一、bFGF对人关节软骨细胞增殖和凋亡的影响（论文文献综述）
黄和涛[1]（2021）在《龙鳖胶囊通过miR-675靶向TBK1调控细胞自噬影响软骨细胞功能的机制研究》文中指出目的:本研究针对骨关节炎（OA）发病过程中软骨细胞自噬功能失调机制,探索miR-675和TBK1在OA中的调控关系;进而探讨miR-675过表达或抑制TBK1参与软骨细胞自噬的分子机制,并进一步验证龙鳖胶囊通过miR-675靶向TBK1调控细胞自噬影响软骨细胞功能的分子机制。方法:本研究从临床组织、细胞及动物实验出发,采用组织化学及病理学方法探讨miR-675和TBK1在OA中的调控关系;采用细胞及分子生物学技术证明miR-675过表达或抑制TBK1参与软骨细胞自噬的分子机制,进一步采用龙鳖胶囊从体外干预软骨细胞,验证龙鳖胶囊影响软骨细胞自噬等功能的生物学作用及意义。结果:1.miR-675和TBK1在OA大鼠关节软骨中的表达①SD大鼠OA模型关节软骨病理OARSI评分:通过关节腔注射Ⅱ型胶原蛋白酶构建SD大鼠OA模型,经HE染色及番红-O-固绿染色后进行OARSI评分,结果显示,随着造模时间增加,OA模型组关节软骨的病理OARSI评分明显高于空白对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。②miR-675在SD大鼠OA模型关节软骨中的表达:造模后4、8和12周OA大鼠关节软骨组织中miR-675的表达量较空白对照组明显减少,差异有统计学意义（P<0.01）,且随着造模时间的延长,miR-675表达量的减少越明显。③TBK1在SD大鼠OA模型关节软骨中的表达:造模后4、8和12周OA大鼠关节软骨组织中TBK1 mRNA的表达量较空白对照组明显增加,差异有统计学意义（P<0.01）,且随着造模时间的延长,TBK1 mRNA表达量的增加越明显。2.miR-675靶向TBK1影响OA软骨细胞相关功能的机制研究①miR-675 mimics和miR-675 inhibitor对软骨细胞中miR-675表达的影响:在人OA原代软骨细胞中转染miR-675 mimic和miR-675 inhibitor可以分别上调和下降细胞中miR-675的表达水平,与空白转染对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.001）。②miR-675对OA软骨细胞增殖能力的影响:使用miR-675 mimic处理软骨细胞后,软骨细胞的增殖能力与空白转染组对比增强了,差异有统计学意义（P<0.001）,而抑制miR-675的表达后,软骨细胞的增殖能力与空白转染对照组对比明显减弱,差异有统计学意义（P<0.01）。③miR-675对OA软骨细胞基质代谢的影响:与空白转染对照组相比,miR-675能够上调软骨细胞中Collagen Ⅱ蛋白的表达和下调MMP-9蛋白的表达。④miR-675对OA软骨细胞凋亡的影响:使用miR-675 mimic处理细胞后,软骨细胞的凋亡率较空白转染对照组明显降低,差异有统计学意义（P<0.001）;而抑制miR-675的表达后,软骨细胞的凋亡率较空白转染对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。⑤miR-675对OA软骨细胞自噬相关蛋白表达的影响:与空白转染对照组相比,使用miR-675 mimic处理细胞后,软骨细胞中Beclin1蛋白的表达上调、P62蛋白的表达受到抑制、LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ的比值增加,差异均有统计学意义（P<0.05）;而使用miR-675 inhibitor抑制软骨细胞中miR-675的表达后,软骨细胞中Beclinl蛋白的表达下调、P62蛋白的表达上调、LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ的比值减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。⑥miR-675对OA软骨细胞自噬流的影响:与空白转染对照组相比,使用miR-675 mimic处理的软骨细胞中红色荧光与绿色荧光的比例明显升高,自噬流增强;而使用miR-675 inhibitor处理的软骨细胞中红色荧光与绿色荧光的比例明显降低,自噬流减弱。⑦siTBK1和LvTBK1对软骨细胞中TBK1蛋白表达的影响:与空载慢病毒对照组相比,LvTBK1可以显着上调软骨细胞中TBK1 mRNA和蛋白的表达水平,差异有统计学意义（P<0.05）;而siTBK1则可以显着下调软骨细胞中TBK1mRNA和蛋白的表达水平,差异有统计学意义（P<0.05）。⑧TBK1对OA软骨细胞增殖的影响:与空载慢病毒对照组相比,过表达TBK1的软骨细胞的增殖率明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）。⑨TBK1对OA软骨细胞基质代谢的影响:与空载慢病毒对照组相比,siTBK1处理软骨细胞后Collagen Ⅱ表达上调、MMP-9蛋白表达下降;而过表达TBK1后,软骨细胞中MMP-9蛋白上调、Collagen Ⅱ蛋白的表达下调。⑩TBK1对OA软骨细胞凋亡的影响:与空载慢病毒对照组相比,过表达TBK1后,软骨细胞的凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）。11TBK1对OA软骨细胞自噬的影响:与空白转染对照组相比,siTBK1转染软骨细胞后,软骨细胞中p-mTOR和P62蛋白的表达水平明显下调,LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比例则明显升高,差异均有统计学意义（P<0.01）。12 miR-675靶向调控TBK1的表达:利用双荧光素酶报告基因检测发现miR-675-5p对TBK1-wt载体的报告荧光有明显下调作用（P<0.05）;使用miR-675-5p inhibitor干扰miR-675-5p的表达,TBK1-wt载体的报告荧光出现明显上调（P<0.05）。13 miR-675调控TBK1的表达对软骨细胞增殖的影响:在人OA原代软骨细胞中过表达TBK1后,软骨细胞的增殖活性受到抑制,当继续转染miR-675 mimic后,软骨细胞的增殖活性与单纯过表达TBK1处理的细胞相比明显提高,差异有统计学意义（P<0.01）。14 miR-675调控TBK1的表达对软骨细胞凋亡的影响:过表达TBK1后促进软骨细胞凋亡,同时使用miR-675 mimic后软骨细胞的凋亡率明显下降,差异有统计学意义（P<0.01）。15 miR-675调控TBK1的表达对软骨细胞自噬的影响:与空载慢病毒对照组相比,过表达TBK1后,软骨细胞中自噬相关基因ATG5和ATG7 mRNA的表达水平下调、mTOR蛋白水平上调、Beclin1和LC3的表达受到抑制,差异均有统计学意义（P<0.01）;而同时使用miR-675干预后,软骨细胞中自噬相关基因ATG5和ATG7 mRNA的表达水平上调、mTOR蛋白水平下调、Beclin1和LC3的表达水平上调,差异有统计学意义（P<0.01）。3.龙鳖胶囊通过miR-675/TBK1信号轴调控软骨细胞功能的分子机制①龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞活力的影响:软骨细胞的活力随龙鳖胶囊含药血清工作浓度（0,0.625%,1.25%,2.5%,5%）的升高而逐渐增强,不同浓度含药血清干预后的细胞活力比较,差异有统计学意义（P<0.05）,但当血清浓度升至10%时,软骨细胞活力反而下降;在同一浓度含药血清的作用下,随着干预时间的增加,细胞活力增强也越来越明显,不同干预时间的细胞活力比较,差异有统计学意义（P<0.05）。②龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞增殖的影响:龙鳖胶囊含药血清干预组（2.5%,5%）的细胞增殖能力较空白对照组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,且随着龙鳖胶囊含药血清干预浓度的升高,软骨细胞的增殖能力呈现出逐渐增强的趋势。③龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞基质代谢的影响:使用龙鳖胶囊含药血清干预后的人OA原代软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白的表达明显上调,随着龙鳖胶囊含药血清干预浓度的升高,人OA原代软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白的表达上调程度也越来越明显。④龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞凋亡的影响:使用IL-1β诱导软骨细胞发生凋亡,同时使用5%龙鳖胶囊含药血清干预后,软骨细胞的凋亡率明显下降,差异有统计学意义（P<0.001）;2.5%和5%浓度的龙鳖胶囊含药血清处理人OA原代软骨细胞48h后,与空白对照组比较,软骨细胞中Bcl-2蛋白表达量明显增多,而Cleaved Caspase-3蛋白的表达量则减少,差异均有统计学意义（P<0.05）。⑤龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞自噬的影响:与空白对照组比较,2.5%及5%的龙鳖胶囊含药血清均能明显升高软骨细胞中ATG5和ATG7 mRNA的表达水平、抑制mTOR蛋白的表达、上调Beclin-1的蛋白水平、增加LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ的比例、增强自噬流,差异均有统计学意义（P<0.05）。⑥龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞中miR-675和TBK1表达的影响:2.5%和5%的龙鳖胶囊含药血清都可以上调软骨细胞中miR-675的表达,与空白对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）;龙鳖胶囊含药血清可以下调软骨细胞中TBK1mRNA和蛋白的表达水平,与空白对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。⑦miR-675在龙鳖胶囊含药血清影响软骨细胞功能中的作用:与空白转染对照组相比,在OA软骨细胞中转染miR-675 inhibitor后,软骨细胞的增殖活性明显下降、凋亡率明显升高、自噬明显降低,差异均有统计学意义（P<0.05）;而当联合使用5%龙鳖胶囊含药血清干预时,与单纯使用miR-675 inhibitor处理的细胞相比,软骨细胞的增殖活性明显升高、凋亡率明显下降、自噬明显增强,差异均有统计学意义（P<0.05）。⑧TBK1在龙鳖胶囊含药血清影响软骨细胞功能中的作用:与空载慢病毒对照组相比,在人OA原代软骨细胞中过表达TBK1后,软骨细胞的增殖活性明显下降、凋亡率明显升高、自噬相关基因ATG5和ATG7mRNA的表达水平下调、mTOR蛋白水平上调、Beclin1和LC3的表达水平受到抑制,差异均有统计学意义（P<0.05）;而当联合使用5%龙鳖胶囊含药血清干预时,与单纯过表达TBK1的软骨细胞相比,软骨细胞的增殖活性明显提高、凋亡率明显下降、自噬相关基因ATG5和ATG7 mRNA的表达水平上调、mTOR蛋白水平下调、Beclin1和LC3的表达水平上调,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:补肾活血中药龙鳖胶囊具有增强软骨细胞活力、促进软骨细胞增殖及自噬、调节软骨细胞基质代谢、抑制软骨细胞凋亡的作用。miR-675具有促进软骨细胞增殖、抑制软骨细胞凋亡及软骨基质降解、增强软骨细胞自噬,进而保护关节软骨的功能。TBK1具有抑制软骨细胞增殖及自噬、促进软骨细胞凋亡及软骨基质降解的作用。miR-675具有靶向调控TBK1表达的作用。龙鳖胶囊含药血清具有上调软骨细胞中miR-675表达和下调TBK1蛋白表达的作用。龙鳖胶囊含药血清可能是通过抑制TBK1的表达进而达到抑制软骨细胞凋亡和促进软骨细胞自噬和增殖的作用。龙鳖胶囊含药血清可能是通过上调miR-675的表达进而达到抑制软骨细胞凋亡和促进软骨细胞自噬和增殖的作用。龙鳖胶囊含药血清可能是通过miR-675/TBK1信号轴调控细胞自噬,抑制软骨细胞凋亡和增强软骨细胞增殖活性,从而起到保护关节软骨细胞、延缓OA进展的作用。
