR扩增结果：56例标本中有41例标本PCR扩增不佳,仅有15例标本PCR产物电泳均可看到1400bp的特异性条带。大部分标本扩增产物量较小,特异性条带较弱。2.无偿献血者中隐匿性HBV感染情况及基因型分析：23例ELISA HBsAg阳性标本和15例隐匿性HBV标本经巢式PCR扩增阳性检测基因型,结果显示,C基因型在隐匿性HBV中的比例（80.0%）明显高于在HBsAg阳性标本中的比例（17.4%）,p<0.05。3.隐匿性HBV感染者表面抗原S区基因突变分析：3株基因B型和12株基因C型的S区序列分析。有6例在该区域内出现了基因序列点突变,其中有3例为1个碱基点突变,3例发生2个位点的碱基点突变。12例HBV基因C型感染者有4例出现基因点突变,而另3例HBV基因B型感染者中,2例出现基因突变株。4.HBV S基因“a”决定簇内点突变分析：15例HBsAg ELISA-NAT+标本测序结果表明“a”决定簇内点突变较多,有6例标本存在9个位点处的“a”决定簇内碱基点突变,主要以A-C突变多见。第三部分ELISA-/NAT+献血者血液HBV抗原抗体确认的研究研究方法1. HBsAg ELISA-/NAT+献血者随访策略和随访流程的设计和建立2.标本采集及处理3. ECLIA法检测HBV抗体和抗原。4.NAT检测5.统计学处理研究结果1. HBsAg ELISA-/NAT+献血者随访策略和随访流程的设计和建立。2. ELISA（-）NAT（+）献血者随访：对60名ELISA（-）, NAT（+）献血者立即进行随访,追踪成功26人（34人次）。乙型肝炎病毒表面抗原转阳的有3人；HBV核酸转阴的5人；乙型肝炎病毒表面抗原未转阳但核酸仍为反应性的10人。3.无偿献血者中HBV窗口期标本追踪检测概况4.HBsAg ELISA-/NAT+献血者HBV抗体确认。对将59人份核酸检测阳性血液标本进行乙肝“两对半”检测,结果显示,其中有1人HBsAg阳性,HBcAb阳性43人、HBsAb阳性26人,HBcAb单阳性13人。5.抗-HBc的表达与乙型肝炎隐匿性感染的关联研究：抗-HBc与HBV隐匿性感染有一定的相关性,抗-HBc不仅可以作为既往HBV感染的标志,也可以提示隐匿性HBV感染的可能。第四部分肝癌细胞survivin表达及bFGF的调控作用研究方法1.细胞培养：培养肝癌细胞系（Bel-7402）,培养基为含有10%小牛血清的DMEM培养基。每2-3天传代一次。根据文献及预实验结果对将培养的Bel-7402细胞进行不同浓度,不同时间的bFGF或wortmannin处理。2.细胞处理：将对数生长期细胞1×105/ml,接种于培养瓶,待达到70%融合时换成无血清DMEM培养液孵育过夜,使细胞同步化,然后按时间点和浓度点分组施加因素。3.Western blot分析：将样品加适量样品悬浮缓冲液后,超声破碎,离心取上清,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用10%SDS-PAGE电泳后,将PAGE凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜。加入一抗（PKB Ser473）进行Western Blot。最后定影、显影,分析结果。4. RT-PCR检测Bel-7402细胞中survivin的表达。提取细胞总RNA,设计survivin特异性引物,RT-PCR, PCR产物经2%凝胶电泳,凝胶成像仪观察结果并拍照。5.细胞周期分析：收集消化的贴壁Bel-7402细胞,加入70%冷乙醇固定48h,PI染色,用流式细胞仪进行测定荧光强度。CellQuest分析软件进行细胞周期DNA含量分析。6.统计学处理研究结果1.经bFGF处理后肝癌细胞PKB活性变化2.经bFGF处理后肝癌细胞survivin mRNA表达的变化3.PI3K抑制剂对bFGF诱导肝癌细胞survivin mRNA表达的影响。4. Wortmannin对肝癌细胞凋亡和增殖的影响研究结论：1.在输血前乙型肝炎病毒的血液筛查中,采用ELISA技术对血液标本进行初检,NAT技术进行复检的模式,能够对标本进行精确的定性检测,对窗口期的标本和隐匿性肝炎标本具有更强的检出率。2.目前常规血液筛查中检测HBsAg为阴性的合格血液,仍然存在着窗口期漏检和隐匿性乙肝感染,以隐匿性乙肝为主,病毒株多为C型,且存在着变异株,B型病毒株较少,但突变株较高,突变株可逃避现有的诊断试剂的筛查。3.抗-HBc与HBV隐匿性感染有一定的相关性,抗-HBc不仅可以作为既往HBV感染的标志,也可以提示隐匿性HBV感染的可能。在不具备开展核酸检测的地区,可以开展抗-HBc检测,以降低输血风险。4. bFGF通过依赖PI3K/PKB途径调节肝癌细胞Survivin的转录活性,促进其表达,进而抑制肝癌细胞凋亡,PI3K/PKB抑制剂wortmannin可抑制该作用,并导致survivin表达的下调。创新点1、以省级血液中心为基础,选择93613例大样本,对现有血液筛查模式下ELISA及NAT对HBV血液筛查的应用价值和输血残余风险进行对比研究。2、成功构建以核酸检测技术组合酶联免疫筛查技术的输血前经血传播病毒性疾病的检测模式来取代目前单一免疫学检测模式,显着降低经血传播疾病的风险。3、首次研究了本地区HBV感染者HBV基因类型的分布和变异株的基因序列,丰富了国内HBV基因型分布的数据,为乙肝疫苗研制和乙肝诊断试剂的改进提供实验基础和理论依据,具有重要意义。4、抗-HBc与HBV隐匿性感染有一定的相关性,抗-HBc不仅可以作为既往HBV感染的标志,也可以提示隐匿性HBV感染的可能,在不具备开展核酸检测的地区,开展抗-HBc检测可降低经血传播疾病的风险。5.首次证实bFGF刺激Bel-7402细胞后,通过依赖PI3K/PKB途径调节Survivin的转录活性,促进其表达,进而抑制肝癌细胞凋亡。
