一、佛波酯对细胞间隙连接通讯的影响及其作用机制（论文文献综述）
许琳[1]（2021）在《基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制》文中研究说明研究背景溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种慢性、复发性疾病,是炎症性肠病的常见亚型之一。UC以反复发作的腹泻、腹痛,黏液脓血便为主要临床特点,近10年来我国UC发病率迅速上升。UC的发病机制复杂,其中肠黏膜屏障损伤是UC发病的重要病理生理基础,黏膜愈合是UC治疗的关键终点指标,但维持肠黏膜屏障完整,促进肠上皮损伤后修复的调控机制尚未阐明。巨噬细胞作为固有免疫系统中的主要效应细胞,在UC炎症损伤和上皮修复过程中发挥关键作用。巨噬细胞失调是UC黏膜免疫紊乱的突出特征,同时是达到黏膜愈合和体内稳态的关键靶点。目前UC的治疗方案仍存在停药后难以长期维持临床缓解及部分患者无应答的问题,严重影响了患者的生活质量并导致了高昂的医疗负担。鉴于巨噬细胞强大的可塑性及其在肠道稳态中的调控作用,近年来巨噬细胞成为UC治疗的焦点。最近的研究表明β-catenin/FOSL2/ARID5A或为调控巨噬细胞极化的关键通路,但其在UC发生发展中的作用尚需进一步明确。越来越多的研究证据支持中医药治疗UC具有良好的临床效果,能有效缓解患者临床症状,改善预后,但具体的作用机制尚需进一步明确。清热利湿复方加味葛根芩连汤是导师唐旭东教授在对UC基本病机理解的基础上,结合多年临床经验制定的经验方。前期动物实验结果表明加味葛根芩连汤能够减轻葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠结肠炎症状,改善结肠黏膜超微结构,但其作用机制尚待进一步阐明。由此,我们思考加味葛根芩连汤改善UC症状,减轻肠黏膜损伤的机制是什么,是否与调控肠巨噬细胞极化有关,其调控巨噬细胞极化、促进肠上皮修复的通路和靶点是什么,是否与β-catenin/FOSL2/ARID5A通路相关,这值得我们进一步探讨。第一部分UC患者巨噬细胞极化状态的临床研究研究目的明确UC患者结肠巨噬细胞极化状态及β-catenin/FOSL2/ARID5A蛋白表达情况。研究方法1 采用多因子检测方法,对UC患者及健康受试者血清中炎症因子（IP-10、IL-12p70、TNF-α、IL-1β、IL-12p40、IL-23、IL-6、IL-4、IL-10、Arginase、TARC、IL-1RA）含量进行检测。2采用免疫组化检测UC患者及健康受试者结肠活检组织的巨噬细胞极化相关蛋白FOSL2、ARID5A的表达情况。3采用免疫荧光检测UC患者及健康受试者肠黏膜巨噬细胞极化相关蛋白CD68、CD163、iNOS,肠黏膜屏障关键蛋白 ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin的表达情况。研究结果1与健康受试者相比,UC患者促炎因子IP-10表达水平显着升高（p<0.01）,抑炎因子 IL-10（p<0.05）、IL-4（p<0.05）、Arginase（p<0.001）、IL-1RA（p<0.01）表达水平显着降低。2与健康受试者相比,UC患者结肠组织中肠黏膜屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin 表达水平显着降低（p<0.05）。3与健康受试者相比,UC患者结肠组织中M1巨噬细胞标志蛋白iNOS表达水平显着上升（p<0.05）,M2标志蛋白CD163表达水平显着下降（p<0.05）。与健康对照组相比,UC患者结肠组织中巨噬细胞极化相关蛋白FOSL2表达水平显着下降（p<0.05）,ARID5A表达水平显着上升（p<0.05）。研究结论一1 UC患者存在炎症因子失衡,具体表现为促炎因子IP-10上调,抑炎因子IL-10、IL-4、Arginase、IL-1RA 下调。2 UC患者存在肠黏膜屏障损伤,肠黏膜屏障关键蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin表达水平降低。3 UC患者存在巨噬细胞极化异常及巨噬细胞极化相关通路β-catenin/FOSL2/ARID5A表达异常,表现为M1巨噬细胞增多,M2巨噬细胞减少,β-catenin、FOSL2表达水平下降,ARID5A表达水平上升。4 β-catenin/FOSL2/ARID5A信号通路的异常可能导致了巨噬细胞极化失调,继而导致炎症因子失衡及肠黏膜屏障的损伤。第二部分加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的效应机制研究在体实验加味葛根芩连汤对DSS诱导结肠炎巨噬细胞极化的影响研究目的明确加味葛根芩连汤干预DSS诱导急性结肠炎模型小鼠的疗效,以巨噬细胞极化为切入点,阐明加味葛根芩连汤发挥疗效的作用机制。研究方法1以DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型为载体,将小鼠随机分为正常组、模型组、加味葛根芩连汤低剂量组、加味葛根芩连汤中剂量组、加味葛根芩连汤高剂量组,以小鼠体重,疾病活动指数,脾重,结肠长度,结肠组织病理学评分,电镜为指标评估加味葛根芩连汤的干预效果。2观察加味葛根芩连汤对肠黏膜屏障的影响:检测小鼠肠黏膜通透性,结肠组织髓化过氧化物酶含量,丙二醛含量,采用免疫组化检测结肠BrdU表达水平评估上皮增殖状况;采用免疫组化检测结肠E-Cadherin,β-catenin,Occludin,ZO-1表达,评估肠黏膜屏障损伤情况。3观察加味葛根芩连汤对巨噬细胞极化的影响:采用流式细胞术检测小鼠脾脏及结肠组织中M1/M2巨噬细胞亚型的含量;采用免疫荧光检测小鼠结肠组织F4/80、CD206 含量;采用 Elisa 检测结肠组织 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量。4基于β-catenin/FOSL2/ARID5A信号通路,研究加味葛根芩连汤调控巨噬细胞极化的分子机制:采用Western blot检测结肠组织β-catenin、FOSL2、ARID5A 蛋白水平表达情况,采用 Realtime PCR 检测 β-catenin、FOSL2、ARID5A mRNA水平表达情况。研究结果1小鼠一般情况:与正常组相比,模型组小鼠出现弓背、毛发竖起,活动减少,体重降低,腹泻,便血的状况,结肠长度明显缩短,脾重明显增加,组织病理学评分明显升高。与模型组相比,加味葛根芩连汤各给药组小鼠体重显着上升（p<0.001）,加味葛根芩连汤高剂量组DAI评分显着降低（p<0.001）,各给药组结肠缩短状况明显改善（p<0.05）,脾重明显降低（p<0.05）,各给药组组织病理学评分均降低（p<0.05）。结肠电镜结果显示:正常组小鼠的微绒毛发达。细胞充满了线粒体和囊泡。可在细胞与细胞接触的腔侧见到细胞间连接复合体。与正常组相比,模型组小鼠的结肠中,多数紧密连接的结构紊乱,融合点较少见,并且细胞间间隙增宽。加味葛根芩连汤干预组介于正常组与模型组之间。2肠黏膜屏障评估:与正常组相比,模型组肠黏膜通透性明显升高（p<0.05）,MPO含量明显升高（p<0.05）,MDA含量明显升高（p<0.05）,BrdU表达降低（p<0.05）;与模型组相比,各给药组肠黏膜通透性均降低（p<0.05）,各给药组MPO含量显着降低（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组MDA含量显着降低（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组BrdU表达显着上升（p<0.05）。免疫组化检测结果显示,与正常组相比,模型组E-Cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1表达量下降（p<0.05）,与模型组相比,加味葛根芩连汤中剂量组E-Cadherin、Occludin表达上升（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、高剂量组β-catenin表达上升（p<0.05）,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组、高剂量组ZO-1表达均显着上升（p<0.05）。4结肠炎症因子检测结果显示与正常组小鼠相比,模型组小鼠结肠黏膜组织TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高（p>0.05）,IL-10含量降低（p>0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤各剂量组IL-1β、IL-6含量降低（p<0.05）;。5流式细胞术检测结果:脾脏流式结果显示,与正常组相比,模型组脾脏中M2巨噬细胞比例下调（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤高剂量组白细胞比例下调（p<0.05）,低剂量和中剂量组DC细胞比例下调（p<0.05）,低剂量组M2比例上调（p<0.05）。结肠流式结果显示,与正常组相比,模型组结肠组织中巨噬细胞比例上调（p<0.05）,M1巨噬细胞比例显着上调（p<0.05）,M2巨噬细胞比例下调（p>0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤中剂量和高剂量组Ml比例下调（p<0.05）,高剂量组M2比例上调（p<0.05）,高剂量组DC细胞比例下调（p<0.05）。免疫荧光结果显示与正常组相比,模型组F4/80表达量显着上升（p<0.05）。6β-catenin/FOSL2/ARID5A表达情况:Western blot检测结果显示:与正常组相比,模型组β-catenin表达降低（p>0.05）,FOSL2表达显着降低（p<0.05）,ARID5A表达升高（p<0.05）。与模型组相比,加味葛根芩连汤各组β-catenin表达均显着升高（p<0.05）,加味葛根芩连汤各组FOSL2表达均显着升高（p<0.05）;加味葛根芩连汤中剂量组、高剂量组ARID5A表达降低（p<0.05）。Real Time PCR检测结果显示,与正常组相比,模型组小鼠结肠组织中β-catenin mRNA、FOSL2mRNA表达水平明显降低（p<0.05）,ARID5AmRNA表达水平明显升高（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤低剂量组β-cateninmRNA、FOSL2 mRNA水平明显升高（p<0.05）,与模型组相比,加味葛根芩连汤低剂量组、中剂量组、高剂量组ARID5A mRNA表达水平显着升高（p<0.05）。研究结论二1加味葛根芩连汤可有效减轻DSS诱导的结肠炎症状,改善体重减轻,结肠缩短,下调MPO、MDA水平,改善肠黏膜超微结构,降低DSS导致的结肠黏膜通透性增加,下调结肠组织促炎因子IL-1β、IL-6表达水平,促进肠上皮增殖,诱导E-Cadherin、β-catenin、Occludin、ZO-1表达上调,维持肠黏膜屏障完整。