一、转化生长因子β_1对人肝癌细胞的作用机制研究(英文)（论文文献综述）
顾霞,王平义,赵万花,林语诗,李一梅,李文华[1]（2022）在《外泌体介导低氧相关信号通路在疾病发生发展中的重要作用》文中指出背景:目前,外泌体在低氧相关疾病及肿瘤疾病中作为疾病诊断的新生物标记物已取得瞩目的研究成果,成为预防和治疗低氧相关疾病的潜力选手。目的:从分子水平出发,综述外泌体干扰低氧相关信号通路改变低氧相关疾病发生发展过程的机制,为低氧相关疾病的研究和治疗提供依据。方法:以"hypoxia,exosomes,signal pathway"为英文检索词,以"低氧、外泌体、信号通路"为中文检索词,应用计算机检索2016年1月至2021年5月年PubMed、Medline、中国知网和万方数据库发表的相关文献,最终纳入文献56篇进行归纳分析。结果与结论:（1）低氧环境下,外泌体与一些低氧相关信号通路密切相关且互相调控,外泌体介导的低氧信号通路可能参与调控低氧相关疾病和肿瘤的发病过程。（2）外泌体经供体细胞释放,携带其信息由受体细胞接受,通过低氧诱导因子、磷脂酰肌醇三激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶（PI3K/Akt）、核转录因子κB及转化生长因子β等与低氧相关的信号通路,介导疾病中的免疫应答、细胞增殖、迁移、血管生成及肿瘤侵袭等重要生理病理过程。（3）在低氧相关炎症疾病中,外泌体可诱导上述各低氧信号通路的激活,以减轻炎症损伤。（4）但在肿瘤疾病中,外泌体虽然诱导了上述各低氧信号通路激活,却促进肿瘤部位的血管生成,促进肿瘤细胞的侵袭和转移,使肿瘤进展加速,而这种作用可能与外泌体的细胞供体来源有关,但其具体调控机制仍需未来研究进一步明确。
陈凯[2]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中研究表明一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
刘皎皎[3]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中提出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
陈乞[4]（2021）在《地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究》文中提出背景和目的:慢性乙型肝炎相关肝癌发病率及病死率逐年上升。目前肝癌发病机制虽有多种假说,但确切机制至今尚未明确是其妨碍提高防治水平的关键科学问题。多年来防治肝癌的策略主要集中于抗病毒和肝癌细胞本身,忽略了人体内在宿主因素的影响。随着肝癌微环境概念的提出,其作为影响肝癌发生发展的关键因素,逐渐引起研究者的重视。慢性肝病的肝脏炎症和纤维化形成的异常肝再生微环境促进肝癌的发生发展。因此研究通过改善肝再生微环境降低肝癌发生,抑制其进展及转移,具有极大的临床参考价值和深远的科学意义。本文结合临床试验和体外实验两部分,旨在探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制:第一部分,观察地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生率及发生风险的影响。第二部分,揭示共培养条件下TGF-β1活化肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的相关机制,分析其对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡和侵袭能力的影响,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。方法:1.本试验通过对前期完成的针对HBeAg阴性慢乙肝的随机对照临床试验（中国临床试验注册中心注册号:Chi CTR-TRC-12002962）的单用地五养肝胶囊或单用恩替卡韦或二者联用治疗时间达到48周的患者,进行长达108月前瞻性随访观察（恩替卡韦随访期间不停药）,每6个月检测患者血常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝两对半定量、血清HBV DNA水平和甲胎蛋白（AFP）。主要观察评价指标:观察随访期间终点事件肝癌的发生率。次要观察指标:观察随访期间慢乙肝患者生化学及病毒学应答。其中,肝癌累积发病率采用使用乘积限法（Kaplan-Meier）统计,并通过时序检验（log-rank）方法进行比较。2.体外实验通过建立TGF-β1诱导激活的人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞株HCCLM3的共培养模型,模拟肝癌的肝再生微环境。实验分为LX2对照组（LX2-NS）、共培养模型组（Co-culture model）、共培养DWYG组（Co-culture DWYG）,并给予地五养肝胶囊含药血清进行干预,通过CCK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验等细胞生物学方法观察共培养条件下活化人肝星状细胞LX2对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡、侵袭能力的影响,通过Western Blotting、q RT-PCR等分子生物学方法研究共培养条件下活化人肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的机制,分析这一过程中TGF-β/Smad信号通路的Smad2、Smad3、TβRI、Smad7等m RNA和蛋白表达规律,探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。结果:（1）入组基线资料及随访时间比较:对符合纳入标准的170例患者随机分为三组,其中A组为地五养肝胶囊治疗组（56例）,口服地五养肝胶囊;B组为地五养肝胶囊联合恩替卡韦治疗组（57例）,同时应用地五养肝胶囊和恩替卡韦;C组为恩替卡韦对照组（57例）,口服恩替卡韦,对治疗周期达到48周的患者进行108月随访。入组时各组患者在年龄、性别、血常规（包括中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、中性粒细胞与淋巴细胞比值NLR以及血小板计数PLT）、PT国际标准化比值INR、肝功能包括（ALT、AST、GGT、ALB、TP、TBIL）及血清HBV-DNA水平无显着性差异（P>0.05）。随访从2012年1月1日至2021年1月11日,共随访108个月,平均随访时间84.03个月,中位随访时间94.00个月。地五养肝胶囊组的平均随访时间和中位随访时间分别为90.75个月、99.00个月,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组的平均随访时间和中位随访时间分别为78.82个月、92.50个月,恩替卡韦组的的平均随访时间和中位随访时间分别为82.78个月、91.00个月。共计随访患者151例,总计失访率为11.18%（19/170）。其中,地五养肝胶囊组完成随访48例,地五养肝胶囊联合恩替卡韦组完成随访50例,恩替卡韦组完成随访53例,三组失访率依次为14.29%（8/56）、12.28%（7/57）、7.02%（4/57）,失访率组间比较无显着差异（P>0.05）。（2）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的比较:将不同干预方案的三组患者血生化结果进行分析,发现三组组间比较,ALT、AST水平无明显差异（P>0.05）。其他相关ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,在三组间比较差异不显着（P>0.05）。三组随访患者血生化指标分别与入组时相比,发现三组随访患者肝功能ALT、AST均较前下降（ALT:23.50±15.40 vs 34.70±17.51,25.96±27.45 vs35.87±18.07,28.18±20.30 vs 40.25±21.20;AST:22.08±5.87 vs 28.72±11.24,23.11±11.17 vs 31.91±11.61,27.57±16.85 vs 33.72±14.35）,差异具有统计学意义（P<0.01）,而ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标,较前入组时相比无明显差异（P>0.05）。（3）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的比较:不同治疗方案的各组患者HBV DNA水平均较入组时明显下降（P<0.05）。HBV DNA水平在随访的三组间组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组HBs Ag水平分别与入组时相比,三组HBs Ag水平较前明显降低（P<0.05）。随访结果显示,三组患者中HBs Ag下降>1500 IU/ml依次为34.21%（13/38）、35.71%（10/28）、28.57%（8/28）,经统计学分析三者差异无意义（P>0.05）。（4）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌累积发病率影响:随访至108月,采用Kaplan-Meier（乘积限法）法绘制肝癌发病生存曲线,并计算地五养肝胶囊组、地五养肝胶囊联合恩替卡韦组、恩替卡韦组随访发生肝癌事件的累积发病率依次为0%（0/48）、2%（1/50）、11.32%（6/53）,然后采用时序检验Log Rank（Mantel-Cox）进行分析检验,结果显示:三组患者肝癌累积发病率具有差异（P<0.05）。其中,地五养肝胶囊组肝癌累积发病率（0%）明显低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌累积发病率（2%）低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P<0.05）。地五养肝胶囊组肝癌发病率（0%）低于地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌发病率（2%）,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示相对于单独应用恩替卡韦抗病毒治疗,单用地五养肝胶囊或联合应用恩替卡韦均可显着降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率。（5）TGF-β1诱导LX2活化以及LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的形态学观察:LX2活化前形体不规则呈多边星形,胞突生长不发达,细胞间连接紧密;经TGF-β1（10ng/ml）诱导激活后,细胞体积增大,胞突伸展,细胞间连接疏松,细胞增殖速度加快;与人肝癌细胞HCCLM3共培养后LX2胞伪足更加伸展,呈拉伸状两极生长,细胞增殖明显增快。（6）筛选DWYG含药血清最佳给药浓度:采用CCK-8法检测不同浓度DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖能力的影响。实验结果显示:与对照组相比,随着5%、10%、15%、20%等不同含药血清浓度的升高,各组细胞测得的A450值逐渐下降,HCCLM3细胞增殖活力明显下降（P<0.01）,细胞增殖抑制率逐渐增高（P<0.01）,选取10%为最佳实验用血清含药浓度。（7）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖的影响:与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养模型组（0.75±0.01）HCCLM3细胞增殖活力增强（P<0.01）。与M3对照组A450值（0.69±0.03）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力下降（P>0.05）。