一、可能导致美国爆发超强毒新城疫的危险因素（论文文献综述）
刘栋[1]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中进行了进一步梳理在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
常爽[2]（2010）在《非主要组织相容性复合体宿主遗传变异对马立克氏病疫苗效力的影响》文中研究说明为了降低马立克氏病（Marek’s disease,MD）潜在暴发的危险,目前控制MD的主要策略集中在遗传抗性和最佳疫苗的研究方面。早在20世纪90年代就有研究证明,鸡的主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）单倍型在MD疫苗效力中扮演着关键性的作用。但是到目前为止,还没有见到非MHC宿主遗传变异对疫苗效力影响的报道。本研究利用两个无特定病原的近交品系63,72以及由它们衍生而来的一系列重组同类品系（Recombinant Congenic Strains,RCS）进行疫苗接种和攻毒实验来检测宿主遗传变异对疫苗效力的影响。结果显示,非MHC宿主遗传变异是影响疫苗效力的一个重要因素,对鸡免疫攻毒后MD的发生率和生存天数都具有显着影响（P<0.01）。进而本研究进行了重组DNA候选疫苗rMd5ΔMeq、商业疫苗CVI988/Rispens和火鸡疱疹病毒苗HVT在高抗性（63）和易感性（72）两个品系中疫苗效力的演化比较。结果显示:在63和72两个鸡品系中,rMd5ΔMeq能够抗MDV特超强毒株,提供最好的保护效果,证明rMd5ΔMeq疫苗接种能更有效地保护感染鸡抵抗MD。最后,rMd5ΔMeq、CVI988/Rispens和HVT三种疫苗的效力在19个重组同类系鸡中进行了比较实验。结果显示不同品系鸡的遗传背景影响MD疫苗的效力,进一步验证了以上的实验结果和结论。非MHC宿主遗传变异不仅影响鸡对MD的遗传抗病能力,而且影响MD疫苗效力。培育MD抗性鸡是有效控制MD一项重要策略。这些发现以及由此而得出的结论很可能在不久的将来催生一场新疫苗的设计、生产与使用,从而使疫苗这一拥有显着历史贡献的生物试剂更佳有效地为预防动物甚至人类疾病服务。
张洪海[3]（2009）在《山东省家禽肿瘤性疾病流行病学调查及GIS预警系统的建立》文中研究说明禽肿瘤性疾病作为世界范围发生的疾病,严重危害养禽业的发展,具有重要的经济意义。其中危害最严重的主要包括马立克氏病（Marek’s disease,MD）、禽白血病（Avian leukaenia,AL）和网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）。这三种肿瘤性疾病世界各地均有所流行,并且发生免疫失败和出现强毒力致病型毒株的报道不断增多,造成了巨大经济损失。所以有效预防和控制这些疾病将是我们今后研究的重点,也是当今巨大的挑战之一。本课题将结合血清学检测、临床诊断、病理组织学、免疫组织化学、PCR检测以及肿瘤相关的环境因素的调查研究,对山东省境内家禽肿瘤性疾病的流行现状做系统调查,及时掌握疾病感染所波及的范围及影响因素,寻找肿瘤的发生与病毒感染、环境因素之间的相关性,并结合地理信息系统（GIS）,建立一套完整、系统的预警机制,从而对我省家禽肿瘤性疾病做到有效预防。血清学检测主要通过琼脂扩散试验、ELISA方法对山东省境内AA种鸡（4周龄以上）的MD、AL、RE进行抗原或抗体检测。此外,我们还通过血凝、血凝抑制试验对NDV进行抗体水平的检测,从而研究肿瘤性疾病与这些常规病之间的关系,以及抗体消长规律对肿瘤发生的影响。结果显示,MD、AL、RE在山东省境内的AA种鸡场普遍存在,MD平均抗原阳性率为3.38%,而AL、RE平均抗体阳性率分别为10.31%、40.36%。血凝、血凝抑制试验检测结果显示病毒性肿瘤疾病高发区域,新城疫抗体普遍较低。这表明感染肿瘤性病毒的鸡群体液免疫被广泛的抑制,对NDV疫苗的抗体生成能力有所下降。对山东省境内57份活鸡进行剖检取样,通过病理组织学观察和免疫组织化学检测结果表明,发病鸡在肝脏、脾脏、肾脏、腺胃、骨髓等组织内存在MDV、ALV-J或REV抗原的阳性信号。所有被检鸡中有38.6%鸡只组织呈MDV抗原阳性,淋巴细胞增生灶中,可见阳性细胞成团或散在存在;有54.39%在骨髓、肝脏和肾脏等内脏器官中存在ALV-J抗原的表达,呈强阳性染色;28.07%检测病例为REV阳性;其中MDV+ALV-J双重阳性率为12.28%;MDV+REV双重阳性率为5.26%;ALV-J+REV双重阳性率为8.77%;MDV+ALV-J+REV三重阳性率为3.51%。PCR检测结果表明MDV、ALV-J、REV的阳性率分别为43.86%、64.91%、33.33%,MDV+ALV-J双重阳性率为15.79%,MDV+REV双重阳性率为10.53%,ALV-J+REV双重阳性率为12.28%,MDV+ALV-J+REV三重阳性率为7.02%。通过病理组织学观察发现肿瘤发生的部位主要在肝脏,其次依次为脾脏、腺胃、肾。免疫组织化学检测和PCR检测结果从病原学的角度表明,MDV、ALV-J和REV在我省的流行。利用PCR敏感性、特异性强的特点可以检测出带毒而未出现临床症状的鸡只,确定早期感染;而免疫组化则通过抗原定位确定病毒在机体内的分布情况以及代谢消长规律。实验显示免疫组化结果与病理组织学符合,肝脏、脾脏抗原阳性信号最多、最强;PCR阳性率明显比免疫组化阳性率高,MDV、ALV-J和REV免疫组化和PCR双阳性率分别为33.33%、52.63%、21.05%,免疫组化符合程度依次为76%、81.08%、63.16%。免疫组化和PCR检测结果表明所检鸡只存在早期感染和混合感染现象。