宋华[2]（2021）在《FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景椎间盘退行性变（intervertebral disc degeneration,IVDD）是一种影响腰椎间盘形态和正常生理功能的常见疾病,并最终导致脊柱承受压缩载荷的能力下降。作为一种多因素疾病,其病因至今仍不完全明确,其中遗传倾向、年龄、生活方式（肥胖、吸烟、抑郁症状）和非生理性机械负荷等多种因素,都是导致其进展的原因。研究表明,IVDD是诱发腰痛（LBP）的主要原因,约80%的成年人存在不同程度的腰痛症状。据估计,美国LBP引发的直接成本每年可高达900亿美元,同时因LBP引发的劳动能力下降对于整体社会经济影响造成了显着的挑战。多项研究指出,IVDD中的病理变化与椎间盘退变有关,其中细胞外基质降解、炎症产生和细胞损伤凋亡为最主要的原因。细胞外基质（ECM）在椎间盘的机械功能中发挥重要作用,其中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原提供拉伸强度,蛋白多糖参与形成间盘组织结构,然而位于椎间盘中心区域的髓核（NP）细胞合成ECM成分的能力降低,同时ECM降解分子（如基质金属蛋白酶等）分泌明显增多,导致间盘组织水结合能力持续降低,最终导致结构和功能损伤。研究证实,退行性变首先出现在髓核,随后损伤进一步扩展至椎间盘外部区域的纤维环（AF）,并引发两种不同组织间界限消失。在此过程中,细胞丢失以及密度降低是椎间盘退变的一个重要原因,并进一步增强了ECM的降解。多数研究指出,细胞丢失可由程序性细胞凋亡引发,并因细胞衰老、机械应力等潜在因素增加凋亡的发生。除ECM降解和细胞丢失外,炎症也在IVDD发生和进展中发挥重要作用,已成为区分无症状性椎间盘退变和有症状性椎间盘退变的一个重要因素。NP细胞在损伤过程中可导致多项炎症因子异常募集,并促进基质降解、激活宿主免疫反应,最终导致免疫细胞在神经纤维中浸润,从而诱发退行性变进行性加重,而神经浸润则是椎间盘退行性变疼痛的主要原因。多数研究证实,ECM降解、细胞凋亡、炎症反应被称为IVDD的标志,且三种病理反应相互关联并彼此依赖。促炎细胞因子可通过上调ECM降解酶的表达和降低ECM结构成分而导致代谢失调,同时ECM的大量固有降解导致ECM碎片在细胞外积聚,并作为自身免疫抗原进一步刺激NP细胞的炎症反应。此外,椎间盘组织中较高的细胞凋亡率和衰老率以及较低的ECM产生能力均与炎症密切相关。近年来,机械生物学指出,机械应力在IVDD的诱发因素中存在重要作用,且椎间盘的非生理机械负荷已被证明与基质降解和细胞生理变化密切相关。现阶段,多数研究学者发现机械应力、ECM降解、细胞丢失以及炎症反应在IVDD的发生和进展中存在相互依赖性,但对于各损伤过程中的具体机制尚缺乏共识。Ⅱ型胶原是ECM的重要组成部分,主要由软骨细胞分泌,对维持终板软骨稳定发挥重要作用。Ⅱ型胶原在一定程度上反应了软骨细胞合成代谢的能力。基质金属蛋白酶（MMP）,可对ECM中Ⅱ型胶原进行降解,是终板软骨中关键的分解代谢的酶之一。MMPs组织抑制物4（TIMP-4）为MMPs的特异性抑制因子,在代谢调控中可表现为MMP抑制作用,并降低ECM分解水平,因此TIMP-4也可作为软骨细胞合成代谢的关键标志物。现阶段,非甾体药物治疗以及物理治疗方式为IVDD的常规治疗方案,外科侵入性手术行脊柱融合或关节成型可作为常规治疗难以缓解的二线治疗方案。尽管目前手术成功率较高,但治疗过程中手术费用高昂、术后疼痛以及生活质量降低的局限性严重影响手术效果,因此探索新的治疗方案用以改善治疗现状成为临床亟需解决的热点问题。近年来,外源性生长因子应用在椎间盘退行性变的治疗中展现出较好的前景,并且在安全性和可行性方面得到证实。多数研究表明,生长因子治疗作为一种促进椎间盘组织再生的治疗方案,通过典型生长因子组合应用方式具有改善IVDD恢复能力的效果,并在体外和动物模型中显示出调节合成代谢和抑制分解代谢作用的潜力。既往研究指出,增加ECM合成代谢、减少分解代谢对于维持ECM稳定性、缓解椎间盘退行性变过程中具有重要意义,因此生长因子治疗有可能成为一种缓解和治疗IVDD的新方案。近年来,成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）以其具有促进有丝分裂和促进细胞增殖的作用,目前广泛应用于各种组织修复。有研究表明,FGF在骨骼系统中的作用,是通过与FGF受体结合而启动的,并在缓解椎间盘退行性变过程中可能存在一定的治疗作用。也有研究表明,骨关节炎（Osteoarthritis,OA）患者的FGF-2含量明显高于正常情况下的FGF-2含量,认为高FGF2含量可能引起软骨老化。有研究表明FGF的受体FGFR1及FGFR3在软骨老化过程中发挥重要作用。综合既往研究分析,FGF-2在人类软骨细胞（CHs）中发挥的作用是双向的,对OA患者有加速疾病发生作用。然而,有研究人员发现,FGF-2基因敲除小鼠比正常小鼠更容易发生OA,皮下注射FGF-2可以减缓这种效应。以上研究均指出,FGF2有可能在IVDD延缓病理过程和治疗中展现出独特的分子生物学作用,而目前对于其具体作用机制尚缺乏相关报道。因此本研究旨在探索FGF2在改善椎间盘退行性变过程中代谢调控作用机制及生物学意义。研究目的本研究通过观察FGF2在不同腰椎退行性变患者软骨终板组织中的表达水平,并采用外源性FGF2对体外培养正常软骨细胞、退行性变性软骨细胞,探讨FGF2在软骨终板细胞合成代谢和分解代谢间的调控作用。在本研究过程中,进一步分析FGF2在改善代谢反应过程中对Caspase-3、bcl-2表达的调控作用,深入探讨FGF2对于促进软骨终板细胞增殖并抑制凋亡中的具体作用机制,以阐明FGF2在缓解软骨终板细胞退行性变中的生物学意义。研究方法第一部分FGF2在不同程度腰椎退行性变患者软骨终板组织标本中的表达选取2017年3月至2018年11月间在我院骨科行脊柱融合术的8例患者病历资料进行分析,按照MRI影像学结果评估腰椎退行性病变等级分为轻度IVDD组和重度IVDD组,每组4人。对所有患者均行磁共振成像观察病变椎间盘形态,取手术切除的椎间盘组织行HE染色。将手术获取软骨终板细胞进行体外分离培养,采用 RT-qPCR 分析细胞中 FGF2、FGFR1、FGFR3 以及 MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。体外培养0、24、48、72h,采用CCK-8法检测软骨终板细胞增殖活力,分析细胞代谢状态。第二部分外源性FGF2对正常软骨终板细胞的代谢调控影响选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞加入不同浓度（5ng/mL和10ng/mL）外源性FGF2进行培养。同时设置空白对照组,未加FGF2蛋白处理。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR3以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原蛋白表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对软骨细胞培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。第三部分体外诱导软骨终板细胞退行性变性中的代谢调控及Caspase-3、bcl-2表达的机制研究选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞应用IL-1β诱导退行性变性。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。采用蛋白印迹定量分析检测细胞中Caspase-3、bcl-2蛋白表达水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对软骨细胞培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。第四部分外源性FGF2联合FGFR1阻断剂对于延迟软骨终板细胞变性的影响选用正常人软骨细胞进行复苏、培养和传代,选择对数生长期细胞应用IL-1β诱导退行性变性。取外源性人重组FGF2蛋白对软骨细胞进行处理并分为两组:FGF2组和FGF2+PD（FGFR1抑制剂）组;另选取一空白组作为对照,其中未加FGF2、PD蛋白进行处理。采用RT-qPCR分析细胞中FGF2、FGFR1、FGFR3以及MMP-13、TIMP-4和Ⅱ型胶原的mRNA水平。应用免疫荧光法分析各组细胞Ⅱ型胶原表达。在培养后0、12、24、48、72h,应用CCK-8法检测不同时间点软骨细胞增殖活力水平。应用Annexin V-FITC/PI双染法对培养后0、12、24、48、72h进行染色,采用流式细胞术对细胞凋亡水平进行分析。研究结果1、严重退变的相邻椎体间的位置高度较轻度退变降低,且MRI图像中水分程度亦较轻度病变减低。HE染色发现软骨终板组织比髓核组织质地更硬、分布更密集,软骨终板细胞的分布位置比髓核细胞更近。椎间盘重度退变的软骨终板细胞中FGF2、FGFR1、MMP-3表达水平较椎间盘轻度退变表达显着增加（P<0.001）;但在两种不同程度退行性改变中,FGFR3的表达量无统计学意义（P>0.05）;重度椎间盘退变中Ⅱ型胶原和TIMP-4表达水平较轻度椎间盘退变降低（P<0.05）。2、外源性FGF2蛋白处理72h后,三组细胞中FGF2 mRNA表达无统计学意义（P>0.05）;FGF2处理组FGFR1和FGFR3水平均明显高于对照组（P<0.05）。对FGFR1表达水平进行分析,5ng/mL组与10ng/mL组间结果无统计学意义（P>0.05）;对FGFR3表达水平进行分析,1Ong/mL组表达水平明显高于5ng/mL组（P<0.001）。外源性FGF2蛋白处理72h后,两组细胞TIMP-4表达水平较对照组明显上升,且10ng/mL组表达水平高于5ng/mL组（P<0.05）;三组细胞MMP-13表达水平无统计学意义（P>0.05）。对Ⅱ型胶原荧光定量进行分析,10ng/mL组细胞表达水平显着高于对照组和5ng/mL组（P<0.001）;对照组和5ng/mL组间水平无统计学意义（P>0.05）。三组细胞72h不同时间点细胞增殖活力均随时间呈增加趋势（P<0.05）。三组间相同时间点增殖活力比较,提示:①培养0h时,三组细胞增殖活力无统计学意义（P>0.05）;②培养12h时,三组细胞增殖活力不相同,10ng/mL组增殖水平较5ng/mL组和对照组升高（P<0.05）,但5ng/mL组和对照组增殖水平无统计学意义（P>0.05）;③培养24h时,1Ong/mL组和5ng/mL组增殖水平均较对照组升高（P<0.05）,而10ng/mL组和5ng/mL组增殖活力比较无统计学意义（P>0.05）;④培养48h、72h后,10ng/mL组水平较5ng/mL组和对照组升高,且5ng/mL组水平明显高于对照组（P<0.05）。三组细胞凋亡率水平不全相同（P<0.05）,且培养后Oh,三组细胞凋亡率水平无统计学意义（P>0.05）;培养后12h,10ng/mL组凋亡率高于5ng/mL组和对照组,且5ng/mL组凋亡率低于对照组（P<0.05）;培养后24h、48h、72h,三组细胞凋亡率水平比较均无统计学意义（P>0.05）。3、IL-1 β处理后24h,FGF2表达水平低于对照组;但IL-1 β处理后48、72h,退行性变细胞FGF2表达水平较对照组升高,且IL-1 β处理后72h水平高于IL-1β处理后48h（P<0.05）。IL-1 β处理后24、48、72h,处理组退行性变细胞FGFR1含量均较对照组升高,且处理组细胞FGFR1水平随时间推移呈持续增高趋势（P.<0.05）。IL-1β处理后24h,处理组退行性变细胞表达水平与对照组分析无统计学意义（P>0.05）;处理后48、72h,处理组细胞表达水平均较对照组降低;IL-1 β处理后48h与处理后72h,退行性变细胞FGFR3水平比较无差异（P<0.05）。IL-1 β处理后72h,处理组退行性变细胞Ⅱ型胶原水平较对照组降低（P<0.05）。同时,IL-1 β处理后细胞MMP-13 水平较对照组明显上升（P<0.001）;两组细胞TIMP-4表达量比较无统计学意义（P>0.05）。两组细胞72h内不同时间点细胞增殖活力不全相同,增殖活力水平均呈表现为持续降低（P<0.05）,且培养Oh,两组细胞增殖活力水平无统计学意义（P>0.05）;培养12、24、48、72h,IL-1 β处理后细胞增殖活力低于对照组细胞（P<0.05）。IL-1 β处理组细胞Caspase-3蛋白表达量较对照组增强,但IL-1 β处理组细胞bcl-2表达量较对照组降低（P<0.05）。两组间72h内不同时间点细胞凋亡率不全相同,IL-1 β处理组细胞凋亡率呈持续上升趋势,对照组细胞凋亡率呈先降低后缓慢升高趋势（P<0.05）。对两处理组细胞相同时间点凋亡率进行对比分析,提示:①培养Oh,两组细胞凋亡率水平无统计学意义（P>0.05）;②培养后12、24、48、72h,IL-1 β处理组细胞凋亡率较对照组增加（P<0.05）。4、三组细胞中FGF2 mRNA表达水平无统计学意义（P>0.05）;三组间FGFR1、FGFR3 mRNA表达水平不全相同（P<0.05）。对FGFR1进行分析,IL-1β+FGF2处理组细胞表达水平较对照组显着升高,IL-1 β+FGF2+PD组细胞表达水平明显低于对照组和IL-1β+FGF2组（P<0.05）。对FGFR3表达进行分析,IL-1 β+FGF2+PD组表达水平明显高于IL-1 β+FGF2组和对照组,且IL-1 β+FGF2组表达水平较对照组升高（P<0.05）。三组细胞MMP-13、TIMP-4、Ⅱ型胶原表达无统计学意义（P<0.05）。对MMP-13表达进行分析,IL-1 β+FGF2组结果较IL-1 β+FGF2+PD组和IL-1 β组升高,且IL-1 β+FGF2+PD组表达水平高于IL-1 β组（P<0.05）。对TIMP-4表达进行分析,IL-1 β+FGF2+PD组表达水平较IL-1 β+FGF2组和IL-1 β组升高,IL-1 β+FGF2组和IL-1 β组表达水平比较无统计学意义（P>0.05）。对Ⅱ型胶原表达进行分析,IL-1 β+FGF2组表达水平明显低于IL-1 β+FGF2+PD组和IL-1 β组,IL-1 β+FGF2+PD组表达较IL-1β组升高（P<0.05）。三种方案处理组细胞72h不同时间点细胞增殖活力均随时间呈增加趋势（P<0.05）。三组间相同时间点增殖活力比较,提示:①培养Oh时,三组细胞增殖活力无统计学意义（P>0.05）;②培养12h时,IL-1 β+FGF2组与IL-1 β+FGF2+PD组增殖活力均高于IL-1 β组,而IL-1 β+FGF2组和IL-1β+FGF2+PD组结果比较无统计学意义（P>0.05）;③培养24、48、72h时,IL-1β+FGF2+PD组水平均明显高于IL-1 β+FGF2组和IL-1 β组,且IL-1 β+FGF2组水平较IL-1β组升高。Annexin V-FITC/PI双染后发现,三组细胞凋亡率水平不全相同,且呈现持续降低（P<0.05）。三组间相同时间点凋亡率比较,提示:①培养后0、12h,三组细胞凋亡率水平比较无统计学意义（P>0.05）;②培养后 24、48、72h,IL-1 β+FGF2+PD 组水平低于 IL-1 β+FGF2 组和 IL-1 β 组,且IL-1 β+FGF2组凋亡率水平较IL-1β组降低（P<0.05）。研究结论本研究阐明FGF2在软骨细胞退变中的作用,FGF2在椎间盘内稳态中的多种作用取决于退行性变的阶段和疾病过程的类型。在退变早期软骨细胞中,FGF2可能作用一种合成代谢介质,刺激TIMP-4和Ⅱ型胶原表达增加,下调MMP-13含量,诱导细胞增殖及降低细胞凋亡。对于退变晚期的软骨细胞,FGF2可能作为一种分解代谢介质,刺激MMP-13的表达,抑制蛋白多糖的合成,诱导Caspase-3表达上调,并下调bcl-2表达,诱导细胞凋亡效应并加剧椎间盘退变。此病理过程中FGFR1的异常激活可能为促进分解代谢的主要因素,靶向阻断FGFR1的表达可有效降低ECM分解,在改善椎间盘软骨退行性变治疗中存在积极意义,因此联合应用FGF2/FGFR1拮抗剂有望成为预防椎间盘软骨退变和促进终板软骨再生和修复的潜在治疗新方案。