与共培养模型组A450值（0.75±0.01）相比,共培养DWYG组（0.65±0.01）HCCLM3细胞增殖活力显着降低（P<0.01）。由此可见,共培养模型组HCCLM3增殖率（111.45%）,显着高于M3对照组细胞增殖率（100%）,而共培养DWYG组HCCLM3细胞增殖率（90.77%）显着低于共培养模型组（111.45%）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进肝癌细胞HCCLM3的增殖,DWYG含药血清可能抑制LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖。（2）LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的增殖:与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养模型组（0.71±0.02）LX2细胞增殖活力显着增加（P<0.01）。与LX2对照组（0.62±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞活力无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组（0.71±0.02）相比,共培养DWYG组（0.63±0.01）LX2细胞增殖能力下降（P<0.01）。与LX2对照组（100%）相比,共培养模型组具有更高细胞增殖率（120.35%）。与共培养模型组（120.35%）相比,共培养DWYG组LX2细胞增殖率（90.77%）显着下降。提示LX2/HCCLM3共培养体系可能促进人肝星状细胞LX2的增殖,DWYG含药血清具有抑制LX2/HCCLM3共培养体系中LX2增殖的作用。（8）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3及LX2两种细胞凋亡的影响:（1）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系HCCLM3细胞凋亡的影响:根据流式细胞仪检测结果显示,与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养模型组（6.23±0.54）细胞凋亡率明显下降（P<0.01）。与M3对照组（7.52±0.17）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。与共培养模型组（6.23±0.54）相比,共培养DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。与M3阴性对照组（6.23±0.54）相比,M3DWYG组（24.02±0.25）细胞凋亡率显着升高（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系抑制HCCLM3的凋亡,而DWYG含药血清可促进LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3的凋亡。（2）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞凋亡的影响:与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养模型组（5.15±0.29）凋亡率明显下降（P<0.01）。与LX2对照组（6.37±0.32）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡升高（P<0.01）。与共培养模型组（5.15±0.29）相比,共培养DWYG组（7.36±0.37）细胞凋亡显着升高（P<0.01）。表明LX2/HCCLM3共培养体系可一定程度上抑制LX2细胞的凋亡,DWYG含药血清可减弱该抑制作用从而促进LX2/HCCLM3共培养体系中人肝星状细胞LX2的凋亡。（9）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响:与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养模型组（148.80±4.09）HCCLM3侵袭能力明显增强,差异具有统计学意义（P<0.01）。与M3对照组（104.00±4.18）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）侵袭能力下降（P<0.01）。与共培养模型组（148.80±4.09）相比,共培养DWYG组（78.00±6.60）细胞侵袭力显着下降（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可增强HCCLM3侵袭能力,而DWYG含药血清可降低由共培养体系诱导的高HCCLM3侵袭能力。（10）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT相关m RNA的表达的影响:采用RT-PCR检测技术检测EMT相关E-cadherin、Vimentin m RNA的表达,统计结果显示:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin m RNA的表达下降（P<0.01）,Vimentin m RNA表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin m RNA的表达明显增加（P<0.01）,Vimentin m RNA的表达明显降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin m RNA的表达,抑制E-cadherin m RNA的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系中LX2细胞E-cadherin m RNA的表达,抑制Vimentin m RNA表达。（11）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞EMT和TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7 m RNA的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达升高,Smad7 m RNA表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比共培养DWYG组TβRI m RNA的表达下降（P<0.01）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.01）,Smad2、Smad3m RNA表达下降（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达下降（P<0.05）,Smad7 m RNA表达上升（P<0.05）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI m RNA的表达,降低Smad7 m RNA的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7 m RNA的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRIm RNA表达。（12）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系EMT相关蛋白的表达的影响:与LX2对照组相比,共培养模型组E-cadherin蛋白的表达下降（P<0.01）,Vimentin蛋白表达明显升高（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增强（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达无显着性差异（P>0.05）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组E-cadherin蛋白的表达增加（P<0.01）,Vimentin蛋白的表达降低（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达,而DWYG含药血清则促进LX2/HCCLM3共培养体系E-cadherin蛋白的表达,抑制Vimentin蛋白表达。（13）DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响:通过实验检测LX2细胞TGF-β/Smad信号通路相关Smad2、Smad3、TβRI、Smad7蛋白的表达情况,结果分析显示:与LX2对照组相比,共培养模型组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达升高,Smad7蛋白表达下降（P<0.01）。与LX2对照组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。与共培养模型组相比,共培养DWYG组Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达下降,Smad7蛋白表达上升（P<0.01）。提示LX2/HCCLM3共培养体系可明显促进LX2细胞Smad2、Smad3、TβRI蛋白的表达,降低Smad7蛋白的表达,而DWYG含药血清则可促进LX2/HCCLM3共培养体系LX2细胞Smad7蛋白的表达,抑制Smad2、Smad3、TβRI蛋白表达。结论:（1）根据170例地五养肝胶囊治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎RCT临床试验资料,随访至108月,单用地五养肝胶囊组与单用恩替卡韦组和联合用药组在生化学应答、病毒学应答方面疗效相当。单用地五养肝胶囊或者联用恩替卡韦能显着降低肝癌发病率。（2）构建的活化的LX2与HCCLM3共培养体系模拟的肝癌肝再生微环境可促进LX2和HCCLM3增殖活力,抑制LX2和HCCLM3凋亡,增强HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进EMT。DWYG含药血清能显着抑制共培养体系中的LX2和HCCLM3增殖,促进LX2和HCCLM3凋亡,降低HCCLM3细胞侵袭能力,其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活、调节EMT/MET失衡,改善肝癌肝再生微环境,发挥防治肝癌发生发展的作用。