2加味葛根芩连汤可调控结肠炎小鼠巨噬细胞极化状态,抑制M1巨噬细胞极化,促进M2巨噬细胞极化,上调β-catenin、FOSL2表达,下调ARID5A表达。离体实验加味葛根芩连汤含药血清对THP-1巨噬细胞极化的影响研究目的明确加味葛根芩连汤体外干预M1巨噬细胞极化模型的作用,阐明加味葛根芩连汤发挥疗效的作用靶点。研究方法1构建M1巨噬细胞极化模型:采用PMA叠加LPS/IFN-γ刺激THP-1细胞建立M1巨噬细胞极化模型,镜下观察THP-1细胞形态变化,应用流式细胞术检测细胞表面CD11b阳性表达率。2观察加味葛根芩连汤含药血清对M1巨噬细胞炎症因子的影响.:将细胞随机分为6组,分别是正常组（Con）,模型组（Model）,加味葛根芩连汤含药血清低剂量组（GL）,加味葛根芩连汤含药血清中剂量组（GM）,加味葛根芩连汤含药血清高剂量组（GH）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清低剂量组（LW）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清中剂量组（MW）,β-catenin抑制剂+加味葛根芩连汤含药血清高剂量组（HW）,检测各组细胞上清促炎因子IL-1β的含量变化。研究结果1 以100ng/ml PMA 叠加 LPS（100ng/ml）/IFN-y（20ng/ml）构建 THP-1 M1巨噬细胞极化模型,采用CCK8检测不同浓度含药血清孵育细胞24h后对细胞活力的影响,结果显示血清浓度增高影响细胞活力,且10%加味葛根芩连汤中剂量、高剂量含药血清血清细胞活力显着高于20%血清细胞活力,本实验拟选用10%浓度的含药血清作为后续实验的给药浓度。2细胞上清IL-1β检测结果:与正常组相比,各组IL-1β含量均显着高于正常组（p<0.05）;与模型组相比,加味葛根芩连汤含药血清低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-1β含量均显着低于模型组（p<0.05）;添加抑制剂后,各含药血清组IL-1β含量均显着高于未加抑制剂组（p<0.05）。研究结论三1 CCK8结果提示血清浓度增高影响细胞活力,本实验拟选用10%浓度的含药血清作为后续实验的给药浓度。2加味葛根芩连汤含药血清可直接作用于巨噬细胞,抑制LPS/IFN-γ诱导的THP-1巨噬细胞M1方向极化,降低促炎因子IL-1β的释放。添加IWR-1抑制剂后,这一抑制作用减弱,提示β-catenin可能为加味葛根芩连汤的作用靶点,加味葛根芩连汤可通能过β-catenin/FOSL2/ARID5A通路抑制M1巨噬细胞的极化。研究结论加味葛根芩连汤可能通过调控β-catenin/FOSL2/ARID5A通路蛋白表达抑制M1巨噬细胞的极化,促进炎症因子的平衡及肠上皮损伤后修复,维持肠黏膜屏障完整,缓解结肠炎症状。
贺佳星[2]（2021）在《新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究》文中研究指明背景:宫颈癌是全世界最常见的妇科恶性肿瘤之一,其所致的死亡人数占女性癌症死亡总数的第二位。高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomaviruse,HR-HPV）是导致宫颈癌发生的主要原因。目前,宫颈癌的治疗取决于疾病的分期,局限于子宫的癌症的治疗以手术为基础,同时进行的放疗/化疗是局部晚期癌症的治疗标准。铂类-紫杉醇联合化疗,可能添加贝伐珠单抗是目前晚期宫颈癌的治疗选择,但它仅具有缓解目的。因此改善治疗现状,为患者带来生存获益是目前亟待解决的难题。蜂毒（Bee venom,BV）是一种生物毒素,主要有效成分包括蜂毒肽（melintin,MEL）、酶、生物活性胺等。文献报道MEL具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物学作用,近年来也发现MEL具有调节肿瘤免疫的作用。但MEL是否可抑制宫颈癌进展和调节宫颈癌免疫微环境及其具体机制尚不清楚。由于MEL的毒性、非特异性、易降解、有限的生物利用度和溶血等特点限制了其在癌症中的应用。我们前期构建了以MEL为主体的新型氨基酸融合肽UM-6并且进行了初步研究,发现UM-6不仅发挥了良好的抗肿瘤作用,同时又弥补了MEL的毒性、易降解和溶血等缺点。前期研究证实UM-6具有良好的抗宫颈癌作用,但作用机制尚不明确。目的:探究新型氨基酸融合肽UM-6抗宫颈癌的具体作用机制以及抗宫颈癌免疫的具体作用机制,为宫颈癌药物研发和治疗提供新方向。方法:1.新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及其作用机制研究1)UM-6对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。用不同浓度的UM-6处理两种宫颈癌细胞系Hela和Caski细胞24、48h后,利用CCK8法来检测细胞活性,并计算出药物的IC50;通过平板克隆实验来检测UM-6对宫颈癌细胞增殖的影响。通过细胞划痕实验、细胞Transwell实验和三维（3D）肿瘤球体侵袭实验检测UM-6对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响。2)利用蛋白组学筛选出UM-6的重要通路PI3K-AKT信号和靶蛋白Eph A2,通过Western Blot、免疫荧光（IF）和q PCR进行验证蛋白和m RNA表达情况。3)UM-6抑制P-AKT和Eph A2相互作用从而介导Eph A2降解的研究。利用免疫共沉淀（CO-IP）和IF检测UM-6处理前后P-AKT和Eph A2的相互作用。应用AKT激活剂（SC79）和抑制剂（LY294002）进一步检测UM-6对Eph A2蛋白表达的影响。4)UM-6诱导Eph A2溶酶体途径降解的研究。通过蛋白生物合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）进行脉冲追踪分析以检测UM-6对Eph A2半衰期和稳定性的影响。IF和CO-IP检测UM-6对Eph A2蛋白亚定位的影响。Western Blot和IF检测UM-6对Eph A2泛素化和Eph A2相关的泛素化连接酶c-Cbl蛋白表达的影响。5)构建Hela细胞宫颈癌皮下荷瘤裸鼠模型,给予UM-6腹腔注射,监测肿瘤生长速度,瘤体体积大小和重量。Western Blot、免疫组织化学染色（IHC）和IF检测体内UM-6对P-AKT和Eph A2表达的影响。2.新型融合肽UM-6抗宫颈癌免疫及其作用机制研究1)UM-6对宫颈癌免疫的影响。构建小鼠宫颈癌U14细胞同源皮下荷瘤C57BL/6小鼠模型,给予UM-6腹腔注射,监测肿瘤生长。IHC和IF检测肿瘤移植物中UM-6处理后PD-L1、cleaved caspase 3（CCA3）和Ki67的表达水平,流式细胞术检测UM-6处理后杀伤CD8+T细胞和衰竭T细胞以及效应CD4+T细胞水平和Treg细胞的数量变化。2)Eph A2与宫颈癌中T细胞相关免疫检查点分子PD-L1的相关性。通过宫颈癌TCGA数据库中基因集合富集分析（GSEA）筛选了与Eph A2相关的T细胞相关免疫检查点分子。通过TIMER数据库研究了Eph A2与宫颈癌免疫抑制信号的相关性。通过Western Blot、流式细胞术和IF检测了Eph A2对T细胞相关免疫检查点分子PD-L1蛋白表达的影响。TCGA数据库和宫颈癌组织芯片IHC评估了Eph A2和PD-L1在宫颈癌中的表达和相关性。3)UM-6影响PD-L1表达的机制研究。Western Blot、流式细胞术和IF检测UM-6对PD-L1总蛋白和膜蛋白的表达情况。N-糖基化抑制剂Tunicamycin（TM）和UM-6共处理检测PD-L1糖基化改变。CHX脉冲追踪分析检测UM-6对PD-L1半衰期和周转率的影响。IF和CO-IP检测UM-6对PD-L1亚定位以及稳定性的影响。结果:1.新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及其作用机制研究1)UM-6有效抑制宫颈癌细胞系Hela和Caski的增殖、迁移和侵袭能力,呈剂量依赖性和时间依赖性,而对Ha Ca T细胞的增殖和毒性影响较小。2)在宫颈癌细胞系中UM-6下调了P-AKT和Eph A2的蛋白表达,但不影响Eph A2的m RNA水平。IF结果显示UM-6处理之前,Eph A2主要定位细胞膜,少数以点状模式定位在细胞质核周区,而UM-6处理后Eph A2表达发生了易位,多数阳性染色位于细胞质内,核周区偏多,而细胞膜表达显着减少。3)UM-6显着降低了Eph A2 Ser897位点的磷酸化水平以及Eph A2和P-AKT的相互作用。AKT抑制剂LY294002能够抑制Eph A2 Ser897磷酸化,AKT激动剂SC79显着增加了Eph A2 Ser897磷酸化并且恢复了UM-6介导的Eph A2 Ser897磷酸化抑制。4)UM-6导致Eph A2周转率显着增加,半衰期显着缩短。UM-6与蛋白酶体抑制剂MG-132或者溶酶体抑制剂氯喹（CQ）共孵育时,仅有CQ能较大程度的逆转UM-6诱导的Eph A2的降解。IF结果显示UM-6显着增加并且延长了Eph A2在早期内吞小体和晚期内吞小体的定位,而显着降低了Eph A2在循环内吞小体上的定位,同时增加了Eph A2在溶酶体的共定位。UM-6还显着增加c-Cbl的磷酸化和与Eph A2的相互作用从而增加Eph A2的泛素化以及Eph A2与多泡体ESCRT复合体的相互作用。5)UM-6抑制了肿瘤异种移植物的生长、体积和瘤重。并且UM-6治疗组显着减少了Eph A2和P-AKT的表达。2.新型融合肽UM-6抗宫颈癌肿瘤免疫及其作用机制研究1)UM-6明显抑制了小鼠U14移植瘤的生长,减少了肿瘤移植物PD-L1蛋白表达水平,而且还增加了抗肿瘤免疫的主要效应因子CD8+T细胞释放的颗粒酶B（GB）的数量。由于抗肿瘤免疫在肿瘤组织中伴随着凋亡,UM-6治疗组肿瘤组织中发生了强凋亡信号,并且增殖标记物Ki67表达也明显降低。流式细胞术结果显示UM-6增强了CD8+T细胞分泌IFNγ的功能,减少了衰竭PD-1+T细胞的比例。UM-6还增加了移植物中效应IFNγ+CD4+T细胞的比例,减少了Treg的数量。2)GSEA显示TCGA数据库中Eph A2和适应性免疫应答信号通路在宫颈癌中高度相关,并且该通路富集的蛋白中CD274（PD-L1）评分较高,并且Eph A2和PD-L1在宫颈癌中存在显着的正相关。TIMER数据库结果显示Eph A2与宫颈癌免疫抑制信号特征相关,如耗尽T细胞信号、效应Treg细胞信号。Eph A2过表达上调了PD-L1蛋白含量以及膜定位,而si-Eph A2沉默降低了PD-L1的蛋白表达和膜定位,并且显着增加PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。Eph A2 Ser897可能也参与PD-L1和肿瘤免疫的调节。