杨帆[3]（2021）在《bFGF联合琼脂糖凝胶预植入促进异体移植后全层软骨缺损修复的研究》文中提出近年来,同种异体全层软骨移植技术逐渐成为治疗全层软骨损伤这一业内难题的可选方法。该技术可以在为机体提供具有生物学活性的骨与软骨组织的同时,对缺损部位进行大面积甚至是特殊形状单独定制的修复。但是由T细胞介导,多种炎症细胞、炎性因子共同参所引发的免疫排斥反应,导致大量移植手术失败。所以如何避免免疫排斥反应成为同种异体全层软骨移植成功与否的关键问题。针对这一难点,传统方法如对所移植骨与软骨组织进行脱细胞、脱抗原处理等,不仅使移植物失去生物活性,而且无法从根本上避免免疫排斥反应,难以达到全层软骨修复的目标。本研究对大鼠全层软骨缺损区域预植入吸收了碱性成纤维细胞生长因子溶液的琼脂糖凝胶,使机体对其攻击后在局部形成免疫包囊,再二次手术进行同种异体全层软骨移植,在免疫包囊的保护下使所移植全层软骨逃避宿主免疫攻击。并探讨免疫排斥反应的发生机制、病程演变与进行规避。以此为依据,为全层关节软骨缺损的修复提供一种新的方法。本研究主要内容与取得成果如下:第一、体外细胞实验中发现,对大鼠体外培养第三代软骨细胞进行适当浓度的bFGF干预,可以促进软骨细胞的增殖分化,提示其应用的最佳浓度区间为10 ng/mL-100 ng/mL,但当bFGF的浓度达到500 ng/mL时这种促进作用开始降低,并出现抑制,为后续体内实验bFGF溶液的应用浓度提供了理论基础。第二、针对全层软骨移植术后,机体急性免疫反应发生的时间规律进行了动物体内实验研究,得出该反应强度在术后5天达到最高峰,后逐渐回落的结论,机体也通过此过程完成了对同种异体植入物的攻击杀伤。使急性免疫反应在时间上更加具体化,为今后生物工程骨科材料植入以及同种异体/异种骨软骨移植的免疫抑制干预提供了基础。第三、在大鼠全层软骨缺损部位异体移植手术前7天,进行bFGF/琼脂糖凝胶柱复合体的预植入占位,该方法可以有效降低大鼠的炎性反应,保护二期手术移植物,促进全层软骨异体移植修复。为全层软骨修复这一难题,提供了新的方法和思路。综上所述,本研究设计和构建了一系列降低同种异体全层软骨移植术后免疫排斥反应的手术方式和干扰方法,保护所移植的骨与软骨组织,促进了全层软骨缺损的修复。
赵畅[4]（2020）在《BMP5促进软骨细胞衰老和凋亡在骨关节炎中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种最常见的慢性退行性病变,可累及全身多个关节,好发在膝关节,常伴有关节疼痛、活动度减小、关节畸形挛缩等症状。OA一直以来都是研究的热点,但目前仍没有找到有效的靶点进行治疗。目前有大量的研究表明BMP5与OA相关,但其是否在OA的疾病发生发展过程中发挥作用仍值得探讨。研究目的本研究旨在明确BMP5在OA关节软骨组织中表达情况,进而探究BMP5蛋白在OA中对软骨细胞功能的影响,研究BMP5与骨关节炎中关节软骨细胞出现衰老和凋亡之间的关系,深入探讨BMP5与ERK/p38 MAPK信号通路在骨关节炎病程中的作用及其分子机制,为防治骨关节炎提供新的潜在靶点。研究方法本研究在临床上收集OA患者关节软骨标本和正常关节软骨标本、关节液,通过免疫组化、western blot、ELISA实验检测BMP5的表达情况。同时利用c57/BL6小鼠构建DMM-OA骨关节炎模型、年老模型,通过IHC检测BMP5在造模术后2、4周膝关节软骨中的表达情况。利用ATDC5细胞进行体外siRNA转染,敲除BMP5,并利用荧光实时定量（RT-qPCR）和western blot实验明确敲除效果;利用IL-1β刺激软骨细胞,并同时敲除BMP5,观察敲除掉BMP5后对软骨细胞分解合成代谢的影响。构建小鼠DMM-OA模型,并在关节腔内注射慢病毒敲除软骨细胞中的BMP5,观察在体内实验中敲除BMP5对骨关节炎的影响。通过体外诱导软骨细胞衰老和凋亡,观察敲除BMP5后对软骨细胞衰老和凋亡的影响。在软骨细胞中加入重组蛋白BMP5（rhBMP5）和ERK抑制剂PD98059,观察BMP5对ERK/p38 MAPK信号通路的影响。研究结果本研究发现BMP5与OA有着密切的关系。通过从蛋白水平检测,OA患者及小鼠骨关节炎、年老模型中的关节软骨均发现BMP5表达增高。同时在OA患者膝关节液的ELSIA结果中BMP5分泌也是增高的。体外软骨细胞中敲除BMP5能够下调MMP13、ADAMTS5、IL-1等分解代谢指标的表达,以及上调COL2A和ACAN合成代谢指标的表达。通过膝关节注射慢病毒,软骨组织中敲除BMP5（DMM+LV-BMP5）组关节软骨程度较对照组NC（DMM+LV-NC）组更加完整,番红O-固定绿染色、甲苯胺蓝染色着色更深、更多。在IL-1β、DMM-OA诱导的软骨细胞衰老和凋亡中,敲除掉BMP5能够下调β-半乳糖苷酶染色、p16、p21、TUNEL染色及cleaved-capse3的表达,能缓解骨关节炎中出现的细胞衰老和凋亡。软骨细胞中加入rhBMP5能够激活ERK/p38 MAPK信号通路,而加入PD98059则能逆转这种现象。研究结论OA病情进展过程中,软骨细胞BMP5表达上调,通过促进软骨细胞的分解代谢、软骨细胞衰老、凋亡来加重骨关节炎,药物抑制软骨细胞的ERK1/2信号通路活化是防治OA的潜在靶点。
刘绪昌[5]（2020）在《富血小板血浆来源外泌体在治疗兔膝骨关节炎中的作用及机制研究》文中指出目的:本文旨在通过两步离心法提取新西兰大白兔自体富血小板血浆,并研究富血小板血浆分泌的外泌体,对富血小板血浆来源外泌体进行分析鉴定;进一步探究富血小板血浆来源外泌体对体外骨关节炎软骨细胞的增殖凋亡影响以及与其相关的信号通路;观察富血小板血浆来源外泌体对动物模型中骨关节炎的治疗效果,为骨关节炎的早期治疗寻找有效的治疗手段,为富血小板血浆来源外泌体的临床成果转化提供坚定的理论支持及循证医学依据。方法:第一部分:抽取新西兰大白兔耳缘静脉血液,通过两步离心法提取自体富血小板血浆,然后利用外泌体提取试剂盒（exoEasy Maxi Kit）提取富血小板血浆来源外泌体（PRP-exos）;利用透射电镜对富血小板血浆来源外泌体进行动态观察,利用纳米跟踪分析技术（NTA）分析其大小与浓度,采用免疫蛋白印迹（Westemblotting）明确富血小板血浆来源外泌体上的标志性蛋白分子;将提取的外泌体置于-80°液氮保存,备用。第二部分:剥离新西兰大白兔双膝软骨层,用胶原酶处理后分离和提取原代软骨细胞,经阿利新蓝、番红固绿及免疫组织化学（COL Ⅱ）染色鉴定;进一步传代培养后用于其他实验（三代内）。于P1代软骨细胞加入IL-1β（10ng/ml）模拟骨关节炎软骨细胞模型,并用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定软骨细胞释放的炎性因子TNF-α。按照如下分组进行试验:①对照组（Control组）,②IL-1β组,③IL-1 β+PRP-as（5ug/ml）组,④IL-1 β+PRP-as（50ug/ml）组,⑤IL-1 β+PRP-exos（5ug/ml）组,⑥IL-1β+PRP-exos（50ug/ml）组。通过流式细胞术、细胞增殖实试验（CCK-8）、迁移试验、划痕试验来比较PRP-exos与激活的富血小板血浆（PRP-as）对骨关节炎模型中软骨细胞的影响,从而比较PRP-exos与PRP-as对骨关节炎软骨细胞的作用差异。通过Western Blotting测定骨关节炎模型软骨细胞经PRP-exos或PRP-as共培养后β-catenin、RUNX2和Wnt5a的表达,探究PRP-exos对骨关节炎模型软骨细胞作用的信号通路。第三部分:取24只清洁级新西兰大白兔,采用随机分组对照原则,分为空白对照组（Sham group）、模型组（Model group）和实验组,其中实验组又分为:①PRP-exos组（100ug/ml）、②PRP-as组（100ug/ml）,每组6只（n=6）。空白对照组仅切开左膝关节囊,不做其他任何关节内处理,然后予以缝合;模型组和实验组则行改良Hulth法制作左膝关节骨关节炎模型（将内侧半月板切除,将内侧副韧带及前交叉韧带切断）。建模后7天内连续肌肉注射青霉素80万单位,每天一次,预防刀口感染。建模6周后将实验各组动物于耳缘静脉抽取自体静脉血1Oml,按照第一部分方法制备富血小板血浆及富血小板血浆来源外泌体,并进行蛋白浓度测定;然后按照实验组各组浓度要求行左膝关节腔注射;空白对照组与模型组关节腔内按相同方法注射等量生理盐水（0.6ml）。每周注射1次,连续注射6周后将各组动物处死。通过大体形态学观察、苏木素伊红染色（HE染色）、免疫组织化学染色（COL-2、RUNX2）、OARSI评分等方法比较PRP-exos与PRP-as在体内治疗骨关节炎的效果,观察有无统计学差异。结果:第一部分:本论文通过两部离心法成功从新西兰大白兔血浆提取出富血小板血浆,并进一步用外泌体提取试剂盒（exoEasy Maxi Kit）从中提取出富血小板血浆来源外泌体,并用透射电子显微镜（TEM）观察到PRP-exos是一种圆形或椭圆形的脂质双分子层结构的小囊泡;通过粒径分析仪,测出其直径范围为145.6±50.4 nm;采用蛋白免疫印迹（WB）可测定出PRP-exos的表面有CD9、CD63、CD81和HSP101的表达,其均为外泌体的特异性标志分子,更进一步证明富血小板血浆中外泌体的存在。第二部分:本研究成功提取出软骨细胞,并进行了传代培养。软骨细胞表现为三角形、多边形或纺锤形,该细胞的蛋白多糖沉积可被阿尔新蓝染成蓝色,而经番红固绿染色可见细胞基质为深红色,进一步对该细胞进行免疫组织化学染色（COL-II）,表现为细胞核呈蓝色,细胞质呈现棕褐色,这些染色结果均可有效证明提取的细胞为软骨细胞。在体外试验中,本研究发现IL-1β（10ng/ml）可成功诱导软骨细胞炎性改变,明显增加TNF-α的释放,采用ELISA测定IL-1β组TNF-α的OD值为2.58±0.11,与对照组相比明显增加（P<0.05）。在加入不同浓度PRP-exos及PRP-as后,测定各组TNF-α的OD值（PRP-exos 5ug/ml:2.16±0.08;PRP-exos 50ug/ml:2.05±0.13;PRP-as 5ug/ml:2.25±0.06;PRP-as50ug/ml:2.08±0.04;P<0.05）均明显下降,而各浓度组之间相比,无明显统计学差异（P>0.05）。在体外细胞增殖试验中,用IL-1β（10ng/ml）模拟骨关节炎软骨细胞,在加入不同浓度的PRP-exos和PRP-as（5ug/ml、50ug/ml）后,经CCK8试验发现,试验组在培养24h、48h、72h、120h后软骨细胞均较诱导组明显增殖（P<0.05）;且高浓度组在各个时间段均是PRP-exos组优于PRP-as组（P<0.05）,而低浓度组在培后24h、48h时PRP-exos组优于PRP-as组（P<0.05）,在培养72h、120h后两者无明显统计学意义（P>0.05）。通过细胞凋亡研究（流式细胞术）,我们发现高浓度的PRP-exos及PRP-as均显着抑制经IL-1β（10ng/ml）诱导的软骨细胞凋亡（PRP-exos 50ug/ml:10.45±0.36;PRP-as50ug/ml:12.34±0.42;诱导组13.85±0.34,P<0.05）,且PRP-exos的作用效果明显好于PRP-as,具有统计学差异（P<0.05）。但是,在低浓度组,两者对诱导组软骨细胞凋亡的抑制效果差别不显着,无统计学差异（P>0.05）。在体外细胞迁移试验中,我们研究发现IL-1β（10ng/ml）显着地抑制软骨细胞的迁移;而PRP-exos与PRP-as均可明显促进软骨细胞迁移,且在相同浓度时前者的作用效果大于后者,同时高浓度的PRP-exos及PRP-as的作用效果均大于低浓度组。通过细胞划痕试验我们发现在连续培养6h、12h后仅有高浓度PRP-exos可促进软骨细胞明显迁移（P<0.05）,而其他各组对软骨细胞的迁移作用无统计学意义（P>0.05）。