张彦收[5]（2021）在《LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症数据显示,乳腺癌新发病例高达226万例,并已超过肺癌成为全球第一大癌症。在我国,女性恶性肿瘤发病首位同样为乳腺癌,每年发病人数约为30.4万。因此,对于乳腺癌预防、诊断和治疗的研究是目前医学领域工作的重点。当前,随着乳腺癌治疗模式的进步和新型药物的不断涌现,乳腺癌的治疗效果已取得了巨大突破。然而,乳腺癌耐药后出现的复发、转移仍然是困扰临床的难题之一。因此,研究乳腺癌的增殖、侵袭、转移机制,探寻新的治疗途径和靶点对提高乳腺癌的生存率至关重要。富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1,LRG1）是富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）家族蛋白成员,也是最早被发现的含有LRR结构的蛋白。人LRG1基因定位于染色体19p13.3,含有2810个碱基对,包括2个外显子和1个内含子。第一个外显子含43个碱基对,第二个外显子含1737个碱基对,共编码347个氨基酸残基。前35个氨基酸残基为信号肽,312个氨基酸残基构成单个肽链。因其定位的染色体区域同时存在数个编码中性粒细胞颗粒酶的基因,并且LRG1在人类MPD和HL-60细胞嗜中性分化过程中上调,而在HL-60细胞单核细胞分化过程中下调,早期研究认为LRG1可能是中性粒细胞早期分化的一种标志物。随着分子生物学技术的不断发展,LRG1的其它功能逐渐被发现:LRG1不仅参与细胞蛋白间的相互作用,同时在细胞信号转导、细胞黏附及发育过程中也发挥着重要作用。近些年研究显示LRG1在人类多种恶性肿瘤组织、血液、脑脊液、外泌体中异常表达,并且可以作为部分肿瘤早期诊断和预后判断的生物标记物。当前研究发现,LRG1在肿瘤的发生、发展、侵袭转移、上皮间质转化和异常血管生成过程中扮演重要角色,因此,LRG1在抗肿瘤治疗领域发挥的作用逐渐被大家重视。然而,LRG1在不同肿瘤中的表达存在明显差异,提示LRG1在不同肿瘤的发生、发展中可能发挥不同作用。如外泌体中LRG1与非小细胞肺癌发生发展有关;肝癌组织中LRG1表达较正常组织下调,体外实验显示LRG1对肝癌细胞增殖没有影响;卵巢癌患者血清和肿瘤组织中LRG1表达升高程度与肿瘤分期相关。LRG1在不同肿瘤中所发挥的作用正在积极探索之中。越来越多研究提示LRG1是抗肿瘤治疗的潜在靶点。但是,LRG1在乳腺浸润性癌中的表达、临床意义及作用机制有待进一步研究。本研究分三部分对LRG1在乳腺浸润性癌中的表达及临床意义进行了研究:第一部分:通过生物信息学方法分析不同肿瘤中LRG1mRNA及蛋白的表达情况,探索其与临床病理指标及预后的关系。第二部分:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测了330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达,进一步分析LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床病理指标及预后的相关性。第三部分:应用逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）技术、Western-blot技术检测不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况。采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力;划痕实验检测转染后细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。探讨LRG1对乳腺癌细胞生物学行为的影响。第一部分LRG1在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析目的:通过生物信息学方法分析LRG1在不同肿瘤中的表达及其临床意义。方法:基于人类癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库（http://www.tcga.org/）中肿瘤组织及正常组织中RNA-seq的测序结果,使用TIMER2.0在线工具（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析LRG1mRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达情况。从人类蛋白质图谱图像（the human protein atlas）数据库中（https://www.proteinatlas.org）中获取LRG1蛋白在不同肿瘤组织和正常组织中表达的情况。基于Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）中患者的临床特征、生存资料,分析不同肿瘤中LRG1mRNA的表达与总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（recurrence free survival,RFS）之间的关系,并绘制Kaplan-Meier曲线。结果:1.LRG1mRNA在乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）（1097例）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）（533例）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）（515例）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）（545例）、甲状腺癌（thyroid carcinoma,THCA）（501例）中的表达量显着高于相对应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.分析The Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org）数据库中LRG1蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC、THCA组织中的表达情况,结果显示LRG1蛋白在此五种癌组织中表达水平显着高于癌旁正常组织。3.分析LRG1mRNA在BRCA不同亚型中表达情况。566例Luminal型乳腺癌中LRG1表达量为37.462（9.930-74.197）,高于HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（P<0.01）。根据淋巴结转移情况进一步分析显示,1646例淋巴结阳性患者组LRG1mRNA表达量高于2415例淋巴结阴性组,差异具有统计学意义（P<0.0001）。17例粘液腺癌中LRG1mRNA的表达量明显低于其它浸润性癌（浸润性导管癌、浸润性小叶癌及混合型癌）,差异具有统计学意义（P<0.0001）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中生存数据,LRG1mRNA的表达与Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型乳腺癌的OS无明显关系（均P>0.05）,但在Basal-like亚型中,LRG1的表达与OS显着相关,LRG1表达低的乳腺癌患者OS较好（HR=3.12,95%CI=1.54-6.29,P<0.001）。4.在KIRC中,随着临床分期的升高,LRG1mRNA的表达呈上升趋势。Ⅳ期患者LRG1的表达量显着高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异具有显着性（P<0.01）。在不同组织学分级中,呈现同样趋势,组织学分化3级患者组LRG1表达量显着高于1、2级（P<0.01）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中530例KIRC患者的OS及RFS数据并绘制生存曲线,结果显示367例LRG1高表达组患者OS低于163例低表达组,LRG1mRNA的表达与OS显着相关（HR=1.71,95%CI=1.18-2.47,P=0.0042）。LRG1mRNA的表达与RFS关系与OS一致,LRG1高表达组患者RFS低于低表达组（HR=3.57,95%CI=1.26-9.87,P=0.0089）。在肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）数据中,同样发现LRG1mRNA表达水平可以预测患者OS及RFS,高表达组患者OS及RFS均差于低表达组,差异具有显着性（OS:HR=2.19,95%CI=1.2-4.01,P=0.0091;RFS:HR=5.32,95%CI=1.2-22.54,P=0.011）。5.LUAD组织中LRG1mRNA的表达量显着高于正常组织。在正常肺组织中,LRG1mRNA中位表达量为25.277（20.394-30.683）,在LUAD组织中表达量为35.431（20.538-53.567）,差异具有统计学意义（P<0.001）。分析503例肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）和52例正常组织的数据,发现LRG1mRNA在正常组织中表达水平显着高于LUSC（26.701 vs 11.612,P<0.001）。LRG1mRNA在LUAD和LUSC中的表达存在明显差异。在LUAD组,222例LRG1高表达组患者OS低于282例低表达组,LRG1mRNA表达与OS显着相关（HR=1.34,95%CI=1-1.8,P=0.045）。6.LRG1mRNA在UCEC组织中表达量为24.37（10.368-48.392）,高于正常子宫内膜组织表达（10.072,2.357-14.296）,差异具有显着性（P<0.001）,LRG1mRNA在UCEC中呈现高表达,但与年龄、临床分期、月经状态及预后无显着相关性。7.LRG1mRNA在THCA中的表达量随着淋巴结转移个数的增多而升高,具有统计学意义（P=0.027）,在预后方面,261例LRG1高表达组患者OS优于241例低表达组,且具有显着性差异（HR=0.11,95%CI=0.02-0.48,P=0.00035）。结论:1.LRG1mRNA及蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC及THCA中表达显着上调,LRG1可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要促进作用。2.Luminal型乳腺癌中LRG1mRNA表达量高于HER-2阳性型和三阴性,LRG1与Basal-like亚型乳腺癌的OS呈负相关。3.KIRC中LRG1mRNA的表达可以预测OS及RFS,LRG1表达与OS、RFS呈负相关。4.LRG1mRNA在LUAD中表达上调,LRG1高表达提示患者OS较差。5.LRG1mRNA在UCEC中表达上调,但与临床特征及预后无显着相关性。6.LRG1mRNA在THCA中表达与淋巴结转移个数呈正相关,与OS呈显着正相关。第二部分乳腺癌组织中LRG1蛋白表达与临床特征及生存预后的关系目的:探讨乳腺癌组织LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床特征及生存预后的关系。方法:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达情况,探讨LRG1与乳腺癌患者年龄、月经、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移状况、组织学分级、分子亚型及生存预后的相关性。结果:1.LRG1蛋白在原发性乳腺癌中表达情况。在330例原发性乳腺癌患者中,58.48%（193例）患者LRG1呈阳性表达。LRG1着色部位主要位于细胞质,阳性信号表现为褐色颗粒状外观。2.LRG1蛋白的表达与临床病理指标的关系。0-3个淋巴结转移组LRG1阳性表达128例,阴性表达121例,阳性表达率51.41%;3个以上淋巴结转移组LRG1阳性表达65例,阴性表达16例,阳性表达率80.25%,两组间LRG1阳性表达率存在显着性差异（χ2=20.939,P<0.001）。LRG1的表达与淋巴结转移负荷呈正相关,随着淋巴结转移数量的增多,LRG1的阳性表达率升高。Ⅰ-Ⅱ期患者组LRG1阳性表达124例,阴性表达125例,阳性表达率62.96%;Ⅲ期组LRG1阳性表达69例,阴性表达12例,阳性表达率85.19%。两组间LRG1阳性表达率的差异有统计学意义（χ2=31.520,P<0.001）。LRG1的表达与肿瘤负荷呈正相关,随着疾病的进展,LRG1的阳性表达率升高。3.LRG1蛋白的表达与乳腺癌DFS（disease-free survival,DFS）、OS的关系。330例患者中位随访时间72个月,92例患者出现局部复发或远处转移,80例患者死亡。LRG1阳性表达组72个月的DFS为61.14%（118/193）,阴性表达组DFS为87.59%（120/137）,两组间DFS存在显着差异（χ2=27.123,P<0.001）。72个月OS与DFS结果相似,共出现80例死亡事件,总体人群72个月OS为75.76%。LRG1阳性表达组72个月的OS为66.32%（128/193）;LRG1阴性组为89.05%（122/137）,两组间差异有显着性（χ2=22.864,P<0.001）。4.