通过对家禽所在环境因素的调查研究,把病毒感染和其它影响因素相结合,鉴定禽肿瘤危险因素之间的相关性,并根据群体暴露与生存环境等因素的相互作用,确定肿瘤危险度,并建立相应的数据库。通过对山东省境内20个种鸡场的饲养环境进行记录、分析、统计发现,鸡场本身环境的管理至关重要,特别要注意疫苗免疫、温度、湿度、通风、密度、等问题,调查发现肿瘤性疾病的发生与疫苗的污染有直接或间接关系,而温度、湿度过高或过低区域肿瘤阳性率均比较高;另外,场址的选择要结合所在区域的地形地貌、气候,并远离可能有污染的地方。本实验最终运用地理信息系统（GIS）技术,以山东省基础地理数据库为基础,结合禽肿瘤性疾病流行病学数据库,以软件工程模式开发建立了“山东省家禽肿瘤性疾病GIS预警系统”。本系统通过禽肿瘤性疾病地理分布研究疾病流行趋势,结合有关环境监测资料,进一步研究疾病发生与传染源、传播途径、易感动物的关系,以及区域性流行特征,并根据历年的疾病流行情况,通过地理信息动态分析,描绘流行趋势图,以掌握地区间的消长趋向,为防制家禽肿瘤性疾病提供科学依据。
王韫[4]（2008）在《鸡传染性法氏囊病病毒感染与血管内凝血的研究》文中研究指明本文研究了鸡人工感染传染性法氏囊病病毒后,鸡的血液学的变化情况,以及随之产生的组织学的病理变化。鸡在感染了传染性法氏囊病病毒后,血液出现一系列的病理变化,并导致胸肌、腿肌、脏器等多处出血的病理现象。本试验从血液学研究出发,为本病的防治提供了新的思路和理论依据。疾病模型建立试验结果表明:通过点眼、滴鼻、刷肛和腿部肌肉注射接种IBD病毒液共计1mL/只,可成功复制IBD疾病模型,死亡率达30%,与临床发病情况基本一致。分别于攻毒前、攻毒早期（0～80h）、攻毒晚期（80～120h）和耐过期心脏采血,取得血液样本;健康对照组同时采集血液样本。采用标准试剂盒对血液样本进行测定,分别测定了凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、抗凝血酶-Ⅲ活性、抗凝血酶-Ⅲ含量、D-二聚体含量和纤维蛋白原含量等血液学指标。结果显示,感染鸡的凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间在攻毒早期和攻毒晚期出现了5min不凝或变稠的现象,与攻毒前、耐过期及健康组比较差异极显着（P＜0.01）;抗凝血酶-Ⅲ活性及含量在攻毒早期和攻毒晚期出现了明显的下降,与攻毒前、耐过期及健康组比较差异极显着（P＜0.01）;D-二聚体含量在攻毒早期和攻毒晚期出现了明显的上升,与攻毒前、耐过期及健康组比较差异极显着（P＜0.01）;纤维蛋白原含量在攻毒早期和攻毒晚期出现了明显的下降,与攻毒前、耐过期及健康组比较差异极显着（P＜0.01）。攻毒组的攻毒前及耐过期各指标与健康对照组比较差异不显着（P＞0.05）。结果表明,鸡在感染IBDV后,发生了弥散性血管内凝血（DIC）。采集了感染鸡的法氏囊、脾脏和肝脏,选用磷钨酸.苏木精染色和HE染色等染色方法对组织切片进行处理,并于光学显微镜下观察病变情况。法氏囊滤泡的皮质和髓质部出现淋巴细胞变性坏死,淋巴细胞明显减少,淋巴滤泡的皮质部变薄,几乎被网状细胞和结缔组织所代替,髓质部呈网状,见有大小不等的囊泡,囊泡腔内有团块状玻璃样物,囊上皮细胞也开始增生表现伪腺样构造。脾脏的淋巴小结和腺样鞘动脉周围淋巴细胞变性、坏死,严重时全部淋巴细胞消失,网状内皮细胞增生。在肝脏、脾脏和法氏囊组织中见到经磷钨酸-苏木精染色的微血栓,进一步证明了DIC的发生。试验证实,鸡感染传染性法氏囊病病毒后,其血液学指标发生了一系列病理变化,并继发了DIC的发生。
贾珊珊[5]（2007）在《H7亚型禽流感病毒HA、HA1基因重组杆状病毒表达及其抗原性检测》文中指出禽流感（Avian Influenza，AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的传染性疾病综合症。低致病力禽流感常引起呼吸道症状，产蛋量下降。高致病性禽流感，一旦暴发，将会给中国乃至世界很多国家养禽业造成相当严重的经济损失。同H5亚型禽流感相比，H7亚型禽流感的暴发同样会给养禽业造成巨大的损失。H7亚型禽流感病毒不仅能侵袭鸡鸭等家禽，还能使笼养宠物鸟致病（如H7N1型），甚至能感染人类。AIV基因组为8节段负链RNA，共编码10种与病毒结构和功能相关的蛋白质，其中血凝素（Hemagglutinin，HA）是AIV囊膜纤突的主要成分之一，血凝素（HA）是流感病毒的主要表面糖蛋白，HA具有产生中和抗体的能力，可产生免疫保护作用，因此血凝素在禽流感的诊断和防制中起重要作用。本研究以试验室保存的pMD18-T-H7-HA阳性质粒为模板，去除HA编码信号肽的核苷酸部分，应用生物学软件Primer5.0和Oligo4.0，分别设计HA和HA1两对引物，扩增出HA和HA1基因。并分别将其克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A的SacⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点上，命名为pBlueBacHis-H7-HA和pBlueBacHis-H7-HA1。纯化重组质粒并与杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，5d后获得重组病毒，命名为P1。将经过3轮蚀斑筛选纯化的重组病毒接种Sf9细胞大量繁殖后收获，PCR鉴定结果为完全纯化的病毒命名为P2。接种P2于Sf9单层细胞上，4d后收获病变细胞，经SDS-PAGE电泳鉴定，表达产物HA、HA1融合蛋白分子量约为66ku和42ku，与理论值相符。表达产物的Westernblotting和Dot-ELISA结果表明其可与鸡抗H7亚型血清发生特异性抗原反应，而与H5和H9亚型鸡抗血清间无交叉反应。血凝试验和间接免疫荧光试验证明了重组HA、HA1蛋白具有良好的生物学活性。本试验利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的重组H7亚型HA、HA1蛋白为可溶性的，带有6个组氨酸标签，较易纯化。重组HA、HA1蛋白具有良好的抗原性。因此，杆状病毒高效表达的重组HA、HA1蛋白在H7亚型禽流感病毒诊断及新型亚单位疫苗研究方面具有发展前景。