在用Western blotting进行的相关信号通路研究中,我们发现经IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞可使Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin、RUNX2和Wnt5a均高表达,而加入PRP-exos和PRP-as后可使其降低表达,具有明显统计学意义（P<0.05）,其中对RUNX2和Wnt5a表达的降低作用PRP-exos要大于PRP-as（P<0.05）,而对β-catenin表达的降低作用PRP-exos要小于PRP-as（P<0.05）。第三部分:本次动物实验研究中无意外死亡发生。根据改良Hulth法成功制作出新西兰大白兔左膝关节骨关节炎模型,并进行随机对照分组实验。建模6周后将实验动物利用空气栓塞法处死,获取标本,经大体形态学发现,模型组即OA组膝关节出现滑膜组织水肿,股骨内髁软骨呈暗灰色,触摸表面不平整,股骨内髁可见部分软骨变薄,周围多发骨赘形成,而PRP-exos组和PRP-as组骨关节炎改变均较模型组轻。通过HE染色发现模型组软骨表面局灶性增生,软骨细胞排列不规则,边界模糊,而PRP-exos及PRP-as组则均有明显改善,关节软骨表面尚完整,颜色较OA组正常,无关节软骨面缺损;进一步通过软骨细胞计数发现,PRP-exos组与PRP-as组均可显着使软骨细胞增加（P<0.05）,而且PRP-exos的作用要大于PRP-as组（P<0.05）。通过对标本进行COL Ⅱ和RUNX2免疫组织化学染色,我们发现PRP-exos和PRP-as均可逆转骨关节炎引起的Ⅱ型胶原蛋白表达减少并抑制RUNX2蛋白的表达,促进软骨修复,并且前者的作用大于后者（P<0.05）。根据OARSI推荐的评分显示,OA组的评分较对照组明显升高（P<0.05）,而PRP-exos组的评分及PRP-as的评分较OA组降低,说明PRP-exos及PRP-as均可有效抑制骨关节炎（P<0.05）;且PRP-exos的评分低于PRP-as,表明PRP-exos抑制骨关节炎的作用大于PRP-as（P<0.05）。结论:本研究成功地从新西兰大白兔血液中提取富血小板血浆,并从中提取和鉴定分析了富血小板血浆来源的外泌体。本研究成功提取了兔软骨细胞,并于体外经IL-1β诱导成功建立了体外骨关节炎软骨细胞模型。通过研究发现富血小板血浆来源外泌体可以促进经IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞的增殖和迁移,抑制软骨细胞凋亡。PRP-exos通过Wnt/β-catenin信号通路中的相关蛋白表达及负表达,从而达到抑制骨关节炎的效果。由于PRP-exos在缓解骨关节炎方面的作用大部分明显优于PRP-as,或有部分与其相似,因此我们认为富血小板血浆来源外泌体可能在关节腔注射富血小板血浆治疗骨关节炎方面起主导作用。综上所述,我们认为富血小板血浆来源的外泌体（PRP-exos）具有潜在的治疗骨关节炎的作用,通过关节腔注射PRP-exos可以作为治疗骨关节炎的新手段,为今后骨关节炎临床治疗的探索和应用提供一种新的途径。
沈序[6]（2019）在《小鼠关节软骨来源祖细胞体外软骨组织构建及体内抗血管化研究》文中指出第一部分小鼠关节软骨来源祖细胞的提取与鉴定目的:从小鼠关节软骨中分离培养关节软骨来源祖细胞（Articular Cartilage-derived Progenitor Cells,ACPCs）,观察 ACPCs 的细胞形态,鉴定其增殖、分化能力及表面标志物,探究小鼠ACPCs的细胞特性,为软骨组织工程提供合适的种子细胞。方法:无菌条件从5天龄,雄性C57BL/6小鼠各关节中获得软骨组织,以Ⅳ型胶原酶消化6-8h,获得细胞悬液。采用纤连蛋白分黏附分选法获得小鼠ACPCs。流式细胞术鉴定其表面标志物表达。待细胞长至80%行倒置显微镜观察其细胞形态;克隆形成实验评估其增殖能力;三系诱导检测细胞多系分化能力。结果:倒置显微镜观察显示小鼠ACPCs呈中间宽两边细长的短梭形,其形态与间充质细胞类似。流式细胞鉴定,CD29、CD73表达分别为（89.2±1.53）%和（81.1±0.84）%;CD90、CD105 分别为（24.3±1.11）%和（41.6±0.62）%;Notch-1表达为（12.0±1.05）%;CD31、CD44、CD45表达分别为低表达或不表达。克隆形成实验显示小鼠ACPCs可形成多个单细胞克隆簇。成骨诱导条件有钙结节产生;成脂诱导条件有大量脂滴产生;成软骨诱导条件细胞团块HE染色有软骨陷窝产生,周围有大量细胞外基质。结论:运用纤连蛋白分选从小鼠关节软骨中成功获得ACPCs,其具有三系分化潜能。第二部分小鼠ACPCs的增殖和成骨、成软骨分化能力研究目的:评价不同代次小鼠ACPCs的增殖和成骨、成软骨分化能力的差异,以及探索小鼠ACPCs的有效增殖及分化诱导方案。方法:取不同代次（P0、P1、P2代）小鼠ACPCs和不同碱性成纤维生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）浓度（0 ng/mL、2 ng/mL 和 5 ng/mL）增殖培养条件下的P1代小鼠ACPCs,应用克隆形成实验和细胞增殖实验比较ACPCs的增殖能力;对其成骨诱导,采用茜素红S染色和RT-PCR检测成骨相关基因（Osteocalcin、AKP、Runx2）检测成骨潜能改变;对其成软骨诱导,进行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和RT-PCR检测成软骨相关基因（COMP、SOX9、Aggrecan、COL-Ⅱ）表达检测成软骨潜能改变。结果:（1）不同代次的小鼠ACPCs在形态上未有明显改变,细胞密度随着细胞代次增加降低。CCK-8和克隆形成实验结果显示随着细胞代次增加,ACPCs增殖能力降低。茜素红S染色和RT-PCR结果显示随着细胞代次增加,ACPCs成骨潜能降低。HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和RT-PCR结果显示,随着细胞代次的增加,ACPCs成软骨潜能未改变。（2）小鼠ACPCs的细胞形态随着bFGF浓度的升高由短梭形细胞变为两端细长的长梭形细胞,细胞密度在含有2 ng/mL bFGF浓度时最高。CCK-8和克隆形成实验结果显示2 ng/mL bFGF浓度时,ACPCs增殖能力相对最强。茜素红S和RT-PCR结果显示随着bFGF浓度的升高,ACPCs成骨潜能降低。HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、RT-PCR结果显示,2 ng/mL bFGF浓度时,ACPCs成软骨潜能相对最强。结论:小鼠ACPCs的增殖能力和成骨分化能力随着细胞代次的增加而降低,但成软骨分化能力未有明显下降;含有2ng/mL bFGF的α-MEM培养条件是一个相对合适的细胞扩增方案,能够有效促进ACPCs的扩增及维持成软骨潜能。第三部分小鼠ACPCs体内稳定性及抗血管化研究目的:研究小鼠ACPCs构建的软骨组织在体内的稳定性及阿西替尼对软骨组织的抗血管化作用。方法:取在含2 ng/mL bFGF的α-MEM完全培养基培养条件的P2代小鼠ACPCs,按照以下方式处理:（1）构建软骨细胞团块,诱导组（A组）经过3周体外成软骨诱导培养,对照组（B组）经过3周体外高糖标准培养基培养;（2）实验组（C组）以含阿西替尼的Gelatin-PCL静电纺丝材料作为支架,对照组（D组）以单纯Gelatin-PCL静电纺丝材料作为支架,应用“三明治模型”构建细胞材料复合物,体外成软骨诱导3周。将所有组植入BALB/C裸鼠背部皮下,A组和B组在术后第2、4、6周分别取出,C组和D组在术后6周取出,分别行HE、番红O-快绿染色及Ⅱ型胶原、X型胶原、VEGF-A免疫组化染色。结果:（1）B组细胞团块植入体内2周时开始出现软骨陷窝消失和软骨内骨化,且随着植入时间的延长骨化部位越来越多,最终整个细胞团块发生骨化。A组在体内2周时无骨化,在体内6周时出现软骨组织结构破坏并发生软骨内骨化。A组和B组中Ⅱ型胶原随着体内植入时间的增加而逐渐减少;X型胶原随着体内植入时间的增加逐渐增多;VEGF-A随着体内植入时间的延长而增加,在钙化组织周围有明显聚集。（2）HE染色和番红O-快绿染色结果显示D组在体内6周出现软骨内骨化,而C组在体内6周依然维持稳定的软骨表型;Ⅱ型胶原在C组高表达,D组无明显表达;X型胶原免疫组化在C组和D组中均有阳性区域;VEGF-A在D组钙化区域周围有阳性表达,在C组软骨组织内无阳性表达。结论:小鼠ACPCs在体外构建稳定的软骨组织后植入体内会产生软骨内骨化,软骨内骨化原因可能与血管形成有关;VEGF-A受体抑制剂阿西替尼在体内可以抑制小鼠ACPCs组织工程软骨的骨化。
黄智慧[7]（2019）在《MiR-337-3P通过PTEN/AKT通路促进骨关节炎软骨细胞增殖并抑制凋亡》文中认为第一部分 人骨关节炎软骨组织中miR-337-3p和PTEN的表达变化目的:通过测定人骨关节炎软骨组织中miR-337-3p和PTEN表达水平,并进行统计学分析,明确miR-337-3p和PTEN与OA的相关性。方法:取正常软骨组织和OA 软骨组织,qRT-PCR 测定 miR-337-3p 和 PTEN mRNA 表达水平,Westemblot 法测定PTEN蛋白表达水平,并进行统计学分析。结果:和正常软骨细胞相比,OA软骨细胞miR-337-3p表达明显降低,PTEN mRNA表达明显升高,具有统计学显着性差异,P<0.01。相关性分析显示,miR-337-3p和PTEN mRNA水平呈负相关。PTEN蛋白定量测定结果显示:OA软骨细胞PTEN蛋白表达显着升高,具有统计学显着性差异,P<0.01。结论:OA软骨细胞miR-337-3p表达降低,PTEN mRNA表达升高,两者呈负相关;PTEN蛋白表达升高,miR-337-3p可能参与调节OA的发生发展过程。第二部分过表达miR-337-3p促进OA软骨细胞增殖并抑制凋亡目的:通过测定miR-337-3p过表达后OA软骨细胞增殖的相关指标来明确miR-337-3p对软骨细胞增殖的影响。方法:OA软骨细胞过表达miR-337-3p后荧光倒置显微镜下观察软骨细胞密度。MTT法检测细胞活性,从侧面反映细胞增殖的能力。流式细胞术检测细胞周期、凋亡率及Ki-67表达,通过这些反应细胞增殖活性的指标来判断软骨细胞增殖情况。此外,我们采用qRT-PCR检测PTEN mRNA表达水平,Western blot检测PTEN蛋白表达水平及下游效应物蛋白表达水平,明确miR-337-3p对PTEN的调控和对软骨细胞增殖的影响。结果:过表达miR-337-3p后OA软骨细胞密度增加。经MTT法检测细胞显示OA软骨细胞活力增强。流式细胞术检测显示OA软骨细胞停滞在G0/GI期,而miR-337-3p过表达解除了这种阻断作用,促进DNA复制及细胞增殖活性。OA软骨细胞凋亡率（10.75±1.38）,过表达miR-337-3p后OA软骨细胞凋亡率（4.38±0.97）,凋亡率显着下降,其统计学差异具有显着性意义,P<0.01。同时,通过流式细胞术检测,miR-337-3p过表达后Ki-67（+）OA软骨细胞数明显增加,其统计学差异具有显着性,P<0.01。此外,qRT-PCR检测显示,OA软骨细胞PTEN mRNA相对表达水平（5.13±0.40）,过表达miR-337-3p后PTEN mRNA相对表达水平（2.43±0.43）,显着下降。Westemblot蛋白检测显示,miR-337-3p过表达后OA软骨细胞PTEN蛋白表达降低,下游磷酸化AKT（pAKT）升高,pAKT/AKT升高。结论:miR-337-3p过表达抑制了 PTEN mRNA及PTEN蛋白表达,促进了 PTEN/AKT通路下游效应物磷酸化,促进软骨细胞增殖,增强了软骨细胞活性,并抑制了软骨细胞凋亡。第三部分miR-337-3p调控PTEN表达目的:通过OA软骨细胞miR-337-3p过表达或表达抑制后检测PTEN mRNA和PTEN蛋白相对表达水平来验证miR-337-3p对PTEN的调控作用,并通过荧光素酶报告基因验证miR-337-3p和PTEN的结合位点和调控关系。方法:OA软骨细胞进行miR-337-3p过表达或表达抑制,采用qRT-PCR检测OA软骨细胞PTEN mRNA相对表达水平,与空白转染的OA软骨细胞进行对照。Western blot检测PTEN蛋白相对表达水平,并进行统计学分析。荧光素酶报告基因验证miR-337-3p和PTEN的结合位点,并对miR-337-3p过表达或表达抑制后的OA软骨细胞进行检测,比较荧光素酶相对活性。结果:OA软骨细胞过表达miR-337-3p后增殖增强。miR-337-3p和PTEN 3’UTR第109-116核苷酸相结合,并且过表达miR-337-3p后软骨细胞PTEN mRNA和PTEN蛋白相对表达降低。miR-337-3p和PTEN呈负性调节关系。结论:miR-337-3p过表达促进OA软骨细胞增殖。miR-337-3p通过与PTEN结合降低PTEN表达,从而激活PI3K/AKT通路,促进下游AKT磷酸化,从而促进软骨细胞增殖。第四部分PTEN通过PI3K/AKT通路调节软骨细胞生长目的:通过Si-PTEN（PTEN siRNA）转染OA软骨细胞并通过转染Si-NC进行对照,分析OA软骨细胞的增殖和凋亡的变化,并且检测下游效应物表达水平的变化,明确PTEN对PI3K/AKT通路的调控作用及对OA软骨细胞生长的影响。方法:流式细胞术分析细胞活性、细胞周期、细胞凋亡及Ki-67阳性细胞相对计数。qRT-PCR检测转染Si-PTEN后的PTEN mRNA表达。Westemblot检测下游AKT及pAKT蛋白表达水平。结果:通过转染Si-PTEN降低OA软骨细胞PTEN表达,激活PI3K/AKT信号通路,使下游效应分子AKT磷酸化增强,促进了软骨细胞的增殖。结论:PTEN是PI3K/AKT通路的重要调节因子,呈负性调节,抑制PTEN表达后激活PI3K/AKT通路,促进下游AKT磷酸化,使OA软骨细胞增殖增强。