影响DFS及OS的COX回归模型多因素分析COX多因素分析显示LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌患者DFS和OS的独立危险因素（P<0.05）。肿瘤大小、组织学分级、年龄、月经状态与DFS、OS无显着相关性（P>0.05）。LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型对DFS的风险比分别为2.090、3.214和1.796;对于OS的风险比分别是2.112、2.628和1.755。结论:1.乳腺癌LRG1蛋白的表达与年龄、月经状态、肿瘤大小、组织学分级、分子亚型无关。2.乳腺癌LRG1蛋白的表达与淋巴结转移个数呈正相关,随着淋巴结转移个数的增多,LRG1的阳性表达显着升高。3.乳腺癌LRG1蛋白的表达与病理TNM分期相关,分期越晚,LRG1的阳性表达越高。4.LRG1蛋白的表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌DFS、OS的独立危险因素。LRG1表达水平与DFS、OS呈负相关。第三部分LRG1在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响目的:验证乳腺癌细胞系中LRG1的表达是否与乳腺癌组织中表达一致,为LRG1在乳腺癌发生、发展及侵袭转移中的作用提供理论支持。方法:主要应用了RNA干扰技术、RT-PCR、Western-blot技术和细胞划痕实验等方法,观察不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况,抑制LRG1表达后细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:1.RT-PCR方法检测乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1mRNA的表达。在三种不同乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3）中,LRG1mRNA表达水平差别显着,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量（0.1260±0.0070）,较MDA-MB-231细胞（0.1103±0.0081）、SK-BR-3细胞（0.0703±0.0027）相对表达量显着增高。2.MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1蛋白的表达。在三种不同乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3中,LRG1蛋白的表达存在显着差别,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1蛋白相对表达水平最高（10.9510±0.6721）,显着高于MDA-MB-231（7.8492±0.1327）、SK-BR-3细胞（4.3906±0.1914）。3.采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达。Western-blot技术检测检测转染成功后MDA-MB-231细胞中LRG1蛋白的表达,结果显示,转染组（MDA-MB-231-Si）中LRG1蛋白表达量（0.4105±0.1906）较对照组细胞（MDA-MB-231）中的表达量（0.8295±0.1295）明显降低,差异具有显着性（P<0.05）。4.CCK-8实验检测细胞增殖能力。转染成功后,CCK-8实验检测各组细胞在24h、48h、72h和96h后450 nm处OD值。结果显示:随着时间的延长,转染组（MDA-MB-231-Si）增殖率明显低于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞增殖能力下降。5.细胞划痕实验检测细胞迁移能力。划痕实验分别检测处于对数生长期的对照组、转染阴性对照组、转染组细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231-Si）细胞的迁移能力。划痕0小时测得的划痕区面积:对照组细胞（MDA-MB-231）、转染组细胞（MDA-MB-231-Si）、转染阴性对照组细胞（MDA-MB-231-NC）分别为:15.054±0.122,14.679±0.142,13.407±0.112。划痕24小时后测得的划痕区面积分别为:6.714±0.131,9.559±0.122,5.217±0.132。面积缩小的比值依次为:55.40%,34.88%,61.08%。乳腺癌MDA-MB-231-Si细胞在划痕24小时后的迁移率均明显低于对照组（MDA-MB-231）、转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）,差异有显着性（P<0.05）。6.Transwell实验检测细胞侵袭能力。Transwell侵袭实验显示转染组（MDA-MB-231-Si）穿膜细胞数少于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞侵袭能力下降。结论:1.MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量,较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞相对表达量显着增高。2.MCF-7细胞中LRG1蛋白的相对表达水平较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞显着增高。3.si-RNA干扰LRG1表达后可减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
贺凡[6]（2020）在《基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制》文中提出研究背景肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,因其恶性度高、预后差,目前对肝癌的诊治仍存在巨大挑战,随着分子免疫学研究的进展,对肝癌的治疗有了新的补充,但仍然存在应答率低、疗效欠佳的困境,中医药目前在肝癌的治疗中显示出一定的优势,在肿瘤治疗中的地位也越来越突出,但同时存在药物成分复杂、机制不明等问题。基于此,寻找敏感度高、特异性强的与肝癌的发病有密切联系的生物分子标记物的需求十分迫切。研究目的参桃软肝方（STR）是导师周岱翰教授的经验方,具有健脾养肝、软坚消症之效,临床运用数十载,取得了较好疗效,但因中药成分复杂,药效机制尚不明确,限制了其在临床的推广应用。本研究旨在通过网络药理学的方法对STR的成分及作用乙肝相关性肝癌（HBV-HCC）的靶点进行筛选,建立“药物-活性成分-关键靶点-通路”网络关系图,并通过体外细胞及动物实验,观察STR抑制肝癌细胞株及抑制裸鼠皮下移植瘤模型的疗效,进一步通过高通量测序技术综合分析筛选STR可能的作用靶点和机制,并进行生物信息学验证以确定STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及可能的作用机制。研究方法1.通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对STR中的组成药物进行检索从而获取其化学成分,根据口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和类药性（drug likeness,DL）≥0.18作为条件筛选候选化合物,同时结合STR质谱分析的结果得到中药的潜在化合物,将其所对应的靶点基因与GEO数据库筛选出来的HBV-HCC相关的靶点基因进行配对后,获得STR和HBV-HCC两者共同拥有的关键靶点,即为STR作用HBV-HCC的潜在靶点。利用R软件中“cluster Profiler”安装包对其进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建“中药-化学成分-关键靶点-通路”网络关系图。2.采用MTT法观察STR对人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H增殖作用的影响,采用细胞划痕及Transwell实验观察STR对三株人肝癌细胞株的迁移能力的影响。3.建立人肝癌细胞株Hep G2.2.15裸鼠皮下成瘤模型,待瘤体积达100-200mm3时将其随机分为五组,即STR低、中、高剂量组,阴性对照组,阳性药对照组,分别进行灌胃,每天一次,连续给药25天,记录裸鼠状态、生长情况,测量瘤体积及裸鼠体重。最后一天给药结束,眼球取血,剥离瘤体,测量瘤重,进行统计学分析,取肝肾组织,HE染色观察肝肾形态学改变。4.取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行转录组学测序（RNA-seq）,通过文库构建、数据过滤及基因差异表达分析,筛选出差异表达基因（DEGs）,并以火山图、聚类热图形式表现,并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集。取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行全基因组亚硫酸氢盐甲基化测序（WGBS）,通过文库构建、数据过滤及差异甲基化表达分析,筛选出差异甲基化区域及其对应基因,与转录组测序得到的DEGs重叠取交集。5.选取临床HBV-HCC病人8例癌组织与癌旁组织行WGBS,筛选差异甲基化区域（DMRs）相关基因,并将其与动物样本测序结果进行关联分析,寻找共同的差异甲基化基因,并进行GO与KEGG分析。6.通过Cytoscape软件将STRING构建的PPI网络进行可视化,并用拓扑分析进行核心基因筛选。将筛选出的核心基因通过c Bio Portal数据库中关联TCGA数据库对其进行突变谱分析,m RNA表达水平与甲基化状态的相关性分析;通过GEPIA数据库检验核心基因的m RNA表达水平及总生存期（OS）、无病生存期（DFS）的预后分析;通过人类蛋白质图谱（HPA）数据库验证核心基因的蛋白质表达水平的验证。研究结果1.通过TCMSP平台数据库检索西洋参、桃仁、大黄、丹参、当归、仙鹤草六种药物,以OB≥30%和DL≥0.18为条件进一步筛选,并通过质谱分析的结果,总共得到STR潜在化合物125个,删除重复靶点后得到437个蛋白靶点基因。通过GEO数据库筛选出HBV相关的HCC数据库GSE121248基因芯片数据,筛选出HBV-HCC的DEGs 888个。将STR药物预测的靶点与GEO数据库筛选出的DEGs进行配对,发现51个共同靶点基因,GO富集在971个条目中,KGEE通路富集分析显示靶点基因共富集了33条通路,其中与代谢相关的通路有酪氨酸代谢、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响、视黄醇代谢通路;与炎症相关IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样信号通路、松弛素信号通路等;与细胞周期相关的通路有细胞衰老、细胞周期、凋亡、p53信号通路等;与激素调节有关的雌激素信号通路、卵巢类固醇生成等;与血管生成有关的通路有VEGF信号通路,另外,还有广泛参与细胞生物学行为的PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等。2.细胞实验表明,STR能够抑制人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H的增殖,并呈时间和剂量依赖性。划痕实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞的迁移能力,统计学结果见显着性差异（Hep G2.2.15 12h及24h划痕P<0.05,Hep G2 24h划痕P<0.05,MHCC97-H 12h及24h划痕P<0.05）。