Westernblot和流式分析结果显示Eph A2 WT和Eph A2 S897D过表达明显增加了PD-L1总蛋白和膜蛋白的表达,而Eph A2 S897A过表达下调了PD-L1总蛋白和膜蛋白的水平。TCGA数据库和肿瘤组织芯片IHC结果显示宫颈癌组织中Eph A2和PD-L1在宫颈癌中的高表达,并且高Eph A2表达的患者在肿瘤中的PD-L1表达也会升高,并且Eph A2和PD-L1呈现明显的共定位。3)Westernblot和流式分析结果显示UM-6能够抑制PD-L1的总蛋白表达和膜蛋白表达,抑制了PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。IF结果表明在对照组中PD-L1主要位于细胞膜上,UM-6处理后PD-L1细胞膜上的信号减弱,伴随着是胞质的点状染色模式增加。在进一步检测中发现未处理的细胞中大多数PD-L1在～45 k Da检测到,而UM-6处理后PD-L1发生了明显的带移,～45kda明显减少而～33 k Da的条带增加,证实了UM-6抑制PD-L1的糖基化。TM处理后导致PD-L1的大部分～45-k Da完全糖基化蛋白迁移到～33 k Da的非糖基化形式。而在UM-6和TM共处理的细胞中,PD-L1的分子量向非糖基化转移更为明显。CHX脉冲追踪分析显示UM-6诱导的～33 k Da非糖基化形式的PD-L1半衰期更短,有更快的周转率,MG132与UM-6共处理后～33 k Da的PD-L1表现出更多的泛素化。IF结果显示在对照组中PD-L1主要位于细胞膜上,而UM-6处理后PD-L1与内质网标记物HSP90B1共定位,未发现PD-L1与高尔基体标记物TGN46共定位,表明UM-6处理后非糖基化形式的PD-L1增多并且滞留在内质网中。Westernblot和CO-IP证实了UM-6能够降低STT3A的蛋白水平以及与PD-L1的相互作用,并且增加了PD-L1与内质网相关性降解途径（ERAD）组分的结合表明UM-6通过ERAD途径促进PD-L1降解。结论:1.UM-6体外和体内均抑制宫颈癌增殖和侵袭,具体作用机制主要是UM-6抑制PI3K-AKT信号通路介导的Eph A2 Ser897磷酸化,随后招募并磷酸化c-Cbl,诱导其与Eph A2相互作用导致Eph A2的泛素化增加,泛素化的Eph A2经ESCRT复合体识别并将其锚定到MVB表面,进而增加了Eph A2转运到溶酶体的数量,促进其在溶酶体中的转运和降解。2.Eph A2可能通过PD-L1参与宫颈癌的肿瘤免疫调节,PI3K-AKT/Eph A2/PD-L1是参与宫颈癌肿瘤免疫的一种新途径。Eph A2的封锁可能代表了免疫治疗难治性癌症的一种新的治疗途径。3.UM-6参与PD-L1/PD-1轴介导的宫颈癌免疫肿瘤微环境的调节。具体机制表现为UM-6抑制PD-L1的起始糖基化,阻碍了PD-L1从内质网向高尔基体的运输和进一步的成熟和折叠,导致PD-L1通过ERAD途径的蛋白酶体降解,最终阻止PD-L1的正确膜定位和与PD-1的相互作用,增加肿瘤对T细胞介导的杀伤作用的易感性,靶向肿瘤的免疫逃逸。
李美蓉[3]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究说明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
陈露露[4]（2019）在《乌骨鸡黑色素含量测定及黑色素细胞裂解液活性研究》文中研究表明乌骨鸡（Black-bone silky fowl,BSF）又称乌鸡、泰和鸡等,是江西特有的药食两用资源。它集药、补、食三大功能于一体,对人体具有特殊的滋补功能,能够调节身体机能,提高人体免疫力。乌骨鸡黑色素是乌骨鸡最重要的功能成分之一,但由于溶解性差（不溶于水和有机溶剂）,化学结构还不清楚,导致目前乌骨鸡黑色素的测定还未有便捷、可靠的方法,因此寻找一种较简单、快速、准确且无需将黑色素完全溶解的新方法显得至关重要。本文成功地建立了一种测定乌骨鸡黑色素含量的H2O2氧化-荧光分析法方法,可用于快速、准确地分析乌骨鸡肉以及乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的含量;乌骨鸡及其黑色素均具有良好的抗炎以及抗氧化效果,并且乌骨鸡黑色素是由黑色素细胞生成,乌骨鸡黑色素细胞在乌骨鸡体内广泛分布,本文通过低温超声裂解法获得乌骨鸡黑色素细胞裂解液（BMCL）,探究BMCL对LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应的抗炎作用,BMCL对H2O2诱导的HUVEC细胞的氧化损伤的保护作用。本研究为进一步阐明乌骨鸡滋补药用、营养作用以及促进乌骨鸡活性成分的开发和利用提供了实验科学依据。主要研究结论归纳如下:1.建立一种测定乌骨鸡肉中黑色素含量的H2O2氧化-荧光分析方法。结果表明:乌骨鸡黑色素标准品（600μg/mL）的激发波长为354 nm,发射波长为453 nm,乌骨鸡黑色素在浓度范围50-600μg/mL内的回归方程为y=0.0094X+0.6926,r=0.9986,荧光分析法的方法检出限为0.30μg/mL,紫外分光光度法的方法检出限为3.68μg/mL。荧光分析方法测定的黑色素最低浓度为0.5μg/mL,而紫外分光光度法测定的最低浓度为5μg/mL。样品前处理的最佳条件为:NaOH浓度最佳范围为0.1-0.2 M,超声时间为40 min,超声温度为70℃。乌骨鸡黑色素最佳氧化条件为55℃、氧化时间为2 h,过氧化氢浓度为20%-25%。稳定实验RSD为1.49%、仪器精密度实验RSD值为2.03%。加标回收实验中平均回收率为102.865%,RSD为4.505%,取0.2 g鲜重采用该方法测得腿部肌肉,胸肌和鸡皮肤中的黑色素含量分别为0.879±0.023 mg,0.681±0.012 mg和2.162±0.075 mg,分别占鲜重的0.439%,0.340%,1.081%。以上结果表明该方法准确性较高,且无需从样品中提取黑色素,大大缩短了反应时间,有效地简化了分析操作。2.建立一种测定乌骨鸡黑色素细胞中黑色素含量的H2O2氧化-荧光分析方法。结果表明:乌骨鸡黑色素标准品（100μg/mL）的激发波长为354 nm,发射波长为453 nm。乌骨鸡黑色素在浓度范围10-100μg/mL内的回归方程为y=0.0147X+0.3138,r=0.9974,乌骨鸡黑色素最佳氧化条件为55℃、氧化时间为2h,过氧化氢浓度为24%-26%。这与上述确认的乌骨鸡黑色素最佳氧化反应条件基本一致,重复性实验RSD值为4.59%,精密度实验RSD值为1.87%。在A375细胞中添加不同浓度的黑色素标准品（25μg/mL、40μg/mL、80μg/mL）,测定值与理论值的相对误差分别为2.78%、3.53%、0.25%,在乌骨鸡黑色素细胞样品中添加不同浓度的乌骨鸡黑色素标准品,所得的平均加标回收率为95.57%,RSD值为4.00%,结果表明H2O2氧化-荧光分析方法测定准确可靠,并且不受胞内杂蛋白和脂质的影响。3.当IBMX浓度在200-500μM之间时,各浓度能显着抑制黑色素细胞的生长（P<0.01）,并且乌骨鸡黑色素细胞存活率随着IBMX的浓度的增加而降低,细胞存活率在40.64%-80.98%之间。浓度为100μM的IBMX对乌骨鸡黑色素细胞的活性并无显着的影响。浓度为100μM和300μM的IBMX相对于空白组能够显着地促进乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的合成量（P<0.01）。当IBMX浓度达到400μM时也能显着提高乌骨鸡黑色素细胞中的黑色素含量（P<0.05）。200μM以及500μM的IBMX对黑色素细胞合成黑色素并无显着的促进作用。综上所述,在所试浓度范围内,IBMX能够显着促进乌骨鸡黑色素细胞中黑色素的合成。4.观察RAW264.7细胞的形态,用MTT法测定细胞活力以及测定RAW264.7细胞的NO生成量,探究促进RAW264.7细胞产生炎症的最佳LPS浓度,结果发现LPS为1μg/mL时对细胞毒性最小、NO生成量最大。因此建立了LPS诱导RAW264.7细胞的炎症模型,在此基础上进一步研究了不同浓（0.2-125μg/mL,以乌骨鸡黑色素细胞胞内蛋白的浓度计为细胞的裂解液浓度）乌骨鸡黑色素细胞裂解液对RAW264.7细胞的生长的影响,以及在不同作用时间和不同作用模式下,乌骨鸡黑色素细胞的裂解液在对RAW264.7的NO生成量的影响。结果表明:乌骨鸡黑色素细胞的裂解液浓度在0.2-25μg/mL内对RAW264.7细胞的生长无显着影响,当BMCL浓度上升至25和125μg/mL时,细胞的存活率分别为115.66%和157.50%,和空白组相比有显着的差异（P<0.01）,能够促进RAW264.7细胞的增殖。因此选择1、5、25μg/mL分别作为乌骨鸡黑色素细胞裂解液的低、中和高浓度进行后续实验。在预防模式、共同作用模式以及治疗模式下,浓度为1、5、25μg/mL乌骨鸡细胞的裂解液的对细胞NO生成量有不同程度的影响,相比之下,预防模式下乌骨鸡细胞的裂解液对细胞NO生成的抑制率最大,抗炎效果最明显。当作用不同时间时,高、中和低浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液均能显着降低细胞NO生成量（P<0.01）。5.钙、铁元素作用后的高（25μg/mL）、中（5μg/mL）和低浓度（1μg/mL）的乌骨鸡黑色素细胞裂解液相对模型组（1μg/mL）均能显着降低RAW264.7细胞的NO的生成量（P<0.01）,这表明钙、铁元素能增强乌骨鸡黑色素细胞裂解液抗炎作用,且氯化钙相对于天门冬氨酸螯合钙更能促进乌骨鸡黑色素细胞裂解液抗炎效果的增强,Fe2+的促进作用强于Fe3+。6.建立H2O2诱导HUVEC细胞损伤的模型,观察细胞形态,运用MTT法测定细胞活力,测定不同浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液作用后的细胞培养液中LDH活性、SOD酶活性以及MDA含量。结果表明H2O2致HUVEC细胞达半数死亡的浓度为1 mM,且该浓度下细胞培养液中的LDH活性值最高,以此浓度建立HUVEC细胞损伤的模型。在此基础上的研究结果表明,浓度为0.2-25μg/mL的乌骨鸡黑色素细胞裂解液对HUVEC细胞活性无显着影响,当浓度达到25μg/mL以上时,对HUVEC细胞生长的促进作用较显着（P<0.01）。本文选择1、5、25μg/mL作为乌骨鸡黑色素细胞裂解液的低、中和高浓度进行后续实验。1和5μg/mL的VC对HUVEC细胞活性无显着影响,选用5μg/mL的VC作为对照组,比较乌骨鸡黑色素细胞裂解液和VC对氧化损伤保护作用的强弱。进一步研究结果表明,相对于模型组（1mM H2O2）,高、中浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液能够显着增加HUVEC细胞的存活率（P<0.01）,同浓度的中浓度的VC并未显增加HUVEC细胞的存活率。高、中和低浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液能够显着降低细胞培养液中LDH酶活,增加SOD酶活性（P<0.01）。相对于模型组（1 mM H2O2）,中浓度的VC对细胞培养液中的LDH酶活和SOD酶活都无显着影响。高、低浓度的乌骨鸡黑色素细胞裂解液能够降低细胞中MDA的含量,相比之下,中浓度的VC也能显着降低MDA含量。综上所述,乌骨鸡黑色素细胞裂解液的对氧化损伤的HUVEC细胞的保护作用强于VC。