张燕,曾飞翔,何学新,何培德,刘丽,程皓,马异云,杨汇川[9]（2011）在《四川地区供血浆人群隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究》文中认为目的:了解四川地区供血浆人群隐匿性乙型肝炎病毒感染情况,分析现行标准下原料血浆的HBV残余风险。方法:采用实时荧光PCR和ELISA法对单采血浆站筛查合格的大批量原料血浆样品进行HBV NAT和HBsAg同步筛查,对筛查阳性的样品进行进口试剂复核和中和实验、HBV DNA定量测定,并对阳性血浆的供血浆者进行追踪分析,确认隐匿性乙型肝炎感染样品。结果:从来自56 620名供血浆者的135 542份血浆中检出HBV DNA阳性12份（9人）,原料血浆HBV DNA检出率为0.0089%;HBV DNA载量均低于1 000 IU/mL;采用国产ELISA试剂检测该12份样品HBsAg均为阴性,而进口试剂检测其中5份（3人）并经中和实验确认为HB-sAg阳性,其余7份样品（6人）为隐匿性乙肝感染血浆,血清学模式均为HBsAg-/HBeAg-/HBcAb+;对供血浆者进行2～7个月追踪分析,ELISA和NAT检测结果无变化,与筛查结果一致;6名隐匿性乙肝感染者年龄在36～51岁之间,男女各占一半。结论:HBsAg阴性供血浆人群中存在隐匿性乙肝病毒感染者,在本研究供浆人群中,隐匿性乙肝病毒感染率为0.0106%（1:9 437）,低于我国多家报道的无偿献血隐匿性乙肝感染率;按照现行要求采用ELISA法检测原料血浆,使用灵敏度较低的国产试剂检测HBsAg的残余风险为0.0089%（1:11 295）,若使用灵敏度较高的ELISA试剂,则其残余风险降到0.0052%（1:19 363）。增加HBV核酸检测能有效降f低原料血浆隐匿性乙肝病毒的漏检风险。
张振华,赵西平,夏剑波,李旭,陆蒙吉,杨东亮[10]（2011）在《隐匿性乙型肝炎病毒感染者血清表面抗体性质鉴定》文中认为目的了解隐匿性HBV感染者抗-HBs的特性及其与HBsAg的结合能力。方法对2例抗HBs阳性的隐匿性HBV感染者进行长期随访,使用多种试剂盒对患者血清进行多次HBsAg检测,利用不同血清型HBsAg对患者血清进行中和反应,了解血清中抗体亚型情况。PCR扩增S基因构建真核表达质粒,分析S基因变异情况,并将质粒转染HepG2细胞,取培养上清液及转染细胞分别混合进行HBsAg检测。使用患者血清及抗-HBs阳性血清（对照组）对部分HBsAg阳性克隆上清液进行中和反应。不同组间数据比较采用t检验。结果多种试剂盒进行的多次检测结果均表明患者血清HBsAg为阴性;HBsAg的3种不同血清型（adr、adw、ay）均能够中和患者血清中大部分抗HBs（82.1%～100.0%）。S基因序列分析表明核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为95.13%～97.79%和92.04%～95.58%;培养上清液和转染细胞裂解液中HBsAg定量分别为对照组的48.1%和59.3%,上清液/细胞裂解液比值分别为0.85和0.38。中和试验结果显示转染上清液中HBsAg定量较混合前有所降低,但是仍然可以检测到,而对照组检测不到HBsAg,差异均有统计学意义（F值分别为353.6和645.2,P值均<0.01）。结论抗-HBs阳性隐匿性HBV感染者体内HBsAg的抗原性及分泌能力有所下降,抗-HBs主要针对不同血清型HBsAg的共同表位,但可能与疫苗注射产生的抗HBs有所不同。
二、隐匿性乙型肝炎:免疫组织化学和S基因序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、隐匿性乙型肝炎:免疫组织化学和S基因序列分析（论文提纲范文）
（1）隐匿性乙肝及相关肝癌的研究进展（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 简介 |
| 2 隐匿性乙肝的发生机制 |
| 3 隐匿性乙肝相关肝癌的发病机制 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（2）献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 研究目的与意义 |
| 第一章 隐匿性乙型肝炎病毒感染的鉴定和分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要仪器和设备 |
| 1.2.3 主要试剂 |
| 1.2.4 主要溶液的配制 |
| 1.2.5 血清肝功能和HBV血清标志物检测 |
| 1.2.6 血浆HBV DNA提取 |
| 1.2.7 乙肝病毒载量的测定 |
| 1.2.8 BCP/PC、Whole genome、PreS/S片段的扩增 |
| 1.2.9 HBV野毒株全基因参照序列的获取 |
| 1.2.10 OBI样品基因分型 |
| 1.2.11 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 HBsAg-/DNA+人群的基本特征 |
| 1.3.2 HBsAg-/DNA+样品qPCR的检测 |
| 1.3.3 HBsAg-/DNA+样品Nested-PCR的检测 |
| 1.3.4 HBsAg-/DNA+样品的分类 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 隐匿性乙型肝炎病毒感染T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂配制 |
| 2.2.5 外周血单个核细胞的提取 |
| 2.2.6 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 2.2.7 CFSE染色、细胞培养及流式细胞术检测 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究队列基本资料 |