Transwell实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞株的迁移,统计学结果提示STR低、中、高剂量组与对照组比较有显着性差异（P<0.05）。3.动物实验表明,STR组的瘤体积和瘤重都较阴性对照组小,其中STR中、高剂量组与对照组比较,结果具有显着性差异（P<0.05）。说明STR能够抑制荷Hep G2.2.15肝癌裸鼠肿瘤的生长。4.荷瘤裸鼠肿瘤组织样本转录组测序得到有效差异表达的m RNA 221个,其中上调185个,下调36个。GO功能注释GO分析显示这些差异基因主要参与的生物学过程（biological process,BP）有蛋白质糖基化（protein glycosylation）、激素的分泌调节（regulation of hormone secretion）、不饱和脂肪酸代谢（unsaturated fatty acid metabolic process）,细胞基质粘附（cell-substrate adhesion）、先天免疫反应激活细胞表面受体信号通路（innate immune response activating cell surface receptor signaling pathway）等463个过程;细胞组分（cell component,CC）结果分析显示与高尔基体腔（Golgi lumen）、含胶原细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）、肌节（sarcomere）、肌原纤维（myofibril）等55个条目;分子功能分析（molecularfunction,MF）结果表明,这些基因主要与细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）、钙依赖性磷脂绑定（calcium-dependent phospholipid binding）、溶血磷脂酶的活动（lysophospholipase activity）等51个功能有关。此外,KEGG通路富集分析发现,这些差异表达基因与PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TGF-β信号通路、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）等通路有关。5.对荷瘤裸鼠STR治疗组瘤组织和对照组瘤组织进行WGBS检测,共得到DMRs 80510个,DMRs长度共8056280,共筛选出8986个基因。其中启动子区域异常甲基化基因3760个,高甲基化基因1600个,低甲基化基因2160个。将其与转录组测序筛选的m RNA与WGBS筛选出的差异甲基化基因进行重叠取交集,得到甲基化水平与差异表达基因呈负相关关系的重叠基因151个,GO富集了499个条目,KEGG分析显示与12条通路密切相关。6.临床HBV-HCC首次术后标本WGBS分析与动物测序筛选的差异甲基化基因取交集,得到146个共同的差异甲基化基因,通过拓扑分析,最终筛选到了10个与肝癌密切相关的基因,即CD44、LGALS3、ACTA1、LCN2、MUC1、IGFBP3、HAMP、IRS2、PDK4、BDKRB2。结合现有研究及通过外部数据库验证发现,Hub基因中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用,IGFBP3、HAMP、PDK4为抑癌基因,ACTA1作为抑癌因子尚存争议。测序结果提示STR抑制了癌基因LCN2的表达及上调抑癌基因IGFBP3、HAMP、PDK4的表达。人与动物测序共同的到的差异甲基化基因富集分析显示GO富集了509个条目,KEGG富集了13条信号通路,包括与I肝II纤维化密切相关的ECM-受体互作通路,与炎症相关的IL-17信号通路、松弛素信号通路、TGF-β信号通路、补体凝血级联通路,与代谢相关的脂质调节、外源性物质细胞色素P450代谢、蛋白质的消化吸收等途径,以及广泛参与肿瘤生物学调控的PI3K-AKT信号通路、c AMP信号通路等。研究结论本研究通过高通量分子测序揭示了一系列STR作用下的异常甲基化修饰的差异表达基因及通路,为阐述肝癌的诊疗提供新的思路。我们在经STR处理荷瘤裸鼠肝癌组织与对照组肝癌组织中发现了部分癌基因与抑癌基因,其中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用被认为是有致癌活性的,IGFBP3、HAMP、PDK4被认为是抑癌基因,以上基因的表达水平与甲基化状态均呈负相关关系。STR可能通过抑制LCN2的表达及上调IGFBP3、HAMP、PDK4的表达而发挥抗肝癌作用,可能作为STR抗HBV-HCC的潜在靶点。与通过网络药理学方法筛选得到的靶点及通路进行对比,发现有PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路、外源性物质细胞色素P450代谢等共同作用的通路,提示STR可能通过影响这些通路进而发挥抗肿瘤作用。
赵志平[7]（2020）在《GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究》文中指出研究背景胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是消化系统中恶性程度极高、疗效及生存预后极差的肿瘤之一。流行病学研究表明,全世界每年有超过33万人死于胰腺导管腺癌,其总体5年生存率约6%（2%-9%）。由于胰腺癌起病隐匿,进展迅速,大多数患者就医时已经处于中晚期并出现局部浸润及远处转移,因此只有约10%-15%的胰腺癌患者有机会接受根治性手术切除。大多数患者只能采用姑息性手术、化疗、放疗、免疫治疗等疗法,临床疗效收获甚微。因此,深入研究胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的分子调控机制,对防治PDAC的增殖及侵袭转移,研发新的早期诊断肿瘤标志物,提高临床患者的生存预后具有重要意义。转化生长因子-β超家族（Transforming growth factor-βsuperfamily,TGF-βs）是一类具有多种生物学功能的多肽类细胞因子,目前研究发现共有33种不同的亚型（TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,Inhibinα,InhibinβA,InhibinβB,InhibinβC,InhibinβE,Nodal,Myostatin,BMP-2,BMP-3,BMP-4,BMP-5,BMP-6,BMP-7,BMP-8A,BMP-8B,BMP-9,BMP-10,GDF-1,GDF-3,GDF-5,GDF-6,GDF-7,GDF-9,GDF-9B,GDF-10,GDF-11,GDF-15,MIS,Lefty A,Lefty B）,能够在细胞形态维持以及细胞分化、增殖、凋亡、衰老、迁移等生物学过程中发挥重要作用。生长分化因子-15（Growth differentiation factor 15,GDF-15）,是转化生长因子-β超家族中生长分化因子亚家族的成员,又称作巨噬细胞抑制因子-1（MIC-1）、非甾体抗炎药物活化基因-1（NAG-1）、前列腺源性生长因子（PDF）、胎盘转化生长因子β（PTGFβ）、胎盘骨形态发生蛋白（PLAB）以及PL74。最早由澳大利亚Bootcov MR等学者在1997年从人源U937骨髓单核细胞c DNA文库中分离出GDF-15。作为TGF-β家族中的一员,GDF-15跟家族中其它成员的氨基酸序列相似性仅为15%-29%。GDF-15基因位于人类19号染色体GRCh38.p13,含有两个外显子和一个内含子,长为7007bp DNA。经转录翻译合成含有308个氨基酸的GDF-15前体蛋白（无活性）,在细胞内经Furin-like蛋白酶切割加工后形成具有生物学活性的分泌型GDF-15,分子量约为30k Da。在生理状况下,GDF-15在除胎盘组织以外的其他组织中不表达或者少量表达;然而在病理状况下,如炎症、应激、损伤、缺血再灌注、心衰、II型糖尿病等,受累的组织器官中GDF-15的表达量显着增多,相应的血浆中GDF-15表达量亦升高。研究报道,在多种类型肿瘤如恶性胶质瘤、睾丸癌、卵巢癌、口腔鳞状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌以及肝细胞癌中GDF-15异常高表达,可以作为检测和判断肿瘤预后的潜在生物学标志物。GDF-15主要由活化的巨噬细胞以及肿瘤细胞分泌,在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。在胰腺癌中,GDF-15基因受Twist1调控而持续表达,增强胰腺癌细胞增殖及侵袭转移,并诱导细胞对化疗药物产生耐药性,但其具体分子机制有待进一步阐明。胶质细胞源性神经营养因子家族α样受体（Glial-derived neurotrophic factor receptor alpha-like,GFRAL）是胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）受体α家族的孤儿受体。研究报道,GDNF蛋白家族有四个成员,即GDNF家族受体-α1（GFR-α1）,GDNF家族受体-α2（GFR-α2）,GDNF家族受体-α3（GFR-α3）和GDNF家族受体-α4（GFR-α4）。其中GFRAL基因定位于人6号染色体,包含有9个外显子,且存在可变剪切体。GFRAL蛋白由395个氨基酸残基组成,在其C-末端有20-30个可伸缩的疏水性氨基酸,N-末端存在一个信号肽。GFRAL蛋白通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜上。作为一种单次跨膜蛋白,GFRAL位于细胞内的结构域较短,缺乏向细胞内传导信号的能力,因此在发挥生物学作用时,需要酪氨酸激酶辅助受体Ret来协助GFRAL受体进行信号的传导。来自四个不同的医学研究团队Emmerson PJ,Yang L,Mullican SE和Hsu JY在Nature Medicine和Nature刊文报道,GFRAL局限地表达于小鼠脑干最后区（Area postrema,AP）以及孤束核（Nucleus tractus solitarius,NTS）中的神经细胞膜表面;GFRAL能够与GDF-15特异性结合,其结合率跟GDF-15的浓度呈正相关。在神经细胞膜上形成GDF-15/GFRAL/Ret复合物,激活胞内PI3K-Akt,Erk1/2,MAPK和磷脂酶C（PLC）γ信号通路,从而抑制小鼠的摄食行为,调节新陈代谢,降低体重,改善血糖,能作为严重肥胖、2型糖尿病以及厌食/恶病质治疗的潜在靶标。然而,GFRAL在肿瘤中尚未见相关研究报道。为深入研究GDF-15与孤儿受体GFRAL在胰腺癌中的临床意义及其具体的分子机制,结合前期研究工作基础,我们提出如下研究设想:胰腺导管腺癌细胞能够自分泌分化生长因子GDF-15,作用于胰腺癌细胞自身膜上受体GFRAL,通过GDF-15/GFRAL信号通路,促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移。研究目的1.通过收集临床胰腺癌病例,检测胰腺癌组织及血浆样本中GDF-15、GFRAL的表达情况,分析二者之间表达的相关性,明确其异常表达对PDAC患者临床病理因素及生存预后的影响,为后续的机制研究提供依据。2.检测GDF-15及GFRAL在胰腺癌细胞系中的表达情况,分析二者在细胞水平表达的相关性。3.阐明胰腺癌自分泌GDF-15,可直接与细胞膜受体GFRAL结合,通过GDF-15/GFRAL信号通路,促进胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的分子机制。4.构建裸鼠皮下成瘤模型,在动物水平探讨GDF-15及GFRAL对胰腺癌体内成瘤的影响,为开发新的胰腺癌诊治策略提供新思路。研究方法1.采用酶联免疫吸附实验（ELISA）,检测正常人与胰腺癌患者血浆中GDF-15的表达情况,并用Graph Pad Prism 5软件分析GDF-15在正常人及胰腺癌患者血浆中的表达水平。同时,采用免疫组化（IHC）实验在正常人及胰腺癌组织中对GDF-15的表达进行验证。