陈溥言[6]（2006）在《畜禽传染病发生的新特点与流行病学防制》文中研究说明动物流行病,特别是人畜共患病是目前大家都很关注的话题。而研究目前传染病发生的新特点与流行病防制问题也是时势之需。本文详细地从传染病发生的因素、病毒变异的新特点、对防制传染病应采取的措施、流行病学综合防治的策略、社会因素对传染病的影响等几个方面作了阐述,值得一读。
钱皎,王睿[7]（2005）在《人类禽流感病毒感染特点与防治对策》文中指出
高海[8]（2004）在《外源性核酸影响感染法氏囊病毒雏鸡免疫功能的研究》文中进行了进一步梳理临床健康海兰白雏鸡240 羽,随机分为6 组,每组40 羽,1 组为对照组,2 6 组为试验组。于20 日龄时测定传染性法氏囊病毒（IBDV）抗体,6 组鸡均表现阴性。24 日龄在基础日粮中添加核酸,1、4 组不添加,2、5 组添加0.1%核酸,3、6 组添加0.2%核酸。27 日龄时用IBDV0.3ml/羽对第46 组试验鸡攻毒。各组鸡分别在30、33、36、39、42 日龄时心脏及剖检取样进行T淋巴细胞转化率、血清中SOD 活性、血清中IgA、IgG、IgM、MDA 及UA 含量及法氏囊和胸腺重测定。结果如下: 1.攻毒IBDV但不饲喂核酸的第4组与对照相比,T淋巴细胞转化率及SOD值降低,且除42 日龄外二者与对照组均存在显着差异（P<0.05）;MDA 值增高,且各日龄水平下与对照组均差异显着（P<0.05）;从33 日龄起,IgA、IgG、IgM 含量均增高于对照组,但差异不显着（P>0.05）;法氏囊及胸腺重均降低,且在30、33、36 日龄时与对照组均存在显着差异（P<0.05）。表明感染IBDV 的雏鸡其免疫力降低。2.攻毒IBDV 同时饲喂核酸组（第5、6 组）与第4 组相比,T 淋巴细胞转化率及SOD 值升高,且除42 日龄外均差异显着（P<0.05）;血清中MDA含量降低,但仅39 日龄时第6 组与第4 组差异显着（P<0.05）;血清中IgA、IgG、IgM 含量均增高,但与第4 组也无显着差异（P>0.05）;法氏囊及胸腺重均增高,第6 组法氏囊重在30、33、36 日龄时与第4 组差异显着（P<0.05）,第5 组与第4 组在各日龄水平下其法氏囊重均差异不显着（P>0.05）;第6组除39 日龄外,其胸腺重均显着高于第4 组（P<0.05）,第5 组在30、36日龄也存在显着差异（P<0.05）。与对照组相比,各测定项目间无显着差异（P>0.05）。第5 与第6 组相比,第6 组39 日龄时SOD 活性、42 日龄时MDA 含量及
耿捷[9]（2004）在《基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究》文中研究表明新城疫（New Castle Disease，ND）是新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性禽类传染病，被世界动物卫生组织（OIE）定为A类传染病。新城疫病毒（NDV）是副黏病毒科、副黏病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员，为有囊膜的负链RNA病毒，可存在于病禽的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。目前国内对于新城疫的诊断，主要是采用传统的病原分离鉴定及血凝抑制试验（HI）等血清学试验，与西欧、美国和日本等一些国家所采用的分子生物学诊断方法相比，技术上有较大的差距。我国加入WTO后，禽类产品国际贸易进一步增加，但传染病病原检测技术上的差距在禽类产品检验检疫中表现得更为突出，使我国禽类产品贸易在国际竞争中处于劣势。为改变这一不利局面，研究先进的传染病病原检测方法已成为当务之急。OIE推荐的诊断新城疫的方法有病毒分离鉴定，HI，鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）、6周龄鸡静脉接种致病指数（IVPI）等致病指数试验，这些试验不但需要较长的时间，而且有散毒的隐患。目前我国出入境检疫中对新城疫病毒的检测方法主要有泻殖腔棉拭子样品病毒分离鉴定、HI和ELISA，RT-PCR检测技术正在试用之中。国外一些学者利用RT-PCR和nested-PCR结合序列分析等分子生物学技术对NDV进行了检测研究，这些技术具有快速、准确、无散毒性等特点，已被OIE推荐为评估NDV毒力的试验方法，西欧少数国家和日本在禽类产品国际贸易中已经开始采用这些方法进行NDV检疫，这些都为NDV检测技术的发展奠定了基础。基因芯片技术近年来在分子生物学研究和疫病检测方面发挥着越来越大的作用。利用基因芯片可加速对病毒基因组的功能分析；可建立遗传病的突变检测技术，并成为对多种遗传病的常规诊断技术；可用来监测宿主细胞基因表达的改变，研究病毒的致病机理；基因芯片还可用来对细菌基因的分型和菌种鉴定，为筛选和监测细菌的抗药性基因提供基础数据。目前我国在出入境检验检疫中，已开始在基因芯片技术检测传染病病原方面开展了研究工作，国家质检总局动植物检疫所研制出了检测SARS病毒的全基因芯片，极大的促进了出入境检验检疫检测技术的发展，但目前国内外尚未见到有关新城疫病毒基因芯片的报道。