孙王宏[5]（2019）在《MT-12抑制膀胱癌细胞侵袭转移的分子机制研究》文中研究指明[目的]应用MT-12作用于膀胱癌细胞后,检测细胞侵袭转移相关因子的表达情况,探究MT-12抑制膀胱癌细胞侵袭、转移作用的分子机制。[方法]1、应用不同浓度MT-12对膀胱癌细胞T24和RT4进行处理;再用促瘤剂佛波酯PMA对膀胱癌细胞干预:分为对照组、PMA和PMA+MT-12三组;2、应用明胶酶谱检测不同浓度MT-12及PMA干预下MMP-2和MMP-9在T24和RT4细胞上清液中的活性;3、应用ELISA实验检测不同浓度MT-12及PMA干预下VEGF在T24和RT4细胞上清液中表达情况;4、应用qRT-PCR分别检测转移相关的因子ICAM-1、VCAM-1及VEGF在不同浓度MT-12及PMA干预下的mRNA的表达情况;5、应用Western Blot检测NF-κB及EGFR/PI3K/Akt信号通路中相关分子在MT-12处理下的蛋白表达水平。[结果]1、检测MMP家族的表达变化,结果显示不同浓度MT-12作用后,MMP-9的活性显着下调,MMP-2活性未见明显变化;MT-12能够有效抑制PMA诱导的MMP-9的上调,但对MMP-2的活性无显着影响。2、对膀胱癌细胞中的VEGF进行了检测,ELISA和qRT-PCR结果显示PMA促进了膀胱癌细胞的分泌,而MT-12抑制了 VEGF的表达。3、检测相关的粘附因子ICAM-1和VCAM-1,qRT-PCR结果显示不同浓度MT-12作用后,ICAM-1的表达明显减少,而VCAM-1的表达无影响;PMA明显上调了 ICAM-1的水平,而VCAM-1的水平无变化,MT-12能够抑制ICAM-1的上调,同样对于VCAM-1的表达无影响。4、Western Blot结果显示:MT-12能够抑制磷酸化NF-κB p65的激活,但是并非通过影响EGFR/PI3K/Akt信号通路所实现。[结论]MT-12能够在体外通过NF-κB信号通路抑制膀胱癌侵袭与转移相关因子MMP-9、VEGF、ICAM-1的活性或表达,来达到抑制膀胱癌细胞打开内皮细胞间隙的能力。
韩春辉[6]（2019）在《白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物对人胶质瘤细胞迁移侵袭的影响及作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究白花蛇舌草[Oldenlandia diffusa（Willd.）Roxb.,OD]、半枝莲（Sculellaria barbata,SB）及其药对对人胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响;考察相同药物不同溶剂提取物的作用差异,比较单药和对药的作用差异,比较配伍比例对药对作用的影响;检测分析白花蛇舌草及半枝莲的活性成分;分析两种中药抗胶质瘤细胞迁移、侵袭的药效机制。方法:本实验分为四部分:1.制备OD、SB及OD:SB 1:1、1:2、2:1比例药对提取物,检测提取物对U87细胞存活率的影响及UPLC（Ultra-performance liquid chromatography,超高效液相色谱）分析。在保证提取充分的前提下,固定提取时间、提取溶剂的量两个提取条件,将可能影响药效的影响因素:提取溶剂的种类、单药与药对、药对配伍的比例作为筛查的对象设计提取方案。采用加热回流提取的方法分别用水、40%乙醇、80%乙醇提取OD、SB以及按OD:SB 1:1、1:2、2:1比例配伍的药对,共制备15个提取物。利用MTT法对这15个中药提取物对胶质瘤细胞存活率的抑制作用进行比较筛查,选取药效最优的溶剂提取物及药对配伍比例,用于后续实验。建立UPLC检测方法,比较确定检测波长、流动相、酸等色谱条件,方法建立后对白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物进行UPLC色谱分析,比较单药和药对的色谱图,结合MTT结果进行谱效分析。2.考察OD、SB及其药对提取物对人胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的影响。以MTT法、活死细胞染色、流式细胞术检测0、0.5、1、2、4、8 mg/mL浓度的OD、SB及其药对提取物对人胶质瘤U251和U87细胞存活率及凋亡的影响。根据实验结果选择对细胞存活率无明显影响的浓度作为迁移、侵袭实验的药物工作浓度。以划痕、Transwell实验研究OD、SB及其药对对二维细胞迁移、侵袭的作用。采用微流控芯片细胞三维灌流培养进行三维细胞侵袭实验。3.采用液质联用 UPLC-Q-TOF/MS（Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry,超高效液相色谱-四级杆飞行时间-质谱）方法分析OD和SB提取物的化学成分。4.通过网络药理学的分析方法分析OD、SB抗人胶质瘤可能的活性成分、作用靶点及其作用机制。借助TCMSP等平台收集OD和SB各自含有的化学成分,以及每个成分的药动学参数,保留其中OB（Oral bioavailability,口 服吸收利用度）≥30%、DL（Drug likeness,药物相似性）≥ 0.18的化合物,作为筛选出来的有效成分。在TCMSP平台上进一步查找OD、SB有效成分的作用靶点;通过OMIM、TTD、GAD等数据库查找人胶质瘤相关治疗靶点,在Cytoscape平台上分别合成中药成分-作用靶点、疾病-相关治疗靶点网络关系图,在此基础上采用Cytoscape的Bisogenet或STRING数据库分析药物靶点与疾病靶点蛋白质相互作用（PPI）关系。STRING平台的分析结果包含了GO注释分析及KEGG通路分析。以Cytoscape作图则将相互作用的蛋白上传至DAVID数据库,得到类似分析结果。从中筛选出白OD、SB抗胶质瘤细胞迁移、侵袭的相关通路,解释其作用机制。结果:1.15个提取物的MTT实验结果显示:三种溶剂提取物对U87细胞增殖活力的抑制作用为:80%乙醇提取物>40%乙醇提取物>水提物;在三个药对配比中1:2药对作用最优。比较单药与对药的UPLC图谱,未发现明显的新成分吸收峰,但共有峰的信号强度各样品之间相差较大。与其他两个配比药对的图谱比较,1:2药对的共有峰信号强度最高,即成分含量相对较高,这与MTT实验中1:2药对作用优于其他药对的结果一致。据此,选择两味单药及其1:2配伍药对的80%乙醇提取物作为后续研究对象。2.MTT实验、活死细胞染色及流式凋亡实验证明,OD、SB及其1:2药对提取物对人恶性胶质瘤U87和U251细胞具有明显的降低细胞存活率及促凋亡作用（p<0.05）,且均与药物浓度正相关。在≤2 mg/mL的低浓度水平,提取物对细胞存活率的影响不明显,因此我们选择OD、SB及其药对提取物≤2 mg/mL的浓度水平作为迁移、侵袭实验的药物浓度。划痕愈伤及Transwell实验证明在0.5、1、2 mg/mL浓度下,OD、SB及其药对提取物能够明显抑制人胶质瘤细胞的迁移能力,1:2药对能够在Transwell侵袭实验中显着抑制细胞的侵袭能力,在2 mg/mL浓度下,OD、SB能够抑制U87及U251细胞的侵袭（p<0.05）。微流控芯片细胞三维灌流培养侵袭实验结果显示OD、SB及其1:2配伍药对能够抑制人胶质瘤三维培养细胞的侵袭能力。3.以UPLC-Q-TOF/MS法检测表征OD、SB80%乙醇提取物,在正离子模式下,OD提取物检测出35个化合物,SB提取物检测出42个化合物,这些成分中包含了部分OD、SB抗胶质瘤迁移、侵袭的活性成分。4.采用网络药理学的方法分析OD、SB抗人胶质瘤迁移、侵袭的有效成分、作用靶点和相关机制。在TCMSP等平台收集中药成分,并根据OB、DL参数进行活性筛选,OD的38个组分中有24个符合要求,从SB的94个化学成分中筛选出29个活性成分,在此基础上整理了每个活性成分对应的作用靶点,通过检索多个疾病靶点数据库,挖掘整理了的72个人胶质瘤的疾病相关靶点,将数据输入Cytoscape平台,分别构建中药成分-靶点网络图、疾病-靶点网络图,然后分别与OD、SB的活性成分靶点构建两味中药的成分靶点-人胶质瘤疾病靶点蛋白质相互作用关系PPI网络图。将PPI网络图中的节点蛋白进行GO注释分析及KEGG通路分析,结果显示OD可能通过参与MAPK通路、Wnt信号通路及微管细胞骨架的调节抑制人胶质瘤细胞的迁移和侵袭;其降低胶质瘤细胞存活率、促凋亡的作用与参与调控细胞周期阻滞及细胞增殖负性调控、对内源性凋亡通路及促凋亡过程的干预以及P53经典调节相关。SB抗人胶质瘤细胞迁移侵袭作用机制可能与其对黏着斑、VEGF、MAPK信号通路的调控相关;此外半枝莲参与了PI3K-Akt、Jak-STAT、p53、Ras等信号通路及细胞周期的调节,这些生物学行为与SB降低胶质瘤细胞存活率、促凋亡作用有关。结论:中药OD和SB及其药对80%乙醇提取物对人胶质瘤细胞具有明显的抑制迁移、侵袭作用,并具有浓度相关的抑制细胞存活率、促凋亡活性。药对与单药的UPLC图谱比较没有发现明显的新物质吸收峰,说明药对的作用应是两味中药药效加和的结果。网络药理学研究显示OD对人胶质瘤细胞迁移侵袭的抑制作用可能与其对Wnt、MAPK通路及微管细胞骨架的调节有关,SB的抗人胶质瘤细胞迁移、侵袭的作用可能与其对黏着斑、VEGF、MAPK信号通路的调控相关。研究结果提示,OD、SB及其药对在本实验中表现出来的生物活性可能对人恶性胶质瘤的迁移侵袭与复发的治疗提供新的用药依据。