杨迪[8]（2019）在《高糖环境下17β-雌二醇抑制大鼠髓核细胞凋亡和促进胞外基质合成的作用及初步机制探讨》文中进行了进一步梳理椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IVDD）性疾病在临床上发病率高,是导致成人劳动力受限的主要原因,给社会造成巨大的经济负担。糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者与非DM患者相比IVDD患病率显着升高,椎间盘内的高糖环境通过氧化应激（oxidative stress,OS）损伤引起髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPCs）数目减少、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）合成降解代谢紊乱是引起IVDD的因素之一。近年研究发现雌激素不但可以刺激胰岛素分泌改善胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）而且部分抑制NPCs凋亡,但是迄今尚未见关于17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）与高糖诱导NPCs凋亡相关方面的报道,因此,本实验首先通过胰酶联合Ⅱ型胶原酶体外分离培养并鉴定大鼠原代NPCs;再者探讨17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs凋亡及ECM合成代谢的影响并揭示其可能的机制,另外明确雌激素受体β（estrogen receptor β,ERβ）在其中的介导作用。第一部分 原代大鼠髓核细胞的体外分离培养及鉴定目的:原代大鼠NPCs体外分离培养及鉴定。方法:通过胰酶联合Ⅱ型胶原酶体外分离大鼠原代NPCs并传代;通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增产物电泳检测NPCs标志物基因碳酸酐酶12（carbonic anhydrase 12,CA12）、叉头框F1（forkhead box F1,FOXF1）、多效生长因子（pleiotrophin,PTN）,免疫细胞化学染色聚集蛋白聚糖（aggrecan,AGG）和Ⅱ型胶原（collagen Ⅱ,Col Ⅱ）及性别决定区Y高迁移率族蛋白盒9（Sry-type HMG box 9,SOX9）来鉴定大鼠原代NPCs。结果:成功分离培养、鉴定原代大鼠NPCs并传代。结论:通过细胞形态学、新型标志物基因、胞外基质标志蛋白及SOX9成功鉴定了NPCs。第二部分17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡及胞外基质合成的影响目的:离体试验中探讨17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs凋亡及ECM合成代谢的影响,并探讨ERβ在其中的介导作用。方法:原代NPCs传代,取第2代NPCs随机分为四组:高糖组（HG组,培养基中含有0.2 M葡萄糖）、高糖+17E2组（HG+17E2组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2）、高糖+17E2+ERB041 组（HG+17E2+ERB041 组,培养基中含有0.2 M 葡萄糖+10-7M 17β-E2+10 的 ERB041）、高糖+17E2+PHTPP 组（HG+17E2+PHTPP组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2+1μM的PHTPP）;干预72小时后,采用1)Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;2)实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测凋亡相关因子（Bcl-2、Bax、Caspase-3）的基因表达;3)Western blot 检测凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）细胞中的表达;4)RT-PCR检测ECM Col Ⅱ和AGG基因表达;5)免疫细胞化学染色检测ECM Col Ⅱ及AGG的蛋白表达。结果:高糖状态下大鼠NPCs凋亡率增加,ECM Col Ⅱ及AGG合成代谢减少;17β-E2干预后可以减少高糖状态下的大鼠NPCs的凋亡率,下调促凋亡因子（Bax、Caspase-3）基因表达,上调抗凋亡因子（Bcl-2）基因表达,降低凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）在细胞中的表达;增加ECM Col Ⅱ及AGG基因表达及蛋白表达;联合使用ER β受体激动剂ERB041及17β-E2较单用17β-E2进一步减少了高糖状态下NPCs凋亡率,下调促凋亡因子（Bax、Caspase-3）基因表达,上调抗凋亡因子（Bcl-2）基因表达,降低凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）在细胞中的表达;进一步增加了 ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢,联合使用ERβ受体抑制剂PHTPP及17β-E2较单用17β-E2增加了高糖状态下NPCs凋亡率,上调了促凋亡因子（Bax、Caspase-3）基因表达,下调了抗凋亡因子（Bcl-2）基因表达,增加了凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）在细胞中的表达;减弱了 ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢。结论:高糖状态下大鼠NPCs凋亡增加,ECM Col Ⅱ及AGG合成代谢减弱;17β-E2可通过ER β介导降低高糖状态下的大鼠NPCs的凋亡率,增加ECM Col Ⅱ及AGG的合成代谢。第三部分17β-雌二醇通过雌激素受体β介导抑制高糖状态下大鼠髓核细胞内氧化应激损伤目的:观察17β-E2对高糖环境下大鼠NPCs内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的影响,并明确其与ER β的相关性。方法:取第2代NPCs随机分为四组:高糖组（HG组,培养基中含有0.2 M葡萄糖）、高糖+17E2组（HG+17E2组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2）、高糖+17E2+ERB041组（HG+17E2+ERB041组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7 M 17β-E2+10 μM 的 ERB041）、高糖+17E2+PHTPP 组（HG+17E2+PHTPP 组,培养基中含有0.2 M葡萄糖+10-7M 17β-E2+1 μM的PHTPP）;干预72小时后,采用DCFH-DA法检测各组细胞内ROS水平。结果:各组细胞内ROS检测结果提示:HG+17E2组细胞内ROS水平低于HG组（P<0.05）,HG+17E2+ERB041 组细胞内 ROS 水平低于 HG+17E2 组（P<0.05）,HG+17E2+PHTPP 组细胞内 ROS 水平高于 HG+17E2组（P<0.05）。结论:17β-E2可降低高糖状态下大鼠NPCs内ROS水平,ER β介导这一过程发生。
齐勇建[9]（2017）在《外源物对人WJ-MSCs成软骨分化的抑制作用及相关机制研究》文中提出骨关节炎（osteoarthritis,OA）是中老年人的常见病和多发病,是一种以关节软骨慢性退行性病变为主要病理特征的关节疾病,是老年人群疼痛和致残的主要原因。关节软骨的基质主要是蛋白多糖（proteoglycan,PG）,它是软骨强度、组织弹性及关节润滑的物质基础,可以很好的维持软骨内稳态。PG由多条糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）链附着于一条核心蛋白组成,然后通过交联胶原纤维形成空间网状结构。基质的退变或减少程度,是评价软骨质量的主要指标。传统观点认为,OA主要由机械因素及年龄相关的软骨退变所致,但大样本流行病学研究发现,宫内发育迟缓（intranuterine growth retardation,IUGR）新生儿成年后手、髋等多关节OA易感。提示,OA可能具有发育起源。然而,发育源性OA的病因学复杂,病理生理机制不明,临床早期诊断和防治困难。华通胶间充质干细胞（Wharton’s jelly derived stem cells,WJ-MSCs）是一种相对原始的干细胞,来源广泛,保存了宫内不良环境对胎儿发育所产生的不良影响的印记,可以用于胎源性疾病的早期预警。WJ-MSCs可以定向分化为软骨细胞,在该分化过程中,转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGFβ）信号通路发挥了关键的调控作用,该通路的活化可以促进其下游的软骨基质表型靶基因（α1 chain oftype Ⅱ collagen,col2α1）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达。我们前期的研究发现,孕期外源物暴露（prenatal xenobioticexposure,PXE）可以导致IUGR并使胎儿暴露于高浓度母源性糖皮质激素（glucocorticoid,GC）中,进而软骨发育不良,出生后OA易感。但是IUGR新生儿来源的WJ-MSCs是否软骨定向分化不良?分化所得的软骨细胞经炎症诱导后是否易出现OA样退变表型?外源物暴露是如何影响软骨分化的?TGFβ信号通路在其中的作用如何,目前均不清楚。基于此,本研究首先提取正常新生儿来源WJ-MSCs,建立成熟的WJ-MSCs提取和培养技术,然后用不同浓度的外源物处理WJ-MSCs,探讨外源物对WJ-MSCs中软骨表型基因表达的影响及其上游相关通路的影响;之后提取正常及IUGR来源的WJ-MSCs,并检测其增殖和分化模型上WJ-MSCs中软骨表型基因表达的差异及其上游相关通路的差异,进一步通过白介素1β（interleukin 1β,IL-1β）进行诱导,明确宫内不良环境在WJ-MSCs上的印记作用及其对软骨定向分化的影响;在此基础上,我们用不同浓度的皮质醇干预正常来源的WJ-MSCs的定向分化过程,并检测其增殖和分化模型上WJ-MSCs中软骨表型基因表达的影响及其上游相关通路的影响,进一步通过IL-1β进行诱导,明确皮质醇过暴露对WJ-MSCs软骨定向分化后软骨质量的影响。在此基础上探讨TGFβ受体（TGFβ receptors,TGFβRs）作为胎源性OA早期预警标志物的可能性。该科学问题的阐明,有助于加深对胎源性OA发病机制的理解,明确TGFβRs在软骨基质合成中的作用,并进一步明确其作为胎源性OA预警标志物的可能性,为胎源性OA的早期预警奠定理论和实验基础。第一部分外源物对人WJ-MSCs软骨发育相关基因的抑制作用及可能机制目的:本实验室前期研究发现,孕期外源物暴露（prenatal xenobiotic exposure,PXE）所致大鼠IUGR（intrauterine growth retardation）模型上,软骨发育不良及成年后OA（osteoarthritis）易感,同时发现母源性糖皮质激素（glucocorticoid,GC）过暴露是其共性现象。人的华通胶间充质干细胞（wharton’sjelly derived stem cells,WJ-MSCs）是相对原始的干细胞,能提供出生体重与成年疾病长期效应关系的信息。为此,本研究建立人WJ-MSCs增殖模型,探讨多种外源暴露物（包括咖啡因、尼古丁、乙醇）对软骨分化标志基因（Col2α1 和 aggrecan）的影响,并从 GC 屏障 Egr-1（early growth response protein1）和 11β-HSD2（11β-hydroxysteroiddehydrogenasetypes2）和转化生长因子β（transforming growth factor β,TGFβ）信号通路探讨其发生机制。方法:原代WJ-MSCs的分离、鉴定。取第4代细胞,分别给予用DMEM/F12 1:1培养基配制的常用外源物咖啡因（终浓度分别为0、0.1、1.0、10、100μM）、尼古丁（终浓度分别为0、0.1、1.0、10、100μM）和乙醇（终浓度分别为0、15、30、60mM）,以上浓度均基于本实验室前期IUGR大鼠造模检测到的血液浓度换算而来。连续处理5天,隔天更换新鲜的培养液。正常对照组给予等体积培养基。MTS检测细胞存活状况,RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）检测 GC 屏障相关基因、TGFβ（transforming growth factor β）信号通路及软骨表型基因的表达。结果:流式细胞术检测发现,WJ-MSCs培养至4代时,已经较为纯化。不同浓度各种外源物处理WJ-MSCs 5天后,MTS法细胞代谢活力检测结果显示,本实验中所采用的三种外源物的不同浓度处理WJ-MSCs后,细胞的活力与对照组相比没有明显改变。