| 2.3.2 PHA刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.3 HBV Core多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.3.4 HBV Pol多肽库刺激下的T淋巴细胞增殖特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PHA刺激下的非特异性免疫应答 |
| 2.4.2 HBV Core多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 2.4.3 HBV Pol多肽库刺激下的特异性免疫应答 |
| 第三章 隐匿性乙型肝炎病毒感染特异性分子与细胞免疫反应特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.2.5 ELISPOT检测IFN-γ试验 |
| 3.2.6 ICS检测胞内细胞因子试验 |
| 3.2.7 CBA检测细胞培养液中细胞因子试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ELISPOT检测HBV特异性T细胞分泌IFN-γ |
| 3.3.2 ICS检测T细胞亚群的细胞分泌频数 |
| 3.3.3 CBA检测PBMCs分泌细胞因子水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HBV特异性T细胞应答反应 |
| 3.4.2 HBV特异性T细胞亚群分泌频数 |
| 3.4.3 HBV特异性T细胞分泌细胞因子水平 |
| 第四章 隐匿性乙型肝炎病毒感染与髓源抑制性细胞的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 血清肝功能、HBV血清标志物和病毒核酸检测 |
| 4.2.5 流式细胞术检测MDSCs |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 研究队列基本资料 |
| 4.3.2 外周血M-MDSCs和G-MDSCs的频数比例 |
| 4.3.3 M-MDSCs和G-MDSCs频数与肝功能指标的相关性 |
| 4.3.4 M-MDSCs和G-MDSCs频数与HBV DNA及HBsAg的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词语表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（3）乙肝表面抗原和表面抗体双阳性的流行率及突变分析（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 广州地区乙肝表面抗原与抗体双阳的流行率与血清学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 乙肝表面抗原与抗体双阳性的S基因变异分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述：乙肝表面抗原和抗体共存的研究现状 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）肝纤维化和高脂血症患者隐匿性乙型肝炎病毒感染特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 高脂血症患者隐匿性乙型肝炎感染特征 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂和实验耗材 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 患者招募流程 |
| 1.2.2 样品血清学检测 |
| 1.2.3 乙肝病毒核酸提取 |
| 1.2.4 样品乙肝病毒载量的荧光定量PCR |
| 1.2.5 BCP/PC片段巢式PCR |
| 1.2.6 检测OBI-HLP患者血清中IL-2与IL-10的表达水平 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 研究人群临床资料 |
| 1.3.2 HLP组和对照组的临床生化指标 |
| 1.3.3 高血脂患者与隐匿性HBV感染的关联 |
| 1.3.4 OBI-HLP患者IL-2,IL-10水平 |
| 1.3.5 TC水平和HBV载量之间相关性分析 |
| 1.3.6 OBI-HLP患者BCP/PC区的基因突变位点 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 OBI患者中白介素IL-2,IL-10水平变化 |
| 1.4.2 OBI-HLP患者TC水平和HBV-DNA载量之间相关性 |
| 1.4.3 OBI-HLP患者BCP/PC片段基因突变 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 肝纤维化患者隐匿性HBV感染特征 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂和主要实验耗材 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 入院检查流程 |
| 2.2.2 血清肝脏纤维四项指标检测 |
| 2.2.3 样品生物化学与免疫学指标检测 |
| 2.2.4 血清HBV-DNA NAT检测 |
| 2.2.5 乙肝病毒DNA提取 |
| 2.2.6 样品DNA荧光定量检测 |
| 2.2.7 引物设计 |
| 2.2.8 OBI样品BCP /PC、Pre-S/S片段的Nested-PCR扩增 |
| 2.2.9 OBI样品BCP /PC、Pre-S/S片段的基因序列测定以及HBV野毒株全基因参照序列的获取 |
| 2.2.10 肝组织穿刺检查 |
| 2.2.11 肝组织标本固定和切片 |