郭云泉[7]（2017）在《缝隙连接蛋白在肝细胞癌中的异常表达对肝癌进展的影响及其机理研究》文中认为目的:连接蛋白（connexin,Cx）及其形成的缝隙连接（gap junction,GJ）的表达和功能异常与肿瘤的发生、发展密切相关,一般认为Cx/GJ是肿瘤的抑制因子和潜在的治疗靶点。但是关于Cx/GJ在人原发性肝细胞肝癌中表达和作用还不清楚,不同的研究结果存在争议,本课题深入研究了人肝脏细胞主要表达的Cx32,Cx43,Cx26在人肝细胞癌中的表达情况,并分析了上述Cx的表达与肝癌临床进展之间的关系;旨在了解Cx/GJ在肝癌不同发展阶段之中表达分布规律,初步阐明Gx/GJ在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制;为Cx/GJ/作为防治肝癌新分子靶点的价值和意义提供关键证据。方法:1.收集97例肝细胞癌手术患者的新鲜组织和石蜡包埋组织标本（包括肝癌组织,对应癌旁组织,远端正常组织）,具有完整病历资料和预后随访信息;2.免疫组织化学检测石蜡包埋的肝癌组织、癌旁组织、远端正常肝组织标本中Cx26,Cx32,Cx43的蛋白定位、分布情况;3.应用Western Blot和RT-qPCR分别检测新鲜冻存的肝癌组织和癌旁组织、远端正常肝组织标本中Cx32,Cx43,Cx26的蛋白和mRNA表达水平;4.用Chi-Square test和Person列联系数分析Cx32的表达与人肝细胞癌临床病理诸因素（如临床分期,组织分化,肿瘤最大径等）的关系;5.Kaplan-Meier method,log-rank test和多因素Cox回归模型筛选分析Cx异常表达与肝癌预后的关系;6.用免疫组织化学和western Blot方法检测肝癌组织中Cx32蛋白与EGFR信号传递通路上EGFR蛋白及其下游mTOR、ERk、Stat3蛋白表达的相关性。结果:1.免疫组织化学染色显示肝癌组织和癌旁组织及远端正常肝组织中Cx32,Cx43,Cx26的蛋白表达均存在差异,Cx32在癌组织中表达显着增加,主要分布于细胞质,常见核旁聚集现象,Cx32在癌旁组织和远端正常肝组织也见表达,但主要分布于细胞膜上,少量在胞浆中,Cx26表达在癌组织和癌旁组织及远端正常肝组织中未见明显差异,分布于细胞膜及细胞质中。Cx43在癌组织中的表达量减少或呈阴性,主要分布于细胞质中,Cx43在癌旁组织及远端正常肝组织中分布于细胞膜及细胞质中,以膜分布为主;2.96例新鲜肝癌组织,癌旁组织,远端正常肝组织Western blot和RT-qPCR分别检测Cx的蛋白、m RNA的表达水平。（1）在肝癌组织,癌旁组织和远端正常肝组织中,Cx32蛋白的表达量分别为4.6014±0.2388、1.1433±0.1006和1.0583±0.0693,与癌旁组织及远端正常肝组织相比,Cx32蛋白的表达量在肝癌组织明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;Cx32的m RNA表达水平分别为0.8356±0.1255、0.7779±0.1573和0.7754±0.0931,无明显差异。（2）在肝癌组织,癌旁组织和远端正常肝组织中,Cx43蛋白的表达量分别为0.6303±0.0714、1.3152±0.1456和1.5458±0.1792;与癌旁组织及远端正常肝组织相比,Cx43蛋白的表达量在肝癌组织明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;Cx43的m RNA表达水平分别为1.0772±0.1216、1.1693±0.1317和1.0887±0.1260,也无显着差异;（3）Cx26蛋白表达量在肝癌组织,癌旁组织和远端正常肝组织中分别为1.5203±0.1126、1.4200±0.1212和1.4200±0.1212,Cx26无显着差异;Cx26的mRNA表达水平分别为0.6325±0.0873、0.6983±0.0731和0.6884±0.0584,也无显着差异;3.Cx32异常表达的临床意义,Cx32蛋白表达水平与肝癌的病理组织分级（P<0.05,r=0.488）、临床TNM分期（P<0.05,r=0.373）均呈正相关;4.细胞质高表达Cx32的肝癌患者预后差,术后总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（recurrence free survival,RFS）比细胞质低表达Cx32的患者短（OS,P=0.000;RFS,P=0.172）。多因素Cox回归生存分析中显示,Cx32表达高低,肿瘤分化程度（病理分级）是肝细胞癌患者术后生存时间的独立的预后评估因素。5.通过免疫组化染色和western bolt方法发现,细胞质内Cx32高表达伴发EGFR表达增加,同时EGFR信号通路的下游蛋白mTOR蛋白表达也增加。结论:1.在人肝细胞癌组织中Cx32表达量增高,主要分布于胞浆中,膜上的分布减少;Cx43在肝癌组织的表达明显减少,主要分布于细胞膜;Cx26的表达量在肝癌组织中的表达不变,主要定位于细胞膜上和细胞质中;肝癌组织的细胞缝隙连接（GJ）减少或消失。2.Cx32在细胞质内表达水平与肝细胞癌的病理分级（组织分化程度）,临床TNM分期呈正相关。3.Cx32在肝癌细胞的表达分布异常提示肝细胞癌患者预后差,因此,Cx32蛋白异常表达高低,可以作为肝癌患者术后生存率评估的独立预后因素之一。4.肝癌细胞Cx32表达增加并聚集在胞浆内,可能通过增加EGFR表达,激活EFGR信号通路,进而发挥促癌细胞增殖和抗癌细胞凋亡作用。
秦萍[8]（2016）在《金龙胆草总皂苷的抗肿瘤活性研究》文中认为天然抗癌植物性药物以其毒副作用小、生物活性强和不易产生耐药性等优点逐渐成为人们研究的焦点。金龙胆草（Conyza blinii H.Lev.）为菊科白酒草属植物苦蒿的干燥地上部分,分布于我国云南、四川等省。具有清热解毒、消炎祛痰、止咳平喘之功效,用于治疗胃肠炎、慢性气管炎。金龙胆草总皂苷（Conyza blinii saponin,CBS）成分主要为三萜皂苷,生物类皂苷属植物次级代谢产物。大量的流行病学调查、动物实验及体外实验研究结果表明:皂苷有多成分,多途径,多机制的抗肿瘤作用。为了研究金龙胆草总皂苷的抗肿瘤活性及其作用机制,本文先通过MTT检测金龙胆草总皂苷对多种肿瘤细胞活力的影响。结果表明,金龙胆草总皂苷有广谱的抗肿瘤作用,对多种癌细胞具有体外抑制作用。其中,CBS对宫颈癌HeLa细胞最为敏感,其24 h的体外IC50为19.4 μg/mL。然后以HeLa细胞为研究对象,通过DAPI染色、DNA Ladder、细胞流式、半定量PCR、划痕实验、Transwell实验、蛋白免疫印迹法（Western blotting）等实验分别检测金龙胆草总皂苷对HeLa细胞的凋亡、细胞周期、迁移和侵袭的影响。研究结果表明,CBS可以将细胞周期阻滞在S期,诱导细胞凋亡的发生,抑制细胞的迁移和侵袭。进一步研究表明,CBS通过活化caspase-9,进而激活caspase-3,促使HeLa细胞通过线粒体途径凋亡。半定量PCR实验表明CBS能上调p53基因mRNA水平,并能上调周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase,CDK）抑制因子 p21、p27 和 p57 的 mRNA 水平。综上所述,金龙胆草总皂苷可以通过线粒体途径引起HeLa细胞凋亡,影响细胞周期,并能抑制细胞的增殖和迁移。毒性实验表明CBS对正常的细胞毒性相对较小,这将为金龙胆草总皂苷开发作为抗肿瘤药物的研究奠定了理论和物质基础。
谢红燕[9]（2015）在《糖氧剥夺/复氧复糖下大鼠星形胶质细胞Cx43的变化及其机制》文中研究指明背景：神经血管单元包括神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞，这强调了其作为一个整体维持脑正常功能的重要性。星形胶质细胞作为维持神经血管单元功能的关键环节，广泛存在着由缝隙连接蛋白43（connexin43, Cx43）构成的缝隙连接通道，它形成细胞间重要的信息传递通路。缺血性脑卒中是由于脑血流中断破坏局部脑组织的能量供给，导致神经血管单元功能障碍，此时Cx43必然发生相应的变化。Cx43在其生命周期中受多种因素的调节，其向细胞内转运及降解的途径不甚清晰。而且Cx43作为胞膜蛋白，向细胞质内的转运是否与胞吞作用有关尚不明确。Cx43在合成过程中是借助微管运输系统被转运到细胞膜上的，那么它向细胞质内的转运是否也与微管运输有关有待于进一步研究。细胞内蛋白的降解主要通过自噬溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统途径完成，Cx43向细胞质内的转运可以被脑缺血激活，通过活化蛋白激酶信号通路，改变磷酸化状态，最终使其发生降解，影响缝隙连接胞间通讯的功能，但具体机制目前并不明确，这也成为该领域的研究热点。目的：观察大鼠星形胶质细胞Cx43在糖氧剥夺/复氧复糖（ischemia/reperfusion;oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; I/R）条件下数量和质量方面的变化规律，并进一步探讨其变化的机制。方法：采用连续传代法体外纯化培养大鼠星形胶质细胞，通过调节培养箱参数及更换无糖培养液建立其I/R模型。糖氧剥夺2h后，分别复氧复糖0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、72h，采用Western blotting方法对Cx43进行定量分析，通过Western blotting及RT-PCR方法分析EB1在蛋白和基因表达量方面的变化。使用MTT比色法选择细胞损伤最重的时间点，设立正常培养组、I/R Saline对照组、I/R甘珀酸干预组，采用激光共聚焦显微镜观察Cx43分布的变化；dynasore阻断胞吞作用后，再次于激光共聚焦显微镜下观察Cx43的分布变化。同时，设立正常培养组、I/R组、I/R TPA组、I/R MG132组、I/R TPA+MG132组，采用Westernblotting方法对p-Cx43（Ser368）、p-ERK1/2、Beclin1蛋白进行定量分析。结果：（1）成功建立了星形胶质细胞纯化体系及其糖氧剥夺/复氧复糖模型。（2）Western blotting结果提示I/R后各个时间点的Cx43总量并未发生改变（P>0.05）。（3）MTT法提示I/R后6h细胞受到的损伤最严重，此时使用激光共聚焦显微镜观察发现Cx43发生了内在化，即细胞膜上分布减少，而细胞质内分布增多（P<0.05）。（4）甘珀酸阻断缝隙连接后，并不影响Cx43的表达量（P<0.05）。（5）Dynasore可以部分性抑制Cx43的内在化，较对照组相比，Cx43的内在化减少了29.2%（P<0.05）。（6）EB1的蛋白和基因相对表达量在各组间无明显差异（P>0.05）。（7）I/R6h后：p-Cx43（Ser368）较正常培养组减少（P<0.01）；TPA长时间影响PKC活性，出现p-ERK1/2、Beclin1表达水平降低，p-Cx43（Ser368）表达水平增加（P<0.01）；MG132作为蛋白酶体抑制剂，使得p-Cx43、p-ERK1/2、Beclin1表达量均增加（P<0.01）。结论：（1）成功建立了大鼠星形胶质细胞纯化体系及糖氧剥夺/复氧复糖模型。（2）糖氧剥夺/复氧复糖后，Cx43的总量并未发生变化，只是发生了向细胞内的转移即内在化。（3）Cx43的内在化过程与胞吞作用有关，与微管运输无关。（4）糖氧剥夺/复氧复糖后，Cx43通过ERK1/2途径发生Ser368位点的磷酸化，并经溶酶体途径降解。（5）Cx43的降解过程与泛素-蛋白酶体途径有关。