根据胰腺癌患者血浆中GDF-15表达的高低将PDAC病例分为高表达组和低表达组（区分高、低表达组的依据为GDF-15在所有胰腺癌血浆病例中表达的均值）,分别统计上述两组病例间PDAC患者年龄、性别、肿瘤临床分期分级、肿瘤大小以及术后生存预后等临床资料的差异性。2.通过ELISA实验,检测正常胰腺导管上皮细胞系HPDE以及四株胰腺癌细胞系（As PC-1,Bx PC-3,Panc-1和Hs766t）中GDF-15的表达情况,并用Graph Pad Prism 5软件分析GDF-15在正常及胰腺癌细胞系中的表达水平,从而在体外细胞系水平,对GDF-15在临床组织及血浆样本中的表达情况进行验证。3.采用免疫组化（IHC）实验在正常人及胰腺癌组织检测GFRAL的表达情况。根据免疫组化评分的高低将PDAC病例分为高表达组和低表达组,分别统计上述两组病例间PDAC患者术后生存预后等临床资料的差异性;同时,采用WB实验在正常胰腺导管上皮细胞株HPDE以及六株胰腺癌细胞系As PC-1,Bx PC-3,CFPAC-1,Panc-1,SW1990和Hs766t中检测GFRAL蛋白的表达情况。4.采用Graph Pad Prism 5软件,分别在胰腺癌临床样本以及胰腺癌细胞系中,统计分析GDF-15和GFRAL表达量之间的相关性。5.通过免疫荧光（IF）、激光扫描共聚焦（CLSM）等实验技术,在胰腺癌组织石蜡切片以及细胞系中行免疫荧光双标记GDF-15和GFRAL,在激光扫描共聚焦仪器上观察GDF-15及GFRAL在胰腺癌组织及细胞系中表达的共定位情况。采用免疫共沉淀（Co-IP）实验,在胰腺癌细胞系中,从分子水平上来验证GDF-15蛋白与GFRAL蛋白的直接相互作用。6.构建干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi和合成人重组GDF-15（Recombinant human GDF-15）细胞因子,分别下调和模拟上调GDF-15在胰腺癌细胞中的下调和上调表达,并采用CCK-8、Transwell、划痕实验等技术观察GDF-15对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移的影响。7.构建过表达慢病毒Lv-EGFP-GFRAL（+）以及其阴性对照慢病毒Lv-EGFP-GFRAL（-）,感染胰腺癌细胞,采用流式细胞筛选出稳定上调表达GFRAL蛋白的细胞,并采用WB实验检测GFRAL蛋白的过表达效率。使用人重组GDF-15细胞因子刺激Lv-EGFP-GFRAL（+）和Lv-EGFP-GFRAL（-）细胞,观察细胞增殖以及侵袭转移能力的改变情况。8.使用4周大小的BALB/c雌性裸鼠作为研究对象,通过接种带有干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi稳定下调表达GDF-15的As PC-1细胞（2×106个/只）构建胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型,30天后采用小动物成像系统（IVIS?Spectrum系统）观察GDF-15在裸鼠体内对胰腺癌细胞成瘤的影响。研究结果1.与正常人胰腺组织（7例）以及正常血浆（20例）相比较,GDF-15在胰腺癌肿瘤组织（21例）以及胰腺癌血浆（34例）中显着高表达（P<0.0001）;GDF-15高表达组中胰腺癌患者术后5年生存率明显低于GDF-15低表达组（P=0.0120）。2.在细胞系水平验证GDF-15的表达情况,不同胰腺癌细胞系中的表达水平不一致,其中在As PC-1中表达最高,在Hs766t中表达最低。3.与正常胰腺组织（13例）相比较,GFRAL在胰腺癌组织（117例）中明显高表达;GFRAL高表达组中胰腺癌患者术后5年生存率明显低于GFRAL低表达组（P=0.0272）。且GFRAL在胰腺癌细胞系中的表达情况与临床样本相一致。4.GDF-15及GFRAL在胰腺癌样本中表达的相关性,采用Graph Pad Prism 5软件统计分析发现,GDF-15与GFRAL的表达呈正相关（r2=0.6501,P=0.0009）。5.激光扫描共聚焦显示GDF-15与GFRAL在胰腺癌组织中共定位表达,且免疫共沉淀实验证明GDF-15与GFRAL蛋白能通过直接相互结合来发挥生物学作用。6.人重组GDF-15细胞因子能促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭转移;下调GDF-15的表达后,胰腺癌细胞系的增殖及侵袭转移能力显着减弱。慢病毒上调GFRAL表达后,GDF-15对胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移能力显着增强。7.在胰腺癌裸鼠皮下成瘤模型体内,与阴性对照组（Lv-GDF15-NC）比较,接种干扰慢病毒Lv-GDF15-RNAi As PC-1细胞组裸鼠皮下的肿瘤质量及体积明显较小（P=0.0286）。研究结论1.胰腺癌患者血浆及组织中GDF-15、GFRAL显着高表达,且与患者临床预后密切相关;可以作为胰腺癌患者临床诊疗的肿瘤标志物。2.在胰腺癌临床样本和细胞系中,GDF-15及GFRAL表达皆呈正相关。3.GDF-15及GFRAL在胰腺癌中共定位表达,且二者能直接相互结合。4.胰腺癌细胞可以自分泌GDF-15。5.GDF-15通过GFRAL受体促进胰腺癌细胞的增殖及侵袭转移。本研究通过深入探讨GDF-15/GFRAL通路对胰腺癌发生发展的影响。首次提出并证实胰腺癌细胞高表达孤儿受体GFRAL,并自分泌GDF-15,通过与PDAC细胞膜受体GFRAL直接相互结合,从而促进胰腺癌增殖及侵袭转移。进一步丰富了PDAC增殖及侵袭转移机制研究的理论宝库,并为临床PDAC增殖及侵袭转移的防治提供了新的潜在靶点。
李靖国[8]（2020）在《泮托拉唑对肝纤维化的影响及其机制》文中研究表明目的:肝纤维化是肝硬化的前驱过程,是各种慢性肝病发展到肝硬化的必经病理学过程。肝硬化是严重威胁人类健康的疾病,病人常常因各种并发症及肝功能衰竭而死亡。目前的研究普遍认为肝硬化是不可逆转的慢性进行性肝病,但肝纤维化是可逆性的病理改变。因此,抑制肝纤维化的发生发展是防止慢性肝病发展为肝硬化的关键,而对肝纤维化治疗的研究则具有重要的临床意义。迄今为止,针对肝纤维化机制的大量研究使得人们对肝纤维化的认识日益加深,但目前临床上尚无满意的防止肝纤维化形成和进展的药物。质子泵抑制剂泮托拉唑在临床上广泛应用于胃酸相关性疾病的治疗,除此以外越来越多的研究表明质子泵抑制剂有抗氧化、保护细胞膜、抑制炎症因子产生、抑制纤维化等作用。因此本课题旨在研究泮托拉唑的对肝纤维化的影响以及其具体的分子机制,希望能够找到一种有效的治疗肝纤维化的药物,阻止甚至逆转肝纤维化,改善慢性肝病病人的预后。方法:1.建立两种C57BL/6J雄性小鼠肝纤维化模型（CCL4诱导和TAA诱导）,进行泮托拉唑预防小鼠肝纤维化实验,设置正常组、模型组、对照组、泮托拉唑不同浓度处理组,观察泮托拉唑在动物模型中对肝纤维化的影响,利用Western Blot,HE,天狼星红染色,马松染色等实验技术观察泮托拉唑是否改善小鼠肝纤维化及其相关分子机制。2.体外培养人肝星状细胞LX2,利用TGFβ1诱导其活化从而模拟人肝纤维化的细胞过程,经过不同浓度泮托拉唑处理后,利用Western Blot,CCK8等技术观察泮托拉唑对活化LX2的影响及其相关分子机制。3.体外培养人正常肝细胞LO2,利用TGFβ1诱导其活化,经过泮托拉唑处理后观察LO2细胞形态变化,利用Western Blot检测肝纤维化小鼠体内EMT相关蛋白的表达变化,研究泮托拉唑对细胞上皮间质转化的影响。4.运用流式细胞周期实验技术检测不同浓度泮托拉唑对LX2细胞周期的影响。5.运用流式双染法（Annexin V-FITC/PI）检测不同浓度泮托拉唑对LX2凋亡的影响。结果:1.通过Western Blot,HE,天狼星红染色,马松染色等实验技术检测,在预防组中,泮托拉唑组对小鼠的肝纤维化有不同程度的改善作用并且通过TGFβ1-Smad3通路来调节肝纤维化的发生发展。在上皮间质化转移相关指标的检测中也显示泮托拉唑对上皮间质转化有抑制作用。2.在体外实验中,通过Western Blot,CCK8等技术检测,泮托拉唑对活化的LX2中纤维化的各项指标有明显的抑制作用并且通过TGFβ1-Smad3通路来调节肝纤维化的发生发展;泮托拉唑对LX2的增殖也有抑制作用。3.在对LO2细胞形态的观察中,正常组中细胞形态扁平,TGFβ1刺激组中大量细胞形态呈梭形,泮托拉唑处理组中梭形细胞占比减少。经WB检测发现泮托拉唑抑制了N-cadherin的表达,促进了E-cadherin的表达,说明泮托拉唑对人正常肝细胞的上皮间质转化有抑制作用。4.在流式细胞周期实验中,泮托拉唑组的LX2细胞周期G2/M期占比明显高于正常组LX2,这表明泮托拉唑组的LX2被阻滞在了G2/M期,表明泮托拉唑能够抑制LX2的细胞周期。5.在流式双染发凋亡实验中,泮托拉唑组LX2细胞的凋亡占比明显低于正常组LX2细胞,这说明泮托拉唑能抑制LX2的凋亡。结论:在CCL4和TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中,泮托拉唑能抑制肝纤维化的发生发展。泮托拉唑能抑制TGFβ1诱导的肝星状细胞活化。两者的机制均可能与TGFβ1-Smad3通路相关。表明泮托拉唑是一个潜在的肝纤维化临床治疗药物。
秦廷芹[9]（2020）在《IL-23与TGF-β在子宫内膜癌患者外周血及组织中的表达及相关性研究》文中认为目的:本研究旨在通过检测子宫内膜癌患者外周血及癌组织中白细胞介素-23（Interleukin 23,IL-23）与转化生长因子-β（Transforming growth factor,TGF-β）的表达情况,并分析二者在外周血及癌组织中的表达及其与子宫内膜癌的临床病理参数（手术病理分期、组织分级、肌层浸润深度、有无淋巴结转移）的关系及二者的相关性,从而探讨二者在子宫内膜癌的发生发展及免疫调节中的作用,以期为评价子宫内膜癌的疾病进展提供重要的参考指标以及为子宫内膜癌的临床免疫治疗提供重要的参考价值及理论依据。方法:随机选择2017年10月-2019年03月于青岛大学附属医院妇科住院经手术治疗的子宫内膜癌患者,所有患者均经手术病理确诊。留取子宫内膜癌患者术前外周血（内膜癌组）60例,并同期选择其石蜡包埋组织标本（内膜癌组）60例,患者年龄38-87岁,平均年龄为57.5岁,所有患者术前均未接受放化疗及内分泌治疗,且无其他肿瘤病史,手术方式为腹腔镜或开腹筋膜外或广泛全子宫切除+双附件切除+盆腔淋巴结清扫和/或腹主动脉旁淋巴结清扫术,病理分期参照2009年国际妇产联盟（FIGO）分期标准,Ⅰ期33例,Ⅱ期19例,Ⅲ期8例,组织分级:G1 22例,G2 27例,G3 11例,另随机选取同期因子宫肌瘤行全子宫切除的正常子宫内膜组织（对照组）30例,及其相应术前外周血（对照组）30例。采用ELISA法分别检测内膜癌组（60例）、对照组（30例）外周血标本中IL-23与TGF-β的表达浓度;采用免疫组织化学法分别检测子宫内膜癌组织即内膜癌组（60例）、正常子宫内膜组织即对照组（30例）中IL-23与TGF-β的表达情况。结果:1.子宫内膜癌患者外周血中IL-23的表达浓度（308.704±122.702 pg/ml）与对照组（179.811±47.868 pg/ml）相比显着增高（P<0.001）,并且随着子宫内膜癌分期的增加IL-23的表达浓度依次升高,各期之间差异均有统计学意义（P<0.001）,同时IL-23在有淋巴结转移的子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义（P<0.05）,在肌层浸润深度≥1/2的子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度高于肌层浸润深度<1/2的患者（P<0.05）,但IL-23在不同组织分级的子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度差异无统计学意义（P>0.05）。