| 2.2.12 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE) |
| 2.2.13 Masson染色 |
| 2.2.14 组织病理评分 |
| 2.2.15 免疫组织化学染色 |
| 2.2.16 免疫组化评分 |
| 2.2.17 荧光原位杂交FISH检测 |
| 2.2.18 肝脏瞬时弹性硬度(Fibroscan)检查 |
| 2.2.19 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究对象一般情况资料 |
| 2.3.2 OBI患者血清生化指标 |
| 2.3.3 肝纤维化四项指标水平比较 |
| 2.3.4 OBI患者血清HBV-DNA载量测定 |
| 2.3.5 OBI患者肝脏组织病理学检查 |
| 2.3.6 HBcAg和HBsAg在肝脏组织中的表达 |
| 2.3.7 肝穿组织免疫荧光原位杂交(FISH)实验 |
| 2.3.8 肝穿刺患者的Fibroscan检查结果 |
| 2.3.9 肝穿组织FISH与免疫组化结果分析 |
| 2.3.10 肝穿刺患者肝纤维化四项、HBV-DNA载量与LSM值 |
| 2.3.11 HBV-DNA与HA、LSM、IHC评分、HAI评分之间相关性 |
| 2.3.12 OBI患者血清BCP/PC片段和PreS/S片段Nested-PCR结果 |
| 2.3.13 隐匿性乙型肝炎病毒感染样品的外膜蛋白序列特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 肝纤维化患者中OBI的发生率分析 |
| 2.4.2 PreS/S片段Nest-PCR结果分析 |
| 2.4.3 肝纤维化指标和OBI之间的相关性 |
| 2.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词语表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）1-3岁儿童乙肝疫苗无应答与接种剂量、隐匿性乙肝感染的关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 内容与方法 |
| 1. 横断面调查 |
| 2. 实验室检测 |
| 3. 随访研究 |
| 4. 乙肝病毒分子生物学分析 |
| 5. 质量控制 |
| 6. 统计学分析 |
| 7. 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（6）人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 乙型肝炎病毒与乙肝流行病学研究进展 |
| 1.1 乙型肝炎概述 |
| 1.2 HBV的发现 |
| 1.3 HBV分类 |
| 1.4 HBV的形态特点 |
| 1.5 HBV的复制周期 |
| 1.6 HBV的发病机理 |
| 1.7 HBV的基因型和分布 |
| 1.8 HBV在动物中的流行 |
| 1.9 HBV受体研究进展 |
| 2 HBV感染模型和动物模型研究进展 |
| 2.1 HBV感染的细胞模型 |
| 2.2 HBV感染的动物模型 |
| 3 HBV与细胞凋亡 |
| 4 HBV与内质网应激(ERS) |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病原学研究 |
| 试验一 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的PCR和血清学检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 人源HBV阳性血清DNA含量测定结果 |
| 3.2 沙鼠和C57BL/6小鼠血清、组织和粪便中HBV DNA的PCR检测 |
| 3.3 感染鼠肝脏中HBV DNA含量Real-time PCR测定结果 |
| 3.4 感染沙鼠和C57BL/6小鼠血清ELISA检测结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验二 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠后HBV相关抗原的检测 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏中HBV相关抗原免疫组化检测结果 |
| 3.2 Western blot检测肝脏中HBV抗原 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验三 人源HBV体外与沙鼠和C57BL/6小鼠血液共培养试验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 沙鼠和C57BL/6小鼠血液体外与HBV混合培养后DNA的PCR检测 |
| 3.2 PCR扩增序列比对 |
| 4 讨论和小结 |
| 第三章 人源HBV感染致沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏损伤机制的研究 |
| 试验一 人源HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学变化观察 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV感染对肝脏脏器指数及血清AST、ALT的影响 |
| 3.2 HBV感染沙鼠的病理学变化观察 |
| 3.3 HBV感染C57BL/6小鼠的病理学变化观察 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验二 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织PCNA及HSP70表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中PCNA的表达情况 |