本文开展了基因芯片技术检测新城疫病毒和RT-PCR结合内切酶技术鉴别新城疫强弱毒株的研究，为我国对新城疫的快速准确诊断奠定了技术基础。1.应用基因芯片技术检测新城疫病毒在本试验中，我们依照寡核苷酸探针设计原则，设计出了30条20 mer寡核苷酸阵列，以期能平行、特异的检测NDV。通过对6株病毒的检测结果显示，在探针位点上，<WP=6>6个样品均检测到了阳性的荧光信号，而阴性及空白对照没有检测到信号，说明本芯片具有较好的稳定性和灵敏性。通过特异性试验检测禽流感病毒（AIV）H5、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的结果也表明，芯片杂交信号正确，具有良好的特异性。由于该芯片敏感性强、准确性高、特异性强、重现性好，且操作简单，成本较低，为新城疫病原的检测提供了一种新的有效手段，完全适用于新城疫病原的大规模筛检和快速检测，对出入境动物检验检疫具有重大意义。2.应用RT-PCR结合内切酶技术鉴别新城疫强弱毒株本试验扩增的序列为新城疫病毒F-糖蛋白基因的4893～5031序列，在其弱毒株序列中有BglⅠ内切酶的酶切位点，而此位点是强毒株序列所没有的。根据这一特性，用RT-PCR方法结合内切酶分析来鉴别45株NDV分离株的毒力，此结果与OIE标准中MDT毒力测定结果基本一致。在45株NDV分离株中，41株酶切结果只有202bp片段，为强毒株，与MDT结果相同。其余有4株（序号为8，9，10，44）的MDT在60h以上，其酶切结果表明2株（10，44）只有135bp和67bp，为弱毒株，2株（序号为8，9）除135bp和67bp，还有202bp片段，表明这2个毒株含有强弱毒双重序列，怀疑可能是受到强毒污染所致；弱毒株对照LaSota株的酶切结果清楚显示只有弱毒株序列。国内2株疫苗株的分析结果为弱毒序列。说明此方法可区分强毒株、弱毒株及疫苗株。应用RT-PCR对国内的45株分离株进行PCR扩增，其结果进一步证实了分离NDV的其他血清学结果（HA，HI等）。结合内切酶分析，能更进一步确定分离株毒力的强弱。传统的MDT，ICPI和IVPI等强弱毒鉴定方法过程繁琐，操作费时、费力，从接种到结果判定需7～10d的时间，并且在操作过程中有引起交叉污染和散毒的可能性。本试验采用RT-PCR结合内切酶分析，有效的避免了这些方法的不足，并且操作简便、快速，可在24～36h内确定分离株的毒力，也减少了散毒和分离样品在处理过程发生交叉污染的可能性。该方法不仅能鉴别样品中新城疫病毒的强弱，还可诊断APMV-1引起的其他禽类的感染，如本研究中诊断企鹅，鸽子和鸵鸟的感染等，因此，对促进出入境动物检验检疫技术的发展，打破发达国家的技术壁垒具有重大意义。
何启盖[10]（2000）在《猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究》文中认为伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科猪疱疹病毒Ⅰ型（Suid HepervirusⅠ，SHV-Ⅰ）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者，本病可引起严重的繁殖障碍，给养猪业造成较大的经济损失。及时准确地诊断，并采用安全有效的疫苗进行免疫预防，是控制该病的主要措施。为了给我国的养猪业提供安全有效的疫苗和快速、特异的可在现场进行诊断的方法，因此，开展本研究。本研究由三个互相关联的试验组成。 1．TK／gG-疫苗的研究 测定并比较了伪狂犬病病毒鄂A亲本毒株、基因缺失突变株及Bartha株在BHK-21细胞上的增殖滴度和对Balb／C小白鼠的LD50，说明对TK和gG基因的人工改造并未影响其在细胞上的生长能力；所有的TK基因突变株（包括TK-／gG-）对Balb／C小白鼠的毒力低于亲本毒株和Bartha株；亲本毒株、TK-／gG-／LacZ+、Bartha株对成年家兔的LD50。的高低顺序依次为：鄂A野毒株、TK-／gG-／LacZ+、Bartha株：TK-／gG-／LacZ+突变株与国外目前广泛使用的NIA-783株和Begonia株的残余毒力相近。用不同滴度的TK-／gG-／LacZ+突变株接种血清学阴性妊娠母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔，无流产和产死胎、木乃伊胎，1日龄仔猪接种前后体温变化不显着（P＞0.05），也不影响增重，对猪是安全的。 将TK-／gG-突变株在PK-15细胞上连续传25代，每间隔5代次用PCR均能检测到已经缺失了205bp的TK基因（758bp）和插入gG基因中的LacZ基因，表明各代次毒株的遗传标志是稳定的，从分子水平证明该突变株毒力不会返强。 将不同剂量的TK-／gG-／LacZ+突变株接种抗体阴性猪，免疫猪后1个月，根据中和抗体水平和抗体阳转率的差异，确定了以105.0TCID50,为最小免疫剂量。 应用鸡胚成纤维细胞，采用转瓶培养方式增殖而获得的疫苗病毒含量为106.3TCIDs50／mL，为免疫剂量的13倍，将疫苗病毒与明胶保护剂混合经冻干后制成了弱毒活疫苗。疫苗的安全性测定表明，该疫苗对Balb／C小白鼠、妊娠母猪是安全的；疫苗接种15同龄仔猪，不能引起接种猪的体温升高，哨兵猪的体温没有升高，也没有抗体阳转，说明疫苗毒株的毒力已极大下降，而且缺失了TK基因后使疫苗毒株丧失了从免疫猪向非免疫猪水平传播的能力。 用该疫苗免疫抗体阴性仔猪、育肥猪和母猪，1周后可检出中和抗体；在育肥猪中抗体可持续5个月左右，抗体阴性的商品猪只需免疫1次即可。但是对于有母源抗体的仔猪，采用间隔4周加强免疫比提高免疫剂量、只免疫1次的方法可更有效地克服母源抗体的干扰。与弱毒疫苗相比，用灭活疫苗免疫的母猪可给哺乳期的仔猪提供更高水平的母源抗体，但两者的持续期均为50-70天。 