RT-qPCR结果提示:高浓度的各种外源物均可以明显降低软骨表型基因Co12α·（collagen type Ⅱ alpha 1 chain）和 aggrecan 的表达（P<0.01）;各种外源物的最高浓度处理后,TGFβ信号通路的关键基因TGFβRⅡ/Ⅰ的表达均降低（P<0.01）;高浓度外源物处理 WJ-MSCs 后,GC 屏障相关基因 Egr-1（early growth response protein 1）表达增加（P<0.01）,11β-HSD2（11 β-hydroxysteroid dehydrogenase types 2）表达降低（P<0.01）。结论:本研究建立了稳定的人WJ-MSCs提取和体外培养体系。首次在人WJ-MSCs增殖模型上,证实多种外源暴露物（包括咖啡因、尼古丁、乙醇）对WJ-MSCs软骨标志基因（Col2α1和aggrecan）和GC屏障的抑制作用,推测宫内时期暴露的外源物可直接或间接通过损伤GC屏障导致局部组织的高GC暴露,进而通过抑制TGF β信号通路,导致软骨表型基因的降低。第二部分IUGR新生儿来源的人WJ-MSCs软骨定向分化潜能降低及潜在机制目的:流行病学研究发现出生体重与成年骨关节炎相关,第一部分的研究发现人WJ-MSCs增殖模型上,多种外源暴露物（包括咖啡因、尼古丁、乙醇）可以抑制软骨分化标志基因（Col2α1和aggrecan）、损伤GC屏障以及抑制TGFβ信号通路关键基因的表达,提示因宫内不良环境导致的宫内发育迟缓（IUGR）新生儿来源的WJ-MSCs可能存在软骨定向分化潜能降低。本研究拟首先在人WJ-MSCs软骨三维定向分化模型上探讨其软骨分化潜能;进一步在人IUGR来源的WJ-MSCs增殖模型上探讨GC屏障关键基因和软骨分化基因的表达变化,探讨其初步发生机制。方法:按照实验室已经建立的WJ-MSCs提取方法,分别提取正常新生儿及IUGR新生儿来源的原代WJ-MSCs,分别传代至第4代后,建立增殖和软骨细胞三维定向分化模型。在增殖模型上,均以普通培养基培养5天后,检测正常及IUGR来源的WJ-MSCs软骨细胞表型基因、TGFβ信号通路及GC屏障相关基因的表达。在海藻酸钠（sodium alginate）微球软骨细胞三维分化模型上,以相同的分化培养基分化21天,取部分微球固定,进行蕃红O（safranineO）和阿利新蓝（alcianblue）特殊染色分析;部分微球被溶解用于提取总RNA,RT-qPCR检测软骨细胞表型基因和TGFβ信号通路相关基因表达;其余的微球加入IL-1β处理24h进行OA造模,造模后的微球取部分用于进行蕃红O和阿利新蓝特殊染色分析,然后将另一部分微球溶解,RT-qPCR检测软骨细胞表型基因和基质降解相关基因表达。以流式细胞术检测不同来源的WJ-MSCs中阳性表达TGFβRⅡ和TGFβRⅠ的细胞比例。结果:在增殖模型上,与正常组相比,IUGR组软骨表型基因Col2α1（collagen typeⅡ alpha1chain,Col2α1）和aggrecan的表达降低（P<0.01）;TGFβ信号通路的关键基因 TGFβRⅡ/Ⅰ 的表达低（P<0.05,P<0.01）;Egr-1 表达升高（P<0.01）,而 11βp-HSD2表达降低（P<0.01）,提示IUGR来源的WJ-MSCs受宫内不良因素暴露已经产生了 GC屏障损伤的印记,且TGFβ信号通路功能。在分化模型上,IUGR组基质合成比正常组少,表现为番红O和阿利新蓝染色浅、细胞数减少以及aggrecan、Col2α1表达降低,其上游的TGFβ信号通路中,TGFβRs的mRNA表达较正常组降低;经IL-1β诱导后,IUGR组软骨细胞OA易感,与正常组比较,表现为番红O和阿利新蓝染色更浅、细胞数更少,aggrecan、Col2α1表达进一步降低,基质金属蛋白酶MMP3、13和ADAMTS5表达升高,提示基质降解增加。流式细胞术检测发现,IUGR来源的WJ-MSCs中,阳性表达TGFβRⅡ和TGFβRⅠ的细胞比例明显低于正常来源的WJ-MSCs。结论:本研究首次在增殖和软骨三维定向分化模型上,证实IUGR患儿来源的人WJ-MSCs的软骨分化不良以及经IL-1β造模后的骨关节炎样退变表型易感,推测,宫内时期IUGR新生儿的WJ-MSCs中GC屏障损伤,导致了局部的GC过暴露,使其TGFβ信号通路抑制,且该抑制效应具有编程效应,最终导致其TGFβRs阳性细胞减少且软骨分化不良。第三部分皮质醇对人WJ-MSCs软骨分化抑制及骨关节炎易感的表遗传调控机制目的:已知宫内不良环境下过暴露的高GC可通过表遗传方式影响基因的持续表达,进而影响组织生长发育。我们前期发现,孕期外源物暴露所致大鼠IUGR模型中均存在母源性GC过暴露共性现象。本课题已在第一部分人WJ-MSCs增殖模型上,证实多种外源物暴露（包括咖啡因、尼古丁、乙醇）所致WJ-MSCs软骨标志基因（Col2α1和aggrecan）降低可能部分来源于GC屏障损伤导致的GC过暴露介导的TGFβ信号通路抑制;且在第二部分证实IUGR患儿来源的人WJ-MSCs细胞GC屏障损伤、软骨分化不良以及经IL-1β造模后的骨关节炎样退变表型易感,以上提示高GC可能通过表遗传印记致使TGFβ低表达,介导了 IUGR来源的WJ-MSs软骨分化不良,但目前机制尚不明确。因此,本研究在建立的WJ-MSCs软骨三维定向分化模型上,证实不同浓度皮质醇对正常来源WJ-MSCs软骨分化及骨关节炎易感的影响,并初步探讨TGFβRs表遗传印记作为胎源性OA早期预测靶标的可能性。方法:取第4代生长状态良好的WJ-MSCs,建立海藻酸钠微球三维软骨细胞定向分化模型,以150、300、600及1200 nM浓度皮质醇处理细胞。在增殖模型上,MTS法检测皮质醇对细胞增殖的影响;现象层面:在分化模型上以不同浓度皮质醇处理WJ-MSCs微球21天,观察形态学改变并检测表型基因和TGFβ信号通路相关基因的表达变化;进一步,给予IL-1β处理24h（OA造模）,观察形态学改变并检测软骨表型基因和TGFβ信号通路相关基因的表达变化。机制层面:在三维定向分化模型上以0、300及1200 nM皮质醇联合GR拮抗剂处理细胞7天,检测软骨细胞表型基因、TGFβ信号通路关键基因的蛋白及mRNA表达变化,CHIP-PCR检测TGFβRs及软骨细胞表型基因Col2α1和aggrecan在组蛋白H3K9、H3K14和H3K27的乙酰化改变。结果:不同浓度皮质醇作用WJ-MSCs 5天,MTS法检测显示各浓度皮质醇组细胞代谢活力与对照组相比无明显改变。不同浓度皮质醇处理WJ-MSCs成软骨分化21天和经,番红O和阿利新蓝染色显示病理浓度（600和1200 nM）皮质醇处理组基质合成较生理浓度组（150和300nM）减少;RT-PCR显示病理浓度组Col2α1、aggrecan及其上游的TGFβ3受体Ⅰ和Ⅱ的mRNA表达较生理浓度组显着降低（P<0.01）。进一步经IL-1β诱导后,较生理浓度组（150和300 nM）相比,病理浓度（600和1200 nM）皮质醇组番红O和阿利新蓝染色变浅,表型基因和TGFβ通路的mRNA表达显着降低（P<0.01）;但基质金属蛋白酶MMP3、13和ADAMTS5表达呈浓度依赖性升高（P<0.01）,提示基质降解增加。同时,与生理浓度皮质醇相比,RT-PCR显示米非司酮可以部分逆转病理浓度皮质醇对 TGFβRⅡ/Ⅰ、Col2α1、aggrccan的表达抑制作用（P<0.05,P<0.01）,CHIP-PCR显示病理浓度皮质醇可以抑制TGFβRⅡ/Ⅰ的组蛋白H3K9乙酰化水平,米非司酮可以部分逆转病理浓度皮质醇对TGFβRⅡ/Ⅰ的H3K9去乙酰化作用。结论:本研究首次发现高浓度的皮质醇可直接诱导人WJ-MSCs软骨定向分化不良及骨关节炎样退变表型易感,并证实其机制为高浓度皮质醇通过激活糖皮质激素受体（GR）诱导TGFβRs组蛋白H3K9去乙酰化,进而抑制TGFβ信号通路及软骨分化标志基因（Col2α1和aggrecan）表达,导致软骨分化不良。TGFβRs去乙酰化可作为IUGR新生儿OA易感的预警分子标志物。
李鹏飞[10]（2015）在《规模化养殖场肉鸡腿病情况调查及bFGF在肉鸡股骨头坏死发生中的作用机理研究》文中研究说明随着肉鸡养殖规模化和集约化的发展,肉鸡的生产性能得到显着提升的同时,肉鸡腿病发生率在我国呈显着上升的趋势,严重影响了肉鸡养殖的经济效益和动物福利。肉鸡腿病种类众多,常见的包括胫骨发育不良（Tibialdyschondroplasia,TD）,股骨头坏死（femoralheadnecrosis,FHN）,佝偻病（Rickets）等。而在众多腿病中,股骨头坏死常导致患鸡跛行而不能正常饮水和采食,影响尤为重大。股骨头坏死发生机理比较复杂,目前尚无定论,由于干骺端软骨细胞的凋亡会影响股骨头血液灌流,从而导致股骨头因缺乏营养供应而坏死,因此本试验从细胞凋亡的角度出发尝试探讨该病可能的发生机理。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）在成骨细胞内合成并储存,它对骨细胞的前期增殖发挥有效的刺激作用的同时也对软骨细胞有着抗凋亡的作用。目前有关bFGF对骨细胞凋亡以及进而导致肉鸡FHN发生的报道鲜有所见。本研究的目的在于对我国规模化肉鸡养殖场肉鸡腿病的发生情况进行调查,同时对在肉鸡FHN发生中bFGF的作用及其对肉鸡软骨细胞凋亡的影响进行了探讨。1、规模养殖场肉鸡腿病情况调查对安徽省某集团公司9个肉鸡养殖场进行肉鸡腿病流行病学调查,并根据已有的肉鸡步态评分方法对发病肉鸡进行步态评分;然后,随机选取10只发病肉鸡进行扑杀,并在每个养殖场取10只正常肉鸡作对照,对扑杀的肉鸡进行病理剖检和骨组织采样,取病料进行微生物学检测和病理组织学观察;最后,结合各种诊断结果对样品中每只肉鸡腿病的类型作出诊断,并对所有的腿病进行分类、统计和分析。结果:肉鸡腿病发病率为2.07%,症状轻微的肉鸡占发病鸡总量的50.92%,有明显跛行的肉鸡占发病鸡总量的20.66%,丧失行走能力的占28.42%。实验室诊断发现,导致肉鸡跛行的主要病因是细菌感染,占发病鸡总量的36.67%;在非细菌感染病例中,TD占发病鸡比重最高,达到34.44%,而FHN占发病鸡总量的13.33%;此外,外伤骨折和部分未知原因发生腿病的肉鸡分别占发病鸡总量的6.67%和8.89%。2、bFGF在自然发病肉鸡股骨头坏死中的作用机理研究选取100只健康的1日龄Ross308白羽肉鸡为试验动物,自由采食饲养,42日龄后将所有的鸡称重并处死。通过剖检观察股骨头完整性以及股骨生长板形态变化并进行FHN评分,并分别对肝指数、软骨细胞细胞凋亡数量、bFGF和凋亡相关基因的表达、骨长、骨指数、骨强度、骨密度和骨灰分进行测定。结果发现,FHN发病率为20.9%;肉鸡在体重、肝指数、骨长、骨重、骨强度和骨密度上差异不显着,FHN肉鸡胫骨灰分重占干重比明显低于未发生腿病肉鸡,股骨头软骨细胞脂肪空泡数量和凋亡数量都明显高于未发生腿病肉鸡,但静止区软骨细胞数量上,未发生腿病肉鸡与FHN差异不显着;FHN肉鸡股骨头生长板bFGF蛋白表达量明显低于未发生腿病肉鸡,Bax和caspases-3的RNA表达量显着升高,bFGF和Bcl-2 RNA表达量显着降低。上述结果表明,生长板软骨细胞凋亡在肉鸡FHN发生的过程中扮演着重要的角色,而bFGF通过调节凋亡相关基因的表达介导软骨细胞凋亡并进而影响着肉鸡FHN的发生。
二、bFGF对人关节软骨细胞增殖和凋亡的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、bFGF对人关节软骨细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
（1）龙鳖胶囊通过miR-675靶向TBK1调控细胞自噬影响软骨细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 骨关节炎中西医诊疗文献研究 |
| 1.1 OA现代医学研究概况 |
| 1.1.1 OA概述 |
| 1.1.2 OA的流行病学研究 |
| 1.1.3 OA的发病机制研究 |
| 1.1.4 自噬与OA的关系 |
| 1.1.5 KOA现代医学诊疗研究概述 |
| 1.2 KOA中医研究概况 |
| 1.2.1 KOA的中医病因病机研究 |
| 1.2.2 KOA的中医证候学研究 |
| 1.2.3 KOA的中医治疗研究进展 |
| 1.2.4 补肾活血中药治疗KOA的临床研究进展 |
| 1.2.5 补肾活血中药治疗KOA的机制研究 |
| 1.2.6 龙鳖胶囊治疗KOA的研究概况 |
| 第二章 miR-675和TBK1在OA大鼠关节软骨中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器或耗材 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SD大鼠OA模型的制作 |
| 2.2.2 SD大鼠实验取材 |
| 2.2.3 病理切片制作和关节软骨染色 |
| 2.2.4 提取软骨组织或软骨细胞的RNA |
| 2.2.5 RNA逆转录操作流程 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 2.2.7 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HE染色结果 |
| 2.3.2 番红-O-固绿染色结果 |
| 2.3.3 miR-675在SD大鼠OA模型关节软骨中的表达 |