| 3.2 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中HSP70的表达情况 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验三 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Bax和Bcl-2的表达情况 |
| 3.2 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Fas和FasL的表达情况 |
| 3.3 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织中Caspase 3的表达情况 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验四 HBV感染对沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏组织ERS相关分子表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV感染沙鼠和C57BL/6小鼠肝脏中内质网应激相关分子的蛋白量变化 |
| 3.2 Western blot检测HBV感染后肝脏中内质网应激相关分子蛋白量变化 |
| 4 讨论与小结 |
| 试验五 人源HBV感染沙鼠线粒体DNA基因变化的观察 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 沙鼠线粒体D-loop基因的扩增结果 |
| 3.2 沙鼠线粒体CytC基因的扩增结果 |
| 3.3 沙鼠线粒体CytB基因的扩增结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 图版与说明 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）张家口地区献血者隐匿性乙肝病毒感染研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.3.1 血清学检测 |
| 1.3.2 nested-PCR检测 |
| 1.3.3 HBV-DNA |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 献血者基本情况 |
| 2.2 血清学检测结果 |
| 2.3 HBV核酸检测结果 |
| 2.4 基因型分析 |
| 3 讨论 |
（8）输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 序言 |
| 第一部分 输血前应用NAT大规模筛查乙肝病毒的模式构建及应用研究 |
| 实验材料 |
| 实验仪器 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HBsAg ELISA-/NAT+献血者HBV血清学模式和病毒变异分析 |
| 实验材料 |
| 实验仪器 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 HBsAg ELISA-/NAT+献血者血HBV抗原抗体确认与分析 |
| 实验材料 |
| 实验仪器 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 Bel-7402肝癌细胞survivin表达及bFGF的调控作用 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 论文创新点 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 攻读博士学位期间参加科研课题情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附表 |
四、隐匿性乙型肝炎:免疫组织化学和S基因序列分析（论文参考文献）
- [1]隐匿性乙肝及相关肝癌的研究进展[D]. 包镇洁. 重庆医科大学, 2019(01)
- [2]献血者人群隐匿性乙型肝炎病毒感染分子与细胞免疫特征分析[D]. 张卫云. 南方医科大学, 2018
- [3]乙肝表面抗原和表面抗体双阳性的流行率及突变分析[D]. 刘克敏. 广州医科大学, 2018(01)
- [4]肝纤维化和高脂血症患者隐匿性乙型肝炎病毒感染特征分析[D]. 杨柳. 南方医科大学, 2017(11)
- [5]1-3岁儿童乙肝疫苗无应答与接种剂量、隐匿性乙肝感染的关联研究[D]. 李媛媛. 新疆医科大学, 2017(10)
- [6]人源HBV人工感染沙鼠和C57BL/6小鼠的病理学研究[D]. 赵月. 中国农业大学, 2014(03)
- [7]张家口地区献血者隐匿性乙肝病毒感染研究[J]. 贾晓坤,贾晓晖,杨鹏华,李双霞,李银. 现代生物医学进展, 2013(10)
- [8]输血前血液筛查中新型HBV基因突变及抗原分析的研究[D]. 孙波. 山东大学, 2013(10)
- [9]四川地区供血浆人群隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究[A]. 张燕,曾飞翔,何学新,何培德,刘丽,程皓,马异云,杨汇川. 2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集, 2011
- [10]隐匿性乙型肝炎病毒感染者血清表面抗体性质鉴定[J]. 张振华,赵西平,夏剑波,李旭,陆蒙吉,杨东亮. 中华肝脏病杂志, 2011(07)
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