免疫效力测定说明，研制的TK-／gG-疫苗可于接种后1周能使Balb／C小鼠耐受华中农业大学博士学位论文:猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究IOOLD50野毒的攻击;免疫后1个月，也使妊娠母猪能抵抗高达1护。TCIDS。的强毒攻击，并给仔猪提供坚强的被动免疫保护。几种不同遗传背景的疫苗给小白鼠提供的保护力高低顺序依次为Ea TK一/gG一、Begonia、NIA一783、Bartha株;刺激猪产生的抗体水平依次为N工A一783、Ea TK一/gG一、Begonia、Bartha。疫苗置一20℃、一4℃可分别保存12个月、6个月。 综上所述，以鄂A株为亲本毒株构建的TK一/gG一基因缺失疫苗具有安全性高，免疫效果优于某些国外同类产品，生产工艺成熟，完全可以进入中试阶段的研究。2.伪狂犬病毒抗体乳胶凝集试验的建立 用BHK一21细胞增殖猪伪狂犬病毒鄂A株，病毒培养上清液经硫酸钱沉淀，聚乙二醇浓缩。浓缩病毒与等量经胰酶处理的空白乳胶致敏制成凝集试验抗原。用此抗原与伪狂犬病毒标准阳性血清，免疫猪血清和临床发病猪血清以及新鲜血样样品，均呈明显的凝集反应;与标准阴性血清和临床未感染猪伪狂犬病毒猪的血清均不发生凝集反应;与猪瘟阳性血清、衣原体阳性血清、均呈阴性反应，证实本试验具有很高的特异性，抗原可在4℃条件下保存12个月;该方法比中和试验敏感、特异，整个检测过程可在1一3分钟内完成，可用于实验室和现场对伪狂犬病毒抗体的定性和定量检测。3.伪狂犬病病毒gE基因转移载体的构建 从含有伪狂犬病病毒鄂A株Sph工一A片段的重组质粒pBSA中通过酶切、克隆和亚克隆获得大小约为4.IKb含gE基因的目的片段，克隆到pBluescriPt HSK（+）载体，随后引入BamHI接头，将报告基因LacZ表达盒插入BamHI接头中获得重组子，PCR扩增和酶切鉴定证明己构建伪狂犬病病毒gE基因插入失活的转移载体，为开展TK一/gE一突变株的构建奠定基础。
二、可能导致美国爆发超强毒新城疫的危险因素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、可能导致美国爆发超强毒新城疫的危险因素（论文提纲范文）
（1）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（2）非主要组织相容性复合体宿主遗传变异对马立克氏病疫苗效力的影响（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 马立克氏病：一百年 |
| 1.1 MD研究的历史 |
| 1.2 MDV生物学特性 |
| 1.3 MD流行病学 |
| 1.4 MD病理学 |
| 1.5 MDV致病机理和肿瘤生成 |
| 1.6 MDV 感染的免疫反应 |
| 1.7 MDV分子生物学 |
| 1.8 MDV的演化 |
| 1.9 MDV疫苗 |
| 1.10 目前控制MD的策略 |
| 第2章 鸡抗马立克氏病遗传抗性研究 |
| 2.1 主要组织相容性复合体与MD遗传抗性 |
| 2.2 非主要组织相容性复合体与MD遗传抗性 |
| 2.3 B同类系鸡与MD抗性 |
| 2.4 B同类系鸡抗MD疫苗免疫力 |
| 2.5 MD抗性与重组同类系鸡 |
| 2.6 基因组与MD遗传抗性 |
| 2.7 抗病育种展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 宿主遗传变异对马立克氏病疫苗效力的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 抗性鸡和易感鸡马立克氏病疫苗效力的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 19 个重组同类系马立克氏病疫苗效力比较 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师及作者简介 |
（3）山东省家禽肿瘤性疾病流行病学调查及GIS预警系统的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 禽肿瘤性疾病流行现状 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病原分类 |
| 1.2 形态学及生物学特性 |
| 1.3 病毒结构 |
| 1.4 病原新特点 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 传染源、传播途径和易感动物 |
| 2.2 发生和分布 |
| 2.3 流行新特点 |
| 3 病理变化 |
| 3.1 常见症状 |
| 3.2 新变化 |
| 4 鉴别诊断 |
| 5 预防 |
| 第二章 地理信息系统（GIS）研究现状及其在流行病学中的应用 |
| 1 GIS 的研究现状及内容 |
| 1.1 地理信息系统概念 |
| 1.2 地理信息系统的发展现状 |
| 1.3 地理信息系统的应用 |
| 2 流行病学 GIS |
| 2.1 研究现状 |
| 2.2 GIS 在流行病学研究中的应用 |
| 3 结语 |
| 实验一 山东省家禽肿瘤性疾病血清学检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 疑似肿瘤病例病理学观察及抗原定位 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验三 PCR 检测禽肿瘤性疾病 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 实验四 与禽肿瘤性疾病相关的饲养环境因素的调查 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论与小结 |