2.TGF-β在子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度（2750.838±721.447 pg/ml）显着高于对照组（1676.027±678.759 pg/ml）,差异有统计意义（P<0.001）,并且随着子宫内膜癌分期的增加TGF-β的表达浓度也依次升高,且各期之间的差异均有统计学意义（P<0.001）,同时TGF-β在有淋巴结转移的子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度显着高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义（P<0.001）,TGF-β在肌层浸润深度≥1/2的子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度高于肌层浸润深度<1/2的患者,差异有统计学意义（P<0.05）,TGF-β在高分化、中分化、低分化的子宫内膜癌患者外周血中的表达浓度依次升高,其差异具有明显的统计学意义（P<0.05）。3.子宫内膜癌组织（内膜癌组）、正常子宫内膜组织（对照组）中IL-23的阳性表达率分别为78.33%、26.67%,差异有统计学意义（P<0.05）;TGF-β在子宫内膜癌组织（内膜癌组）、正常子宫内膜组织（对照组）中的阳性表达率分别为81.67%、23.33%,差异有统计学意义（P<0.05）。4.子宫内膜癌患者外周血中IL-23与TGF-β的表达有相关性（r=0.39,P<0.01）,二者存在正相关性。结论:1.子宫内膜癌患者外周血中IL-23与TGF-β均呈高表达水平,并且随着子宫内膜癌患者临床病理参数（手术病理分期、组织分化、肌层浸润深度、淋巴转移）的分级越差,IL-23与TGF-β的表达水平亦逐渐升高,并且在子宫内膜癌组织中IL-23与TGF-β也呈现出表达明显升高的现象,表明IL-23与TGF-β可能参与了子宫内膜癌的发生发展的过程,同时亦表明子宫内膜癌患者机体内可能存在免疫失衡的过程,二者参与了子宫内膜癌的免疫过程。2.IL-23与TGF-β在子宫内膜癌患者外周血中的高表达呈正相关,说明二者可能通过一定的相互作用共同参与了子宫内膜癌的发生发展。
蔡碧莲[10]（2020）在《基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究》文中研究指明目的:观察荔枝核总黄酮（total flavone of Litchi chinensis Sonn,TFL）对体外HSC-T6细胞抗肝纤维化的作用机制的研究,为其进一步开发利用提供参考。方法:利用荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清干预HSC-T6 14d后,提取细胞的蛋白,利用蛋白DDA建库和定量DIA技术筛选出表达的差异蛋白,并且利用GO数据库对差异蛋白进行富集分析和注释、Pathway数据库进行信号转导通路分析、蛋白互作分析、亚细胞定位;利用TCMSP数据库筛选TFL的有效成分,在STRING10.5数据库构建TFL化学成分靶点蛋白互作网络,通过Gene Cards数据库获得TFL与肝纤维化相关靶点并对其进行生物信息学分析。结果:质谱数据检索鉴定出荔枝核总黄酮组与模型对照组共有6011个差异蛋白,上调蛋白有168个,下调蛋白有203个。通过GO分析差异蛋白主要参与了结合、催化活性、分子功能调节剂、转录调节活性等10种分子功能,细胞组件主要存在于细胞内、细胞器、细胞外、细胞膜上主要参与细胞过程、代谢过程、生物调节、调节生物过程等27种生物过程;通过KEGG分析,发现其主要涉及代谢途径、补体和凝血级联、肿瘤中的转录失调、NF-κB（核转录因子-κB）信号通路、PPAR（过氧化物酶体增殖物激活受体）信号通路、HIF-1（缺氧诱导因子1）信号通路等30条信号通路;通过对差异蛋白亚细胞定位发现上调蛋白主要分布在细胞外、线粒体、过氧化物酶、内质网、细胞质溶胶-过氧化物酶中,下调蛋白主要分布在细胞核、细胞质溶胶、细胞质膜、细胞质溶胶-核中。从TFL中筛选得到2个活性成分:分别为表儿茶素和槲皮素,共有72个潜在作用靶点,经与肝纤维化相关发病机制靶点进行核查对比,得出TFL与肝纤维化相关发病机制的15个作用靶点基因,其中包括MMP2（基质金属蛋白酶）、CCL2（趋化因子CC亚家族）、TP53（肿瘤抑制蛋白）、HMOX1（血红素加氧酶1）、IFNG（干扰素γ基因）等。上述靶点主要分布在细胞间质、分泌颗粒、蛋白质细胞外基质中,且主要通过免疫反应、趋化因子生物合成过程的正调控、T细胞增殖的正调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等分子功能来发挥对肝纤维化的治疗作用;上述靶点共涉及32条信号通路,其中基于目前研究显示与肝纤维化相关的信号通路有9条,分别为肿瘤信号通路、HIF-1信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、TNF（肿瘤坏死因子）信号通路、癌症中的Micro RNA、PI3K-Akt信号通路、NOD（核苷酸结合寡聚化结构域）样受体信号通路、NF-κB信号通路、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路。TFL治疗肝纤维化的“成分-靶点-通路”网络中IL1B（重组人白介素1beta）、IL6（白细胞介素6）、IFNG等基因是TFL有效成分治疗肝纤维化网络中的核心靶点（节点度值≥15,介数中心性>0.8）;肿瘤信号通路、TNF信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用信号通路是TFL有效成分治疗肝纤维化核心作用通路（节点度值≥5,介数中心性>0.001）。结论:蛋白DDA建库和定量DIA能快速筛选出差异蛋白,结合GO分析、KEGG分析能够以整体观阐释TFL体外抗肝纤维化的作用机制;HMOX1、NQO1,ACACA、CDK1蛋白发生异常表达时,能起到抗肝纤维化的作用。由此可推测TFL抗肝纤维化的作用机制可能与这4个差异蛋白的表达有关,这4个蛋白有可能是TFL抗肝纤维化的靶点蛋白。
二、转化生长因子β_1对人肝癌细胞的作用机制研究(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转化生长因子β_1对人肝癌细胞的作用机制研究(英文)（论文提纲范文）
（1）外泌体介导低氧相关信号通路在疾病发生发展中的重要作用（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.1.1 检索人及检索时间 |
| 1.1.2 检索文献时限 |
| 1.1.3 检索数据库 |
| 1.1.4 检索词 |
| 1.1.5 检索文献类型 |
| 1.1.6 手工检索情况 |
| 1.1.7 文献检索策略 |
| 1.2 入组标准 |
| 1.2.1 纳入标准 |
| 1.2.2 排除标准 |
| 1.3 质量评估 |
| 1.4 数据的提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 低氧环境下的外泌体 |
| 2.2 低氧相关信号通路 |
| 2.3 外泌体介导低氧相关信号通路调控疾病 |
| 2.3.1 低氧相关疾病中的外泌体与低氧诱导因子信号通路 |
| 2.3.2 低氧相关疾病中的外泌体与PI3K/Akt信号通路 |
| 2.3.3低氧相关疾病中的外泌体与核转录因子κB通路 |
| 2.3.4 低氧相关疾病中的外泌体与转化生长因子β信号通路 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（2）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（4）地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的临床研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 分组 |
| 1.5 随访及监测指标 |
| 1.6 观察和评价指标 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 检验方法 |
| 1.9 试验流程图 |
| 2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者主要基线特征 |
| 3.2 三组HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者失访率比较 |
| 3.3 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的影响 |
| 3.4 地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的影响 |
| 3.5 地五养肝胶囊降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 HBeAg阴性慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究进展 |
| 4.2 HBeAg阴性慢乙肝患者存在肝纤维化的异常肝再生微环境是其肝癌发生风险居高不下的重要机制 |
| 4.3 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用 |
| 4.4 地五养肝胶囊改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发病率的作用 |
| 5 小结 |
| 第二部分 体外实验研究地五养肝胶囊对肝星状细胞与肝癌细胞共培养体系中两种细胞的影响及其改善EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱的相关机制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β1 诱导LX2 活化以及LX2/HCCLM3 共培养体系中LX2的形态学观察 |
| 3.2 筛选DWYG含药血清最佳给药浓度 |
| 3.3 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞增殖的影响 |
| 3.4 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中两种细胞凋亡的影响 |
| 3.5 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系中HCCLM3侵袭能力的影响 |
| 3.6 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系LX2细胞EMT和 TGF-β/Smad信号通路相关m RNA的表达的影响 |
| 3.7 DWYG含药血清对LX2/HCCLM3 共培养体系EMT和TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝纤维化的异常肝再生微环境影响肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 4.2 地五养肝胶囊改善肝再生微环境防治肝癌发生发展的作用及其机制 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 肝再生信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 在校期间论文发表及参与科研情况 |
| 致谢 |
（5）LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LRG1 在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌组织中LRG1 蛋白表达与临床特征及生存预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LRG1 在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 LRG1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 肝癌的流行病学研究 |
| 1.2 肝癌的西医治疗现状 |
| 1.3 中医对肝癌的认识及诊疗进展 |
| 1.3.1 中医治疗肝癌的历史沿革 |