| 2.3.4 TBK1在SD大鼠OA模型关节软骨中的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR-675靶向TBK1影响OA软骨细胞相关功能的机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器或耗材 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 人OA软骨组织标本 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 人OA原代软骨细胞的分离提取 |
| 3.2.2 人OA原代软骨细胞的培养换液 |
| 3.2.3 人OA原代软骨细胞的传代培养 |
| 3.2.4 人OA原代软骨细胞的冻存 |
| 3.2.5 人OA原代软骨细胞的复苏培养 |
| 3.2.6 人OA原代软骨细胞蛋白的提取及浓度测定 |
| 3.2.7 甲苯胺蓝染色 |
| 3.2.8 Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色 |
| 3.2.9 CCK-8细胞活性检测 |
| 3.2.10 蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB) |
| 3.2.11 细胞凋亡检测(流式细胞术) |
| 3.2.12 EdU细胞增殖检测 |
| 3.2.13 siRNA转染技术 |
| 3.2.14 慢病毒转染技术 |
| 3.2.15 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.16 提取人OA软骨细胞RNA |
| 3.2.17 实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 3.2.18 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人OA软骨细胞的分离、提取与鉴定 |
| 3.3.2 miR-675对软骨细胞相关功能的影响 |
| 3.3.3 TBK1对软骨细胞相关功能的影响 |
| 3.3.4 miR-675靶向TBK1对OA软骨细胞相关功能的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 人OA原代软骨细胞分离提取的方法学探讨 |
| 3.4.2 miR-675对软骨细胞相关功能的影响 |
| 3.4.3 TBK1对软骨细胞相关功能的影响 |
| 3.4.4 miR-675靶向TBK1对OA软骨细胞相关功能的影响 |
| 第四章 基于miR-675/TBK1信号轴研究龙鳖胶囊调控自噬影响软骨细胞功能的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器或耗材 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 人OA原代软骨细胞 |
| 4.1.5 实验药物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 龙鳖胶囊含药血清的制备 |
| 4.2.2 CCK-8细胞活性检测 |
| 4.2.3 蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB) |
| 4.2.4 细胞凋亡检测(流式细胞术) |
| 4.2.5 EdU细胞增殖检测 |
| 4.2.6 siRNA转染技术 |
| 4.2.7 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞相关功能的影响 |
| 4.3.2 龙鳖胶囊调控miR-675/TBK1信号轴影响软骨细胞功能的分子机制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 中药复方含药血清在中医药基础研究中的优势 |
| 4.4.2 龙鳖胶囊含药血清最佳干预浓度的选择 |
| 4.4.3 龙鳖胶囊含药血清对软骨细胞相关功能的影响 |
| 4.4.4 龙鳖胶囊通过miR-675/TBK1信号轴调控细胞自噬影响软骨细胞功能的分子机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 FGF2在不同程度腰椎退行性变患者软骨终板组织标本中的表达 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 外源性FGF2对正常软骨终板细胞的代谢调控影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 体外诱导软骨终板细胞变性中的代谢调控及Caspase-3、bcl-2表达的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 外源性FGF2联合FGFR1阻断剂对于延迟软骨终板细胞变性的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3结果 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生长因子治疗椎间盘退行性变的分子机制及应用现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（3）bFGF联合琼脂糖凝胶预植入促进异体移植后全层软骨缺损修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.1.1 骨髓刺激技术 |
| 1.1.2 自体全层软骨移植 |
| 1.1.3 同种异体全层软骨移植 |
| 1.1.4 组织工程学修复 |
| 1.2 国内外相关工作研究进展 |
| 1.2.1 炎性因子对骨与软骨修复影响的研究 |
| 1.2.2 生长因子对骨与软骨修复影响的研究 |
| 1.2.3 琼脂糖对骨与软骨修复影响的研究 |
| 1.3 本文研究思路、内容及技术路线 |
| 2 骨髓间充质干细胞联合多孔钽/Bio-Gide胶原膜修复全层软骨缺损的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验主要设备 |
| 2.2.2 实验主要试剂 |
| 2.2.3 实验对象与分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 兔BMSCs的提取培养 |
| 2.3.2 兔BMSCs免疫荧光染色 |
| 2.3.3 兔BMSCs流式细胞学检测 |
| 2.3.4 BMSCs与Bio-Gide胶原膜、多孔钽共培养 |
| 2.3.5 体内实验手术操作 |
| 2.3.6 兔股骨头组织学染色 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 BMSCs细胞生长曲线 |
| 2.4.2 BMSCs细胞免疫荧光染色检测 |
| 2.4.3 BMSCs细胞流式细胞学检测 |
| 2.4.4 BMSC与Bio-Gide胶原膜、多孔钽共培养后形态学检测 |
| 2.4.5 兔股骨头组织学染色及评分 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 大鼠软骨细胞体外培养鉴定及不同浓度bFGF对大鼠软骨细胞的促增殖作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验主要设备 |
| 3.2.2 实验主要试剂 |
| 3.2.3 实验对象与分组 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 鼠膝关节软骨组织提取 |
| 3.3.2 软骨细胞的分离、培养与传代 |
| 3.3.3 软骨细胞增殖检测 |
| 3.3.4 软骨细胞组织学检测 |
| 3.3.5 bFGF对软骨细胞增殖的影响 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 软骨细胞形态观察 |
| 3.4.2 软骨细胞生长曲线 |
| 3.4.3 组织学检测结果 |
| 3.4.4 bFGF对软骨细胞增殖的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 鼠全层软骨同种同体/异体移植术后急性免疫反应强度变化的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验主要设备 |
| 4.2.2 实验主要试剂 |
| 4.2.3 实验对象与分组 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 流式细胞学检测 |
| 4.3.2 组织学检测 |
| 4.3.3 大鼠外周血炎性因子ELISA检测 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 炎性细胞变化流式细胞学结果 |
| 4.4.2 免疫反应强度的组织学结果 |
| 4.4.3 外周血炎性因子ELISA检测结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 bFGF和琼脂糖凝胶预植入逃避大鼠免疫杀伤促进全层软骨异体移植修复的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验主要设备 |
| 5.2.2 实验主要试剂 |
| 5.2.3 实验对象与分组 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 琼脂糖支架复合体的制备 |
| 5.3.2 手术与分组操作 |
| 5.3.3 流式细胞术分析 |
| 5.3.4 组织学检测 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 移植部位的宏观检查 |
| 5.4.2 炎性细胞的变化 |
| 5.4.3 软骨修复的组织学分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）BMP5促进软骨细胞衰老和凋亡在骨关节炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨关节炎 |
| 1.2 关节软骨 |
| 1.3 软骨下骨 |
| 1.4 滑膜 |
| 1.5 骨关节炎的生物治疗 |
| 1.6 细胞衰老与骨关节炎 |
| 1.7 软骨细胞凋亡与骨关节炎 |
| 1.8 MAPK信号通路与骨关节炎 |
| 1.9 研究意义与目的 |
| 参考文献 |
| 第二章 BMP5通过促进软骨细胞衰老和凋亡加速骨关节炎病程进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法和材料 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 BMP5调控MAPK信号通路在骨关节炎中的作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法和材料 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）富血小板血浆来源外泌体在治疗兔膝骨关节炎中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分: 富血小板血浆来源外泌体的提取及鉴定分析 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 富血小板血浆来源外泌体对体外骨关节炎软骨细胞的作用及机制研究 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 富血小板血浆来源外泌体在体内修复骨关节炎软骨损伤的实验研究 |
| 背景 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述：富血小板血浆及其来源外泌体的临床应用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英语文章 |
（6）小鼠关节软骨来源祖细胞体外软骨组织构建及体内抗血管化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 小鼠关节软骨来源祖细胞的提取与鉴定 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠ACPCs的增殖和成骨、成软骨分化能力研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 小鼠ACPCs体内稳定性和抗血管化研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究小结与展望 |
| 综述 关节软骨来源祖细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）MiR-337-3P通过PTEN/AKT通路促进骨关节炎软骨细胞增殖并抑制凋亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 人OA软骨组织中miR-337-3p和PTEN的表达变化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 过表达miR-337-3p促进OA软骨细胞增殖并抑制凋亡 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 miR-337-3p调控PTEN表达 |
| 一、主要试剂与材料 |