| 实验五 GIS 预警系统模型的初步建立 |
| 1 系统的总体结构设计 |
| 2 系统数据库的构建 |
| 2.1 系统数据库的设计 |
| 2.2 系统数据结构 |
| 3 系统的功能设计 |
| 4 系统界面的设计 |
| 5 系统的实现方法 |
| 6 系统运行结果 |
| 6.1 疫情数据录入及更新修改 |
| 6.2 疫情数据信息查询与统计 |
| 6.3 疫情实时发布和监控 |
| 7 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（4）鸡传染性法氏囊病病毒感染与血管内凝血的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 传染性法氏囊病病毒对鸡的致病作用 |
| 1.1.1 传染性法氏囊病 |
| 1.1.2 传染性法氏囊病病毒特性 |
| 1.1.3 传染性法氏囊病的潜伏期和临床症状 |
| 1.1.4 发病机理 |
| 1.1.5 病理变化及病毒分离 |
| 1.1.6 传染性法氏囊病的预防和治疗 |
| 1.2 凝血机理与弥散性血管内凝血 |
| 1.2.1 动物血液凝固机理研究概述 |
| 1.2.2 弥散性血管内凝血的发病机制研究概述 |
| 1.2.3 感染性弥散性血管内凝血的发病机制 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验病毒株 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 药品及试剂 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.1.6 主要测定试剂盒 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒的培育 |
| 2.2.2 试验动物分组及处理 |
| 2.2.3 发病标准判断 |
| 2.2.4 血液样本的采集和制备 |
| 2.2.5 血凝测定方法 |
| 2.2.6 血凝状态检测试验 |
| 2.2.7 血液指标测定项目 |
| 2.2.8 组织学病理观察 |
| 2.2.9 统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸡胚稳定性试验 |
| 3.2 鸡传染性法氏囊病病例模型的建立 |
| 3.2.1 发病率与死亡率 |
| 3.2.2 临床症状 |
| 3.2.3 剖检变化 |
| 3.2.4 组织学变化 |
| 3.2.5 死亡鸡器官出血阳性率 |
| 3.3 血凝状态试验结果 |
| 3.4 血液指标项目测定结果 |
| 3.4.1 血浆凝血酶原时间 |
| 3.4.2 血浆活化部分凝血活酶时间 |
| 3.4.3 血浆凝血酶时间 |
| 3.4.4 抗凝血酶Ⅲ活性 |
| 3.4.5 抗凝血酶Ⅲ含量 |
| 3.4.6 D-二聚体含量 |
| 3.4.7 纤维蛋白原含量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 传染性法氏囊病模型的复制 |
| 4.1.1 临床症状 |
| 4.1.2 病理变化 |
| 4.1.3 死亡率 |
| 4.2 血凝状态试验 |
| 4.3 血液指标测定 |
| 4.3.1 凝血酶原时间 |
| 4.3.2 活化部分凝血活酶时间 |
| 4.3.3 凝血酶时间 |
| 4.3.4 抗凝血酶 |
| 4.3.5 D-二聚体 |
| 4.3.6 纤维蛋白原 |
| 4.4 传染性法氏囊病与DIC的发生 |
| 4.4.1 DIC发病机制 |
| 4.5 传染性法氏囊病的治疗 |
| 4.6 本试验存在的问题与有待进一步研究的问题 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附图A |
| 附图B |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）H7亚型禽流感病毒HA、HA1基因重组杆状病毒表达及其抗原性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 H7亚型禽流感的流行病学进展 |
| 1.1.1 易感动物 |
| 1.1.2 H7亚型禽流感的流行情况 |
| 1.1.3 H7亚型禽流感病毒直接感染人 |
| 1.2 禽流感病毒的生物学 |
| 1.2.1 禽流感的病原学 |
| 1.2.2 禽流感病毒基因结构及其功能 |
| 1.2.3 禽流感病毒的致病力 |
| 1.2.4 禽流感病毒的流行病学 |
| 1.3 禽流感病毒与人类禽流感 |
| 1.3.1 禽流感病毒跨种属感染流行概况 |
| 1.3.2 禽流感病毒与人流感的关系 |
| 1.4 血凝素(HEMAGGLUTININ,HA)与禽流感病毒致病性的关系 |
| 1.4.1 HA基因和立体三维结构 |
| 1.4.2 HA与病毒感染的相关性 |
| 1.4.3 HA氨基酸残基与病毒毒力的相关性 |
| 1.5 本试验研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌种与细胞 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 工具酶 |
| 2.1.4 分子生物学试剂 |
| 2.1.5 生化试剂 |
| 2.1.6 抗体、血清和主要耗材 |