刘伟杰[10]（2014）在《皂角刺对肺癌的防治作用及其机制初步探讨》文中指出肺癌是一种对生命和人类健康威胁最大的恶性肿瘤，在我国的发病率占恶性肿瘤的首位，并逐年增加，因此对肺癌的预防和治疗作用的研究具有重要的意义。目前治疗肺癌大多采用化学药物，但在治疗过程中存在毒副作用和多药耐药性等治疗缺陷。中医药在治疗肿瘤方面有毒副作用小、能提高患者的生活质量，并且长期用药费用低等优势赢得了患者的认可，也成为开发新型抗肿瘤药物的重要源泉，因此筛选中医药抗肿瘤药物成为药理学领域研究的热点。皂角刺总黄酮是从豆科植物皂荚的干燥棘刺中提取得到的一类黄酮类化合物，各项探索结论已经证明了多种肿瘤细胞增殖能够显着地被皂角刺总黄酮所抑制。本课题探讨的目的是考察皂角刺总黄酮对肺癌细胞及肺癌模型的预防作用和治疗作用，并探讨其可能隐含的新机制。本课题体外实验采用MTT法，检测不同浓度的皂角刺总黄酮对小鼠肺癌细胞（Lewis）、小鼠胚肺成纤维细胞（L929）、小鼠脾淋巴细胞增值、小鼠脾淋巴细胞转化效应细胞及细胞黏附的影响，并用划痕标记染料示踪技术观察细胞间隙连接通讯功能；体内实验采用Lewis肺癌小鼠皮下移植模型、Lewis肺癌小鼠实验性肺癌转移模型和乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型，评价皂角刺总黄酮对Lewis肺癌模型的预防和治疗作用。通过对实验小鼠的外观、体温、生存期和自主活动观察，评价实验小鼠的中医学体征的变化；通过肺组织HE染色法，观察肺癌组织病理学变化；通过检测血清指标：层粘连蛋白（LN）、血小板活化因子（PAF）、酪氨酸激酶B（TrkB）、酪氨酸激酶受体（TrkA）、小鼠免疫球蛋白G（IgG）的含量变化，评价皂角刺总黄酮对实验小鼠血清的影响；通过免疫组化法，观察皂角刺总黄酮对Cx43表达的影响，验证其抗肺癌的机制。体外实验结果显示：皂角刺总黄酮呈剂量相关性地抑制Lewis肺癌细胞增殖（IC50=146μg/ml），但对L929胚肺成纤维细胞增殖无显着影响。皂角刺总黄酮对细胞增殖影响较小的剂量可降低Lewis肺癌细胞粘附，并呈剂量相关性促进Lewis肺癌细胞间连接通讯，但对L929胚肺成纤维细胞粘附无影响。同时能提高体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖率及脾淋巴细胞的杀伤力。体内实验结果显示：与未治疗的Lewis肺癌皮下移植模型和Lewis肺癌实验性肺癌转移模型比较，皂角刺总黄酮高剂量和低剂量均可减缓肿瘤生长速度、阻止肿瘤转移、延长荷瘤小鼠存活时间。未注射乌拉坦的小鼠实验结束时肺部均无肿瘤发生，注射乌拉坦的模型小鼠肺部有数目和大小不等的肿瘤结节，皂角刺总黄酮高剂量组和低剂量组小鼠肺部肿瘤结节明显减少，部分小鼠未见肿瘤发生。与治疗组比较模型组小鼠体温下降、蜷缩少动；血清中LN、PAF、TrkB、TrkA水平升高，IgG含量降低。病理及免疫组化结果显示：与模型组的肺癌组织比较，皂角刺总黄酮高剂量组和低剂量组均能改善肺组织病理变化；而注射乌拉坦的模型小鼠肺部Cx43免疫组化显色密度明显降低，皂角刺总黄酮高剂量组和低剂量组均能增强致癌小鼠肺部的Cx43免疫组化显色密度。综上所述，皂角刺总黄酮对肺癌有确切的预防和治疗作用，其机制是增加免疫功能，增强细胞间连接通讯，恢复细胞间连接通讯的正常化，从而能阻止肿瘤生长和转移。
二、佛波酯对细胞间隙连接通讯的影响及其作用机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、佛波酯对细胞间隙连接通讯的影响及其作用机制（论文提纲范文）
（1）基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 巨噬细胞极化与肠黏膜屏障的相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 UC患者巨噬细胞亚群变化的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1 UC患者巨噬细胞极化特点 |
| 2 巨噬细胞极化对炎症因子的影响 |
| 3 巨噬细胞极化对肠黏膜屏障损伤的影响 |
| 4 β-catenin/ FOSL2/ARID5A通路对巨噬细胞极化的调控 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制研究 |
| 前言 |
| 第一章 在体实验研究 |
| 第一节 加味葛根芩连汤干预DSS诱导结肠炎模型的疗效观察 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 DSS诱导结肠炎疾病模型的构建与特点 |
| 2 加味葛根芩连汤对肠道炎症状态的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤对肠黏膜通透性的影响 |
| 4 加味葛根芩连汤的组方思路与特色 |
| 小结 |
| 第二节 加味葛根芩连汤对DSS诱导结肠炎巨噬细胞极化的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 1 加味葛根芩连汤对巨噬细胞极化的调控 |
| 2 加味葛根芩连汤对肠黏膜屏障的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤对β-catenin/FOSL2/ARID5A通路的调控 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 离体实验研究 加味葛根芩连汤含药血清对THP-1巨噬细胞极化的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 1 体外巨噬细胞极化模型的构建 |
| 2 加味葛根芩连汤含药血清对细胞活力的影响 |
| 3 加味葛根芩连汤含药血清对THP-1细胞IL-1β分泌的影响 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 蜂毒和蜂毒肽研究进展 |
| 1.1 蜂毒肽(melittin,MEL)简述 |
| 1.2 MEL及其偶联物研究现状 |
| 2 宫颈癌及其免疫治疗的研究进展 |
| 2.1 宫颈癌简述 |
| 2.2 宫颈癌发病机制 |
| 2.3 宫颈癌的肿瘤局部免疫细胞亚群及肿瘤微环境改变 |
| 3 Eph A2 基因研究进展 |
| 3.1 Eph受体简述 |
| 3.2 EphA2 在癌症中的功能 |
| 4 PD-L1-PD-1 免疫检查点研究进展 |
| 4.1 PD-L1-PD-1 免疫检查点的基础生物学 |
| 4.2 在癌症中调控PD-L1 表达的具体分子机制 |
| 4.3 抗PD-L1-PD-1 治疗的前景和局限性 |
| 第2章 新型融合肽UM-6 抗宫颈癌进展及其作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UM-6 抑制宫颈癌细胞的增殖 |
| 3.2 UM-6 抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移 |
| 3.3 UM-6 抑制宫颈癌细胞HPV E6/7 的蛋白表达 |
| 3.4 UM-6 抑制EphA2 Ser897 磷酸化和其与AKT的相互作用 |
| 3.5 UM-6 促进EphA2 向溶酶体的转运和降解 |
| 3.6 UM-6 介导的 EphA2 溶酶体的降解依赖于AKT介导的 EphA2 Ser897 磷酸化 |
| 3.7 UM-6 在体内抑制宫颈移植瘤的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第3章 新型融合肽UM-6 改善宫颈癌免疫微环境及作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UM-6 恢复宿主对肿瘤的免疫,增加了CTL活性 |
| 3.2 EphA2与PD-L1 在宫颈癌中呈正相关并调控PD-L1 的表达 |
| 3.3 EphA2和PD-L1 在宫颈癌中高表达,而这两种蛋白在宫颈癌中有高度相关性 |
| 3.4 UM-6 能够抑制PD-L1 糖基化 |
| 3.5 UM-6 能够抑制PD-L1的ER-Golgi易位 |
| 3.6 UM-6 可能通过内质网相关性降解(ERAD)途径下调PD-L1 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所获得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）乌骨鸡黑色素含量测定及黑色素细胞裂解液活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑色素的简介 |
| 1.2 黑色素的合成 |
| 1.3 黑色素结构 |
| 1.3.1 红外光谱(Infrared spectra analysis,IR) |
| 1.3.2 质谱(Mass spectrum,MS) |
| 1.3.3 热解-气相色谱-质谱(Py-GC-MS) |
| 1.3.4 电子顺磁共振(Electron paramagnetic resonance,EPR) |
| 1.3.5 紫外光谱(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV) |
| 1.4 黑色素的测定方法 |
| 1.4.1 称重法 |
| 1.4.2 紫外分光光度法 |
| 1.4.3 高效液相法测定黑色素含量 |
| 1.4.4 荧光分析法 |
| 1.5 乌骨鸡黑色素研究进展 |
| 1.5.1 乌骨鸡黑色素的简介 |
| 1.5.2 乌骨鸡黑色素的结构与理化特性 |
| 1.5.3 乌骨鸡黑色素的沉积 |
| 1.5.4 乌骨鸡黑色素的生理功能 |
| 1.6 乌骨鸡黑色素的测定 |
| 1.7 炎症 |
| 1.7.1 炎症简介 |
| 1.7.2 脂多糖(LPS)诱导炎症的进展 |
| 1.7.3 炎症介质 |
| 1.7.4 常用炎症模型 |
| 1.8 氧化应激 |
| 1.9 血管内皮细胞 |
| 1.10 氧化应激对内皮细胞功能的损伤 |
| 1.10.1 对内皮细胞通透性的改变 |
| 1.10.2 氧化应激对内皮依赖性血管收缩舒张功能的影响 |
| 1.11 黑色素细胞的生成以及生理功能 |
| 1.11.1 黑色素细胞的生成 |
| 1.11.2 黑色素细胞生理功能 |
| 1.12 主要研究内容 |
| 1.13 本研究的创新性 |
| 第2章 H_2O_2 氧化-荧光分析法测定乌骨鸡中黑色素含量的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验试剂以及溶液配制方法 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乌骨鸡黑色素工作标准品的制备 |
| 2.3.2 乌骨鸡黑色素激发波长和发射波长的测定 |
| 2.3.3 建立标准曲线 |
| 2.3.4 过氧化氢浓度对氧化反应的影响 |
| 2.3.5 氧化温度对氧化反应的影响 |
| 2.3.6 氧化时间对氧化反应的影响 |
| 2.3.7 Na OH浓度对氧化反应的影响 |
| 2.3.8 样品超声温度对氧化反应的影响 |
| 2.3.9 样品超声时间对氧化反应的影响 |
| 2.3.10 乌骨鸡黑色素的测定 |
| 2.3.11 方法检出限的测定与计算 |
| 2.3.12 数据统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 乌骨鸡黑色素激发波长和发射波长 |
| 2.4.2 过氧化氢浓度对氧化反应的影响 |