| 二、实验步骤 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 PTEN通过PI3K/AKT信号通路调节软骨细胞生长 |
| 一、主要仪器及试剂 |
| 二、实验步骤 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述（一）膝关节骨关节炎关节内治疗的进展 |
| 参考文献 |
| 综述（二）生长因子、炎性细胞因子和miRNA差异表达在人骨关节炎中的研宄进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）高糖环境下17β-雌二醇抑制大鼠髓核细胞凋亡和促进胞外基质合成的作用及初步机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 原代大鼠髓核细胞的体外分离培养及鉴定 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第一部分 讨论 |
| 第一部分 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡及胞外基质合成的影响 |
| 一、17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 二、17β-雌二醇对高糖环境下的大鼠髓核细胞胞外基质合成的影响 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第二部分 讨论 |
| 第二部分 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 17β-雌二醇通过雌激素受体β抑制高糖状态下大鼠髓核细胞内氧化应激损伤 |
| 引言 |
| 1. 实验材料和仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 代谢综合征与椎间盘退变关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 雌激素及其受体对椎间盘退变的影响 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注释表 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）外源物对人WJ-MSCs成软骨分化的抑制作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 第一部分 外源物对人WJ-MSCs软骨发育相关基因的抑制作用及可能机制 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 药品与试剂 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 人WJ-MSCs的提取及培养 |
| 2.5 人WJ-MSCs的流式细胞术鉴定 |
| 2.6 不同浓度外源物对人WJ-MSCs增殖的影响 |
| 2.7 不同浓度外源物对人WJ-MSCs增殖模型相关基因表达的影响 |
| 2.8 荧光实时定量PCR检测WJ-MSCs的mRNA表达水平 |
| 2.9 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 WJ-MSCs的提取及鉴定 |
| 3.2 外源物对WJ-MSCs增殖的影响 |
| 3.3 不同浓度外源物对WJ-MSCs软骨表型基因表达的影响 |
| 3.4 不同浓度外源物对WJ-MSCs TGFβ通路和GC屏障相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 IUGR新生儿来源的人WJ-MSCs软骨定向分化潜能降低及可能相关机制 |
| 5 材料和方法 |
| 5.1 药品与试剂 |
| 5.2 实验对象 |
| 5.3 实验仪器 |
| 5.4 正常及IUGR来源WJ-MSCs的提取 |
| 5.5 流式细胞术检测不同来源WJ-MSCs中表达TGFβRs的细胞比例 |
| 5.6 WJ-MSCs海藻酸钠微球软骨细胞三维定向分化模型的建立 |
| 5.7 WJ-MSCs软骨定向分化 |
| 5.8 IL-1β诱导分化后的细胞OA造模 |
| 5.9 MTS检测WJ-MSCs的活力 |
| 5.10 海藻酸钠微球的处理和检测 |
| 5.11 数据统计 |
| 6 结果 |
| 6.1 GC屏障和TGFβ通路关键基因在IUGR来源WJ-MSCs中的表达 |
| 6.2 流式细胞术检测不同来源WJ-MSCs表达TGFβRs的细胞比例 |
| 6.3 MTS法检测WJ-MSCs分化结束后的细胞活性 |
| 6.4 IUGR来源的WJ-MSCs软骨定向分化潜能 |
| 6.5 IL-1β对人WJ-MSCs软骨定向分化后细胞进行OA造模 |
| 7 讨论 |
| 7.1 本研究建立了稳定的人WJ-MSCs三维体外软骨分化系统 |
| 7.2 人IUGR患儿WJ-MSCs存在软骨分化功能低下 |
| 7.3 人IUGR患儿WJ-MSCs软骨细胞分化后易出现骨关节炎样退变表型 |
| 7.4 人IUGR患儿WJ-MSCs可能存在GC屏障损伤易感 |
| 7.5 人IUGR患儿WJ-MSCs软骨定向分化效率低下 |
| 第三部分 皮质醇对人WJ-MSCs软骨分化抑制的表遗传调控机制 |
| 8 材料和方法 |
| 8.1 药品与试剂 |
| 8.2 实验对象 |
| 8.3 实验仪器 |
| 8.4 人原代WJ-MSCs的提取 |
| 8.5 不同浓度皮质醇处理5天人原代WJ-MSCs细胞活力的检测 |
| 8.6 WJ-MSCs海藻酸钠微球软骨细胞三维定向分化模型的建立 |
| 8.7 人WJ-MSCs软骨定向分化模型的建立及处理 |
| 8.8 IL-1β诱导分化后的细胞OA造模 |
| 8.9 人WJ-MSCs软骨定向分化微球标本的处理 |
| 8.10 人WJ-MSCs定向分化标本蕃红O及阿利新蓝特殊染色 |
| 8.11 荧光实时定量PCR检测软骨细胞mRNA表达水平 |
| 8.12 Western blotting检测WJ-MSCs分化后总蛋白表达 |
| 8.13 ChIP-PCR检测WJ-MSCs中TGFβRs、Col2α1及aggrecan基因的组蛋白修饰 |
| 8.14 数据统计 |
| 9 结果 |
| 9.1 MTS法检测皮质醇处理对WJ-MSCs细胞活力的影响 |
| 9.2 不同浓度皮质醇对人WJ-MSCs软骨定向分化潜能的影响 |
| 9.3 IL-1β对人WJ-MSCs软骨定向分化后细胞进行OA造模 |
| 9.4 GR介导了高浓度皮质醇所致人WJ-MSCs软骨定向分化抑制 |
| 9.5 TGFβRs组蛋白去乙酰化介导高浓度皮质醇所致人WJ-MSCs软骨定向分化抑制 |
| 9.6 GR介导了人WJ-MSCs软骨定向分化过程中TGFβRs的组蛋白去乙酰化改变 |
| 10 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（10）规模化养殖场肉鸡腿病情况调查及bFGF在肉鸡股骨头坏死发生中的作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 规模养殖场肉鸡腿病的发病现状 |
| 1 规模养殖场主要肉鸡腿病类型 |
| 1.1 细菌性骨髓炎软骨坏死 |
| 1.2 肢体内外翻畸形 |
| 1.3 胫骨软骨发育不良 |
| 1.4 股骨头坏死 |
| 2 肉鸡腿病的主要病因 |
| 2.1 感染 |
| 2.1.1 细菌感染 |
| 2.1.2 病毒或支原体感染 |
| 2.2 非感染性病因 |
| 2.2.1 遗传选育 |
| 2.2.2 生长速率 |
| 2.2.3 饲料转化率提高以及肉鸡胴体组成 |
| 2.2.4 运动量 |
| 2.2.5 昼夜节律 |
| 2.2.6 营养成分 |
| 2.2.7 饲养密度 |
| 3 肉鸡腿病的影响 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 肉鸡股骨头坏死的研究进展及生长板软骨内成骨的调节机制 |
| 1 股骨头坏死临床与病理变化 |
| 2 股骨头坏死的发病机制 |
| 2.1 创伤性股骨头坏死 |
| 2.2 非创伤性股骨头坏死 |
| 2.2.1 脂肪代谢紊乱 |
| 2.2.2 血液灌流不足 |
| 2.2.3 机械压力 |
| 2.2.4 细胞凋亡 |
| 3 软骨内成骨调控 |
| 3.1 软骨内成骨 |
| 3.2 软骨内成骨的调控 |
| 3.2.1 Ihh/PTHrP信号系统 |
| 3.2.2 成纤维细胞生长因子信系统 |
| 3.2.3 骨形态发生蛋白信号系统 |
| 3.2.4 SOX9蛋白 |
| 3.2.5 Runx2蛋白 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 规模养殖场肉鸡腿病情况调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器与设备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 调查与检测方法 |
| 1.3.1 肉鸡腿病流行病学调查 |
| 1.3.2 病鸡剖检及样品采集与处理 |
| 1.3.3 石蜡切片制作及HE染色 |
| 2 调查结果与分析 |
| 2.1 肉鸡腿病发病率 |
| 2.2 步态分析结果 |
| 2.3 肉鸡腿病检测结果及各种腿病的发病率 |
| 2.3.1 大肠杆菌感染 |
| 2.3.2 金黄色葡萄球菌感染 |
| 2.3.3 股骨头坏死(FHN) |
| 2.3.4 胫骨软骨发育不良(TD) |
| 2.3.5 外伤性骨折 |
| 2.3.6 未知原因性腿病 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肉鸡腿病调查 |
| 3.2 肉鸡腿病步态分析 |
| 3.3 肉鸡腿病及发病原因 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 bFGF在自然发病肉鸡股骨头坏死中的作用机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 样品处理 |
| 1.5 骨骼生物学指标检测 |
| 1.5.1 骨指数 |
| 1.5.2 骨放射密度检测 |
| 1.5.3 骨强度检测 |
| 1.5.4 胫骨灰分比重检测 |
| 1.6 石蜡切片制作及HE染色 |
| 1.7 免疫组织化学染色 |
| 1.8 TUNEL染色检测细胞凋亡 |
| 1.9 实时荧光定量PCR检测bFGF及凋亡相关基因的表达 |
| 1.9.1 总RNA提取与纯化 |
| 1.9.2 RNA反转录 |
| 1.9.3 引物设计与合成 |
| 1.9.4 实时荧光定量PCR |
| 2 数据分析与统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FHN发病情况及评分结果 |
| 3.2 料肉比、体重及肝指数结果及分析 |
| 3.3 骨形态计量学检测结果及分析 |
| 3.4 HE染色结果 |
| 3.5 免疫组化bFGF蛋白表达检测结果 |
| 3.6 TUNEL凋亡检测结果 |
| 3.7 bFGF,Bcl-2,Bax和caspases-3 mRNA表达水平变化 |
| 3.8 相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肉鸡股骨头坏死与评分 |
| 4.2 骨骼形态计量学变化 |
| 4.3 FHN组织病理学检查 |
| 4.4 bFGF在肉鸡股骨头坏死中的作用机制 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
四、bFGF对人关节软骨细胞增殖和凋亡的影响（论文参考文献）
- [1]龙鳖胶囊通过miR-675靶向TBK1调控细胞自噬影响软骨细胞功能的机制研究[D]. 黄和涛. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]FGF2通过调节Caspase-3、bcl-2表达在改善软骨终板退行性变的代谢调控及相关机制研究[D]. 宋华. 山东大学, 2021(11)
- [3]bFGF联合琼脂糖凝胶预植入促进异体移植后全层软骨缺损修复的研究[D]. 杨帆. 大连理工大学, 2021
- [4]BMP5促进软骨细胞衰老和凋亡在骨关节炎中的作用及机制研究[D]. 赵畅. 南方医科大学, 2020(01)
- [5]富血小板血浆来源外泌体在治疗兔膝骨关节炎中的作用及机制研究[D]. 刘绪昌. 山东大学, 2020(08)
- [6]小鼠关节软骨来源祖细胞体外软骨组织构建及体内抗血管化研究[D]. 沈序. 苏州大学, 2019(04)
- [7]MiR-337-3P通过PTEN/AKT通路促进骨关节炎软骨细胞增殖并抑制凋亡[D]. 黄智慧. 苏州大学, 2019(04)
- [8]高糖环境下17β-雌二醇抑制大鼠髓核细胞凋亡和促进胞外基质合成的作用及初步机制探讨[D]. 杨迪. 苏州大学, 2019(04)
- [9]外源物对人WJ-MSCs成软骨分化的抑制作用及相关机制研究[D]. 齐勇建. 武汉大学, 2017(06)
- [10]规模化养殖场肉鸡腿病情况调查及bFGF在肉鸡股骨头坏死发生中的作用机理研究[D]. 李鹏飞. 南京农业大学, 2015(06)