| 1.3.2 当代肿瘤学家对肝癌的认识 |
| 1.3.3 中西医结合治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4 参桃软肝方治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4.1 参桃软肝片的组方基础 |
| 1.4.2 参桃软肝方的研究现状 |
| 1.5 高通量测序的发展现状 |
| 1.5.1 高通量测序概述 |
| 1.5.2 转录组测序研究进展 |
| 1.5.3 基因功能富集分析 |
| 1.6 肝癌的表观遗传研究进展 |
| 1.6.1 表观遗传与甲基化 |
| 1.6.2 甲基化在肝癌中的研究现状 |
| 1.6.3 中医证候的DNA甲基化研究现状 |
| 1.7 网络药理学的发展概况 |
| 第二章 基于网络药理学的参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 参桃软肝方冻干粉的制备及质谱分析 |
| 2.1.2 主要药物化学成分搜集及筛选 |
| 2.1.3 药物靶点搜集与整理 |
| 2.1.4 GEO数据库寻找乙肝相关性肝癌的靶点 |
| 2.1.5 参桃软肝方化学成分-作用靶点网络的构建及关键靶点的分析 |
| 2.1.6 基因本体功能(GO)及KEGG通路富集分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 STR质谱分析及STR在网络药理学平台筛选的化合物及其对应靶点筛选结果 |
| 2.2.2 GEO数据库中乙肝相关性肝癌靶点基因获取结果 |
| 2.2.3 STR抗 HBV-HCC靶点基因的获取和GO功能注释及KEGGG通路富集分析 |
| 2.2.4 “药物-活性成分-关键作用靶点-通路”网络构建及分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 参桃软肝方的体外疗效研究 |
| 3.1 细胞实验研究 |
| 3.1.1 STR抑制人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 的增殖 |
| 3.1.2 STR 对人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 迁移的影响 |
| 3.2 STR对 BALB/c裸鼠皮下成瘤模型的抑瘤作用及安全性研究 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于高通量测序筛选STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及机制 |
| 4.1 STR对 HepG2.2.15 荷瘤裸鼠疗效的转录组学研究 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 对HepG2.2.15 荷瘤裸鼠肿瘤组织全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)分析 |
| 4.2.1 实验步骤 |
| 4.2.2 实验结果 |
| 4.3 转录组测序和WGBS关联分析 |
| 4.3.1 关联基因的筛选 |
| 4.3.2 关联基因的GO注释与KEGG通路富集分析 |
| 4.4 临床HBV-HCC肝癌术后标本WGBS及差异甲基化基因筛选 |
| 4.4.1 临床样本的搜集 |
| 4.4.2 肝癌及癌旁组织样本WGBS测序 |
| 4.4.3 检测结果 |
| 4.5 临床样本WGBS与动物测序结果关联分析 |
| 4.5.1 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因筛选 |
| 4.5.2 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因GO与 KEGG分析 |
| 4.5.3 Hub基因的外部数据库验证 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 第六章 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 GDF-15在胰腺癌中的表达情况及与临床的相关性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 GDF-15对胰腺癌细胞增殖及侵袭转移的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 GFRAL在胰腺癌中表达情况、临床意义及其与GDF-15 表达的相关性 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 GDF-15 通过与孤儿受体GFRAL直接结合促进胰腺癌进展 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 生长分化因子GDF-15的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）泮托拉唑对肝纤维化的影响及其机制（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）IL-23与TGF-β在子宫内膜癌患者外周血及组织中的表达及相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 资料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果判读 |
| 1.5 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 IL-23与TGF-β在内膜癌组和对照组患者外周血中的表达水平 |
| 2.2 子宫内膜癌患者外周血中IL-23与TGF-β的表达与子宫内膜癌临床病理参数的关系 |
| 2.3 IL-23与TGF-β在两组子宫内膜组织中的表达情况 |
| 2.4 IL-23与TGF-β在子宫内膜癌患者外周血中表达的相关性 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 IL-23在子宫内膜癌中的表达意义 |
| 3.2 TGF-β在子宫内膜癌中的表达意义 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（10）基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠肝纤维化模型的建立与鉴定 |
| 2.1.1 大鼠肝纤维化模型的建立 |
| 2.1.2 大鼠肝纤维化模型的鉴定 |
| 2.2 实验分组及用药 |
| 2.3 HSC-T6细胞的培养 |
| 2.3.1 准备工作 |
| 2.3.2 HSC-T6细胞的传代 |
| 2.3.3 HSC-T6细胞的换液 |
| 2.3.4 HSC-T6细胞的冻存 |
| 2.3.5 HSC-T6细胞的复苏 |
| 2.4 细胞计数方法 |
| 2.5 MTT法测定荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清对HSC最大无毒浓度(TC0) |
| 2.6 各组药物和含药血清对肝星形细胞的干预 |
| 2.7 肝星形细胞蛋白的提取 |
| 2.8 肝星形细胞蛋白提取质控 |
| 2.9 肝星形细胞蛋白酶解 |
| 2.10 DDA建库和DIA定量检测(Nano-LC-MS/MS) |
| 2.11 信息分析流程 |
| 2.12 TFL有效成分及有效成分潜在靶点的筛选 |
| 2.13 TFL化学成分靶点蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 |
| 2.14 TFL与肝纤维化相关靶点的筛选 |
| 2.15 TFL对肝纤维化作用靶点的生物信息学分析 |
| 2.16 TFL“成分-靶点-通路”网络构建及核心靶点筛选 |
| 2.17 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肉眼及镜下对大鼠肝纤维化病变观察 |
| 3.2 荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清对HSC-T6细胞的增殖抑制作用 |
| 3.3 荔枝核总黄酮组和模型对照组蛋白质组学 |
| 3.4 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因功能GO分析 |
| 3.4.1 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因生物过程(BP)分析 |
| 3.4.2 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因细胞组件(CC)分析 |
| 3.4.3 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因分子功能(MF)分析 |
| 3.5 荔枝核总黄酮组和模型对照组差异蛋白Pathway富集分析 |
| 3.6 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白互作分析(PPI) |
| 3.7 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异表达蛋白亚细胞定位 |
| 3.8 TFL有效成分及有效成分潜在靶点的筛选 |
| 3.9 肝纤维化靶点筛选及与TFL靶点的对比分析 |
| 3.10 TFL对肝纤维化作用靶点的生物信息学分析 |
| 3.11 TFL“成分-靶点-通路”网络分析及核心靶点 |
| 4 讨论 |
| 4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 4.2 荔枝核总黄酮抗肝纤维化的理论依据 |
| 4.3 中医药对肝纤维化的防治 |
| 4.4 网络药理学与中医药 |
| 4.5 蛋白质组学与肝纤维化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 蛋白质组学在中医药抗肝纤维化中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、转化生长因子β_1对人肝癌细胞的作用机制研究(英文)（论文参考文献）
- [1]外泌体介导低氧相关信号通路在疾病发生发展中的重要作用[J]. 顾霞,王平义,赵万花,林语诗,李一梅,李文华. 中国组织工程研究, 2022(19)
- [2]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [4]地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制研究[D]. 陈乞. 湖北中医药大学, 2021
- [5]LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响[D]. 张彦收. 河北医科大学, 2021(02)
- [6]基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制[D]. 贺凡. 广州中医药大学, 2020(09)
- [7]GDF-15通过孤儿受体GFRAL促进胰腺癌增殖及侵袭转移的机制研究[D]. 赵志平. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [8]泮托拉唑对肝纤维化的影响及其机制[D]. 李靖国. 遵义医科大学, 2020
- [9]IL-23与TGF-β在子宫内膜癌患者外周血及组织中的表达及相关性研究[D]. 秦廷芹. 青岛大学, 2020(01)
- [10]基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究[D]. 蔡碧莲. 广西中医药大学, 2020(02)
标签：肝癌论文; 肿瘤论文; 转化生长因子-β论文; 细胞生长因子论文; 血清蛋白论文;