| 2.4.3 氧化温度对氧化反应的影响 |
| 2.4.4 氧化时间对氧化反应的影响 |
| 2.4.5 乌骨鸡样品前处理条件对黑色素氧化反应的影响 |
| 2.4.6 线性回归分析及检测限 |
| 2.4.7 稳定性和精密度 |
| 2.4.8 加标回收实验 |
| 2.4.9 乌骨鸡黑色素含量分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 H_2O_2氧化-荧光分析法测定乌骨鸡黑色素细胞中黑色素含量的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验试剂以及溶液配制方法 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 MTT法测定细胞活性 |
| 3.3.3 标准曲线制作 |
| 3.3.4 乌骨鸡黑色素激发波长和发射波长的测定 |
| 3.3.5 过氧化氢浓度对氧化反应的影响 |
| 3.3.6 时间对氧化反应的影响 |
| 3.3.7 细胞中黑色素的测定 |
| 3.3.8 方法检出限的测定与计算 |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乌骨鸡黑色素细胞形态 |
| 3.4.2 乌骨鸡黑色素激发波长和发射波长 |
| 3.4.3 过氧化氢浓度对氧化反应的影响 |
| 3.4.4 氧化时间对氧化反应的影响 |
| 3.4.5 线性回归分析及检测限 |
| 3.4.6 精密度和重复性 |
| 3.4.7 加标回收实验 |
| 3.4.8 IBMX对乌骨鸡黑色素细胞增殖的影响 |
| 3.4.9 IBMX对乌骨鸡黑色素细胞合成黑色素的含量的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 BMCL对 LPS诱导的RAW264.7 细胞抗炎作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验试剂以及溶液配制方法 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RAW264.7 细胞的培养 |
| 4.3.2 乌骨鸡黑色素细胞的培养以及BMCL的制备 |
| 4.3.3 实验分组 |
| 4.3.4 MTT法 |
| 4.3.5 测定RAW264.7 细胞中的NO生成量 |
| 4.3.6 不同模式下的BMCL对于RAW264.7 的NO生成量的影响 |
| 4.3.7 不同作用时间下BMCL对于RAW264.7的NO生成量的影响 |
| 4.3.8 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 BMCL对 RAW264.7 细胞毒性的评价 |
| 4.4.2 LPS对 RAW264.7 细胞毒性的影响 |
| 4.4.3 LPS对 RAW264.7 细胞NO生成量的影响 |
| 4.4.4 倒置显微镜观察不同浓度LPS对 RAW264.7 细胞形态的影响 |
| 4.4.5 不同作用模式下BMCL对细胞NO生成量的影响 |
| 4.4.6 不同作用时间下BMCL对于RAW264.7的NO生成量的影响 |
| 4.4.7 倒置显微镜观察BMCL对 RAW264.7 细胞形态的影响 |
| 4.4.8 钙、铁元素作用的BMCL对 RAW264.7 细胞NO生成量的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 BMCL对 H_2O_2 诱导的内皮细胞损伤的保护作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 实验试剂以及溶液配制方法 |
| 5.2.3 仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 HUVEC细胞的培养 |
| 5.3.2 乌骨鸡黑色素细胞的培养 |
| 5.3.3 BMCL的提取 |
| 5.3.4 实验分组 |
| 5.3.5 MTT法 |
| 5.3.6 LDH活性测定 |
| 5.3.7 MDA含量测定 |
| 5.3.8 SOD酶活性测定 |
| 5.3.9 统计学分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 H_2O_2对HUVEC细胞形态的影响 |
| 5.4.2 H_2O_2对HUVEC细胞生长的影响 |
| 5.4.3 H_2O_2对HUVEC细胞LDH活性的影响 |
| 5.4.4 BMCL和 VC对内皮细胞增殖的影响 |
| 5.4.5 BMCL对氧化损伤的HUVEC细胞损伤的保护作用 |
| 5.4.6 BMCL对氧化损伤的HUVEC细胞培养液中LDH活性的影响 |
| 5.4.7 BMCL对氧化损伤的HUVEC细胞形态的影响 |
| 5.4.8 BMCL对氧化损伤的HUVEC细胞SOD酶活性的影响 |
| 5.4.9 BMCL对氧化损伤的HUVEC细胞培养液中MDA含量的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 进一步研究方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）MT-12抑制膀胱癌细胞侵袭转移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物对人胶质瘤细胞迁移侵袭的影响及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物的制备、提取物对胶质瘤细胞存活率作用的筛查及UPLC分析 |
| 一、材料 |
| 1.中药材 |
| 2.细胞来源 |
| 3.主要试剂及仪器 |
| 4.主要试剂的配制 |
| 二、方法 |
| 1 提取物的制备 |
| 2 细胞培养 |
| 3 MTT实验检测提取物抗胶质瘤细胞作用 |
| 4 UHPLC色谱分析方法的建立及中药提取物色谱分析 |
| 5 统计方法 |
| 结果 |
| 1.中药提取物制备 |
| 2.中药提取物对胶质瘤细胞增殖活力的影响 |
| 3.中药提取物的UPLC图谱 |
| 4.单药与对药的UPLC图谱比较 |
| 5.谱效分析 |
| 讨论 |
| 第二部分 白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物对人恶性胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响 |
| 一.材料 |
| 1.主要仪器及试剂 |
| 2.主要试剂的配制 |
| 二.方法 |
| 1 MTT法检测细胞增殖活力 |
| 2 活死细胞染色法检测细胞存活率 |
| 3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 4 划痕愈伤实验检测细胞迁移能力 |
| 5 Transwell迁移实验 |
| 6 Transwell侵袭实验 |
| 7 微流控芯片细胞三维灌流培养侵袭实验 |
| 结果 |
| 1.中药提取物抑制U25 细胞增殖 |
| 2.中药提取物降低人胶质瘤细胞存活率 |
| 3.中药提取物促进人胶质瘤细胞凋亡 |
| 4.划痕愈伤实验中药提取物抑制人胶质瘤细胞迁移 |
| 5.Transwell迁移实验中药抑制人胶质瘤细胞迁移 |
| 6.Transwell侵袭实验中药抑制人胶质瘤细胞侵袭 |
| 7.中药提取物抑制三维培养人胶质瘤细胞的侵袭能力 |
| 讨论 |
| 第三部分 UPLC-Q-TOF/MS色谱分析白花蛇舌草、半枝莲提取物的化学成分 |
| 一.材料 |
| 1 主要仪器及试剂 |
| 2 主要试剂的配制 |
| 二.方法 |
| 1 建立白花蛇舌草、半枝莲化学成分数据库 |
| 2 色谱条件 |
| 3 质谱条件 |
| 4 数据分析 |
| 结果 |
| 1.白花蛇舌草80%乙醇提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析结果 |
| 2.半枝莲80%乙醇提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 基于网络药理学分析白花蛇舌草、半枝莲抗胶质瘤迁移、侵袭作用机制 |
| 一.材料 |
| 二.方法 |
| 1 白花蛇舌草、半枝莲活性成分的筛选 |
| 2 中药成分靶点的收集及活性成分-靶点网络的构建 |
| 3 人胶质瘤疾病靶点的收集与疾病-靶点网络构建 |
| 4 药物成分靶点-疾病靶点蛋白质相互作用数据库及网络构建 |
| 5 GO注释分析及KEGG通路分析 |
| 结果 |
| 1.白花蛇舌草活性成分数据库及成分-靶点关系 |
| 2.人胶质瘤疾病相关靶点 |
| 3.白花蛇舌草成分靶点-人胶质瘤疾病靶点蛋白质相互作用关系 |
| 4.白花蛇舌草抗人胶质瘤迁移侵袭相关通路 |
| 5.半枝莲活性成分数据库及成分-靶点关系 |
| 6.半枝莲成分靶点-疾病靶点蛋白质相互作用关系 |
| 7.半枝莲抗胶质瘤迁移侵袭的相关通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间申请的专利及获奖情况 |
| 致谢 |
（7）缝隙连接蛋白在肝细胞癌中的异常表达对肝癌进展的影响及其机理研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 连接蛋白 32、43、26 在人肝细胞癌组织中表达及临床意义 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 原发性肝细胞癌术后患者预后因素的Cox模型分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 生存分析有关概念 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 原发性肝细胞癌中Cx32蛋白异常表达与EGFR信号通路的相关性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 缝隙连接与肝细胞癌的相关性研究 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）金龙胆草总皂苷的抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 金龙胆草 |
| 1.1.1 金龙胆草的来源和性质 |
| 1.1.2 金龙胆草的植物形态 |
| 1.2 金龙胆草的化学成分研究 |
| 1.3 金龙胆草药理作用研究 |
| 1.4 三萜皂苷的应用研究 |
| 1.5 五环三萜皂苷的药理作用研究进展 |
| 1.6 细胞凋亡 |
| 1.6.1 细胞凋亡的形态学特征 |
| 1.6.2 细胞凋亡的生化变化 |
| 1.6.3 Caspase家族在细胞凋亡过程中的作用 |
| 1.7 本课题的研究内容和研究意义 |