| 2.1.7 参考毒株 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 HA、HA1基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.2 HA、HA1重组杆状病毒表达载体的构建 |
| 2.2.3 H1-H15亚型AIV HA1、HA2氨基酸序列比较 |
| 3 结果 |
| 3.1 H7-HA基因的重组杆状病毒表达的结果 |
| 3.1.1 H7-HA基因克隆载体的构建 |
| 3.1.2 H7-HA基因表达载体的构建 |
| 3.1.3 昆虫细胞的转染及重组病毒的蚀斑鉴定 |
| 3.1.4 重组病毒筛选的PCR鉴定 |
| 3.1.5 重组病毒HA表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 3.1.6 重组病毒HA表达产物的生物学活性鉴定 |
| 3.2 H7-HA1基因的重组杆状病毒表达的结果 |
| 3.2.1 H7-HA1基因克隆载体的构建 |
| 3.2.2 H7-HA1基因表达载体的构建 |
| 3.2.3 重组病毒筛选的PCR鉴定 |
| 3.2.4 重组病毒HA1表达产物的SDS-PAGE检测 |
| 3.2.5 重组病毒HA1表达产物的生物学活性鉴定 |
| 3.3 HA-HA1的结果 |
| 3.3.1 重组病毒HA-HA1的SDS-PAGE结果 |
| 3.3.2 重组病毒HA-HA1的WESTERNBLOTTING分析 |
| 3.3.3 重组病毒HA-HA1的DOT-ELISA分析 |
| 3.4 H1-H15亚型AIV HA1、HA2氨基酸序列比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达H7亚型HA基因的依据 |
| 4.2 表达H7亚型HA1基因的依据 |
| 4.3 关于HA、HA1蛋白糖基化的分析 |
| 4.4 关于去除编码血凝素信号肽的核苷酸部分 |
| 4.5 重组杆状病毒表达HA、HA1蛋白的要点 |
| 4.6 昆虫杆状病毒表达系统中重组蛋白质的降解 |
| 4.7 重组杆状病毒表达HA、HA1蛋白的应用前景 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（6）畜禽传染病发生的新特点与流行病学防制（论文提纲范文）
| 目前传染病防治出现的新问题 |
| 一传染病的发生往往是多因素 |
| 1 1890年Robert Koch假说 |
| 二病毒的变异出现许多新特点 |
| 1很多病毒侵害宿主的免疫系统 |
| 2 抗体依赖的病毒感染增强作用ADE |
| 3动物病原体呈现加速变异的趋势, 畜禽间及向人类传播的风险也越来越大 |
| 4 很多病原发生抗原漂移、抗原变异。 |
| 5动物带毒;持续性感染, 隐性感染。混合感染, 继发感染, 不仅造成诊断困难, 同样可造成机体对多种致病因子易感性增强及疫苗免疫失败。 |
| 6 环境在疫病的流行中占有重要地位 |
| 7 有些疾病带有地区性 |
| 8全球气候变暖扩大了传染病的分布范围 |
| 9动物特别是野鸟在疫病的流行中占有重要地位 |
| 1 0 抗生素的危害性已成为世界关注的问题 |
| 三建议采取的防制措施 |
| 四流行病学综合防治的策略 |
| 五社会因素对传染病的影响 |
（7）人类禽流感病毒感染特点与防治对策（论文提纲范文）
| 1 禽流感的病原学 |
| 2 禽流感病毒的致病力 |
| 3 禽流感病毒的流行病学 |
| 3.1 传染源 |
| 3.2 传播途径 |
| 3.3 易感人群 |
| 4 禽流感的诊断 |
| 4.1 临床表现 |
| 4.2 实验室检查 |
| 4.2.1 家禽患禽流感诊断 |
| 4.2.2 人患禽流感的诊断 |
| 5 禽流感的防治 |
| 5.1 预防 |
| 5.2 治疗 |
（8）外源性核酸影响感染法氏囊病毒雏鸡免疫功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1. 核酸营养学研究进展 |
| 2. 传染性法氏囊病研究进展 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 结果 |
| 1. 20日龄鸡IBDV 抗体测定 |
| 2. 核酸对T 淋巴细胞转化功能的影响 |
| 3. 核酸对血液生化的影响 |
| 4. 核酸对免疫器官重的影响 |
| 5. 各组鸡发病和死亡情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（9）基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒检测技术研究进展 |
| 1.1 新城疫概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状 |
| 1.1.4 病理变化 |
| 1.1.5 诊断 |
| 1.2 新城疫病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 NDV的基因组结构 |
| 1.2.2 NDV的蛋白结构与功能 |
| 1.2.3 NDV的致病性及其分子基础 |
| 1.3 新城疫病毒的检测技术 |
| 1.3.1 病毒分离与鉴定 |
| 1.3.2 电镜技术 |
| 1.3.3 抗原及抗体检查 |
| 1.3.4 分子生物学诊断技术 |
| 1.4 NDV的防制 |
| 1.4.1 建立有效的管理和生物安全体系 |
| 1.4.2 免疫接种 |
| 第二章 基因芯片技术研究进展 |
| 2.1 基因芯片技术的原理 |