| 1.7.1 本课题的研究意义 |
| 1.7.2 本课题的研究内容 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 金龙胆草总皂苷 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 PCR引物 |
| 2.1.6 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 收集蛋白样品 |
| 2.2.3 蛋白免疫印迹技术 |
| 2.2.4 细胞基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 细胞mRNA的提取 |
| 2.2.6 mRNA反转录为cDNA的方法 |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 细胞增殖检测方法 |
| 2.2.9 细胞凋亡检测方法 |
| 2.2.9.1 蛋白免疫印迹技术检测细胞凋亡 |
| 2.2.9.2 DAPI染色检测细胞凋亡 |
| 2.2.9.3 DNA Ladder法检测细胞凋广 |
| 2.2.9.4 Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡 |
| 2.2.10 细胞周期检测方法 |
| 2.2.10.1 蛋白免疫印迹技术检测细胞周期 |
| 2.2.10.2 PI单染色法检测细胞周期 |
| 2.2.11 细胞划痕实验 |
| 2.2.12 Transwell小室实验 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 金龙胆草总皂苷对多种细胞活力的影响 |
| 3.1.1 金龙胆草总皂苷对多种肿瘤细胞活力的影响 |
| 3.1.2 金龙胆草总皂苷对细胞活力的选择性影响 |
| 3.2 金龙胆草总皂苷对不同肿瘤细胞形态的影响 |
| 3.3 克隆形成实验检测细胞增殖 |
| 3.4 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞凋亡的影响 |
| 3.4.1 DAPI染色观察金龙胆草总皂苷对HeLa细胞凋亡的影响 |
| 3.4.2 DNA Ladder检测金龙胆草总皂苷对HeLa细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 Annexin V/PI双染检测金龙胆草总皂苷对HeLa细胞凋亡的影响 |
| 3.4.4 蛋白免疫印迹法检测金龙胆草总皂苷对HeLa细胞凋亡的影响 |
| 3.5 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞周期的影响 |
| 3.5.1 流式细胞术检测金龙胆草总皂苷对HeLa细胞周期的影响 |
| 3.5.2 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞周期相关基因的影响 |
| 3.5.3 金龙胆草总皂苷对CIP/KIP家族的影响 |
| 3.5.3.1 金龙胆草总皂苷对CI/KIP家族的mRNA表达水平影响 |
| 3.5.3.2 金龙胆草总皂苷对p21、p27蛋白水平影响 |
| 3.6 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞迁移、侵袭影响 |
| 3.6.1 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞迁移的影响 |
| 3.6.2 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞侵袭的影响 |
| 3.6.3 金龙胆草总皂苷对HeLa细胞MMP-2、MMP-9的影响 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（9）糖氧剥夺/复氧复糖下大鼠星形胶质细胞Cx43的变化及其机制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 Cx43 的结构 |
| 1.2 Cx43 的功能 |
| 1.3 Cx43 的合成 |
| 1.4 Cx43 的降解 |
| 1.5 Cx43 的调节 |
| 1.6 Cx43 的相关蛋白 |
| 1.7 Cx43 与脑缺血 |
| 1.8 展望 |
| 第2章 大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺/复氧复糖模型的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 糖氧剥夺/复氧复糖下大鼠星形胶质细胞 Cx43 的变化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 糖氧剥夺/复氧复糖下大鼠星形胶质细胞 Cx43 变化的机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 主要创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）皂角刺对肺癌的防治作用及其机制初步探讨（论文提纲范文）
| Abbreviation |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 中药治疗肺癌综述 |
| 第二章 皂角刺总黄酮抗肺癌作用体外实验研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂与药品 |
| 2.2.2 试剂配制 |
| 2.2.3 实验细胞 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞和 L929 胚肺成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 皂角刺总黄酮对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.3.3 皂角刺总黄酮对小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的影响 |
| 2.3.4 皂角刺总黄酮对 Lewis 细胞和 L929 胚肺成纤维细胞黏附的影响 |
| 2.4 统计方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞和 L929 胚肺成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.5.2 皂角刺总黄酮小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.5.3 皂角刺总黄酮对小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的影响 |
| 2.5.4 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞和 L929 胚肺成纤维细胞黏附的影响 |
| 2.6 实验小结 |
| 第三章 皂角刺总黄酮抗肺癌作用体内实验研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂与药品 |
| 3.2.2 试剂配制 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞皮下移植小鼠模型的影响 |
| 3.3.2 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞肺转移小鼠模型的影响 |
| 3.3.3 皂角刺总黄酮对乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型的影响 |
| 3.3.4 皂角刺总黄酮对乌拉坦诱导小鼠肺癌模型的病理特征的影响 |
| 3.3.5 各模型指标检测 |
| 3.4 统计方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞皮下移植小鼠模型的影响 |
| 3.5.2 皂角刺总黄酮对 Lewis 肺癌细胞肺转移小鼠模型的影响 |
| 3.5.3 皂角刺总黄酮对乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型的影响 |
| 3.5.4 皂角刺总黄酮对乌拉坦诱导小鼠肺癌模型的病理特征的影响 |
| 3.6 实验小结 |
| 第四章 皂角刺总黄酮抗肺癌作用机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂与药品 |
| 4.2.2 实验细胞 |
| 4.2.3 试剂配制 |
| 4.2.4 实验标本 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 皂角刺总黄酮对细胞间隙连接通讯的影响 |
| 4.3.2 皂角刺总黄酮对乌拉坦诱导肺癌组织免疫组化染色的影响 |
| 4.4 统计方法 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 皂角刺总黄酮对细胞间隙连接通讯的影响 |
| 4.5.2 皂角刺总黄酮对乌拉坦诱导肺癌组织免疫组化染色的影响 |
| 4.6 实验小结 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
四、佛波酯对细胞间隙连接通讯的影响及其作用机制（论文参考文献）
- [1]基于β-catenin/FOSL2/ARID5A通路探讨加味葛根芩连汤调控UC巨噬细胞极化的作用机制[D]. 许琳. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究[D]. 贺佳星. 吉林大学, 2021(01)
- [3]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [4]乌骨鸡黑色素含量测定及黑色素细胞裂解液活性研究[D]. 陈露露. 南昌大学, 2019(02)
- [5]MT-12抑制膀胱癌细胞侵袭转移的分子机制研究[D]. 孙王宏. 昆明医科大学, 2019(06)
- [6]白花蛇舌草、半枝莲及其药对提取物对人胶质瘤细胞迁移侵袭的影响及作用机制研究[D]. 韩春辉. 大连医科大学, 2019(04)
- [7]缝隙连接蛋白在肝细胞癌中的异常表达对肝癌进展的影响及其机理研究[D]. 郭云泉. 新疆医科大学, 2017(03)
- [8]金龙胆草总皂苷的抗肿瘤活性研究[D]. 秦萍. 天津科技大学, 2016(05)
- [9]糖氧剥夺/复氧复糖下大鼠星形胶质细胞Cx43的变化及其机制[D]. 谢红燕. 吉林大学, 2015(08)
- [10]皂角刺对肺癌的防治作用及其机制初步探讨[D]. 刘伟杰. 河南大学, 2014(03)