| 2.1.1 高通量、多参数同步分析 |
| 2.1.2 快速全自动分析 |
| 2.1.3 高精确度分析 |
| 2.1.4 高精密度分析 |
| 2.1.5 高灵敏度分析 |
| 2.2 基因芯片的主要类型 |
| 2.2.1 原位光刻合成 |
| 2.2.2 原位喷印合成芯片 |
| 2.2.3 点样法 |
| 2.2.4 电子芯片 |
| 2.2.5 三维芯片 |
| 2.2.6 流过式芯片(flow-thruchip) |
| 2.3 样品制备、杂交和检测 |
| 2.4 基因芯片技术的主要应用 |
| 2.4.1 基因表达检测 |
| 2.4.2 寻找新基因 |
| 2.4.3 DNA测序 |
| 2.4.4 突变体和多态性的检测 |
| 2.4.5 其它特殊设计的基因芯片 |
| 2.5 基因芯片技术的研究方向及当前面临的困难 |
| 试验研究 |
| 第三章 基因芯片检测新城疫病毒的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 毒株 |
| 3.1.1.2 工具酶和试剂 |
| 3.1.1.3 溶液配制 |
| 3.1.1.4 试剂盒 |
| 3.1.1.5 主要仪器 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 样品提取 |
| 3.1.2.2 荧光标记 |
| 3.1.2.3 芯片设计 |
| 3.1.2.4 探针纯化 |
| 3.1.2.5 芯片制备 |
| 3.1.2.6 芯片质量来检测 |
| 3.1.2.7 杂交 |
| 3.1.2.8 芯片结果测定及分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 芯片质量检测结果 |
| 3.2.2 芯片检测准确性的检验 |
| 3.2.3 芯片特异性的证明 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RT-PCR结合限制性内切酶分析法区分NDV强弱毒株的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 NDV毒株 |
| 4.1.1.2 工具酶和试剂 |
| 4.1.1.3 试剂盒 |
| 4.1.1.4 缓冲液系统 |
| 4.1.1.5 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 病毒毒力的测定 |
| 4.1.2.2 鸡胚平均致死时间(MDT) |
| 4.1.2.3 血凝试验(HA) |
| 4.1.2.4 血凝抑制试验(HI) |
| 4.1.2.5 RT-PCR扩增及检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 病毒毒力测定结果 |
| 4.2.2 RT-PCR反应条件优化 |
| 4.2.3 分离株RT-PCR扩增产物的确证 |
| 4.2.4 引物特异性的证明 |
| 4.2.5 强弱毒株的酶切鉴定 |
| 4.2.6 疫苗株RT-PCR扩增产物酶切鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结 论 |
| 致 谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文部分 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 猪伪狂犬病在国内外发生和流行状况 |
| 1.1 猪伪狂犬病的认识历程 |
| 1.2 伪狂犬病的世界性分布 |
| 1.3 我国猪伪狂犬病的现状 |
| 2 伪狂犬病的主要流行病学特征 |
| 2.1 分离的毒株毒力有差异 |
| 2.2 强毒株的出现 |
| 2.3 传播的途径 |
| 3 伪狂犬病病毒的分子生物学 |
| 3.1 伪狂犬病病毒基因组的结构和功能 |
| 3.2 伪狂犬病病毒的分子致病机理 |
| 3.3 主要疫苗株的遗传背景 |
| 3.4 疫苗的安全性和效力标准 |
| 3.5 伪狂犬病的免疫机制 |
| 3.6 疫苗性能的比较 |
| 3.7 影响疫苗效果的因素 |
| 3.8 免疫失败以及免疫逃避 |
| 4 伪狂犬病病毒gE基因的结构与功 |
| 4.1 gE基因的结构 |
| 4.2 gE基因的变异现象 |
| 4.3 gE糖蛋白的功能 |
| 5 伪狂犬病的根除计划 |
| 5.1 根除计划的技术支撑 |
| 5.2 鉴别诊断方法 |
| 5.3 一些国家的根除计划及其进展 |
| 6 伪狂犬病研究的其它前沿问题 |
| 6.1 重组多价疫苗 |
| 6.2 RR突变株 |
| 6.3 基因免疫 |
| 6.4 流行病学研究方法的应用 |
| 第2章 伪狂犬病病毒TK/gG~-基因缺失疫苗的研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 病毒与细胞 |
| 2.2 引物 |
| 2.3 试验动物 |
| 2.4 主要设备、溶液和试剂 |
| 2.5 BHK-21、PK-5、IBRS-2细胞的培养 |
| 2.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.7 病毒组织培养半数感染量(TCID_(50))的测定 |
| 2.8 空斑形成单位(Plaque Forming Unit,PFU)测定 |
| 2.9 中和抗体的测定 |
| 2.10 鄂A株、TK~-/gG~-/LacZ~+等基因缺失株、Bartha株在BHK-21细胞上的增殖滴度的比较 |
| 2.11 鄂AK野毒株、TK／gG~-／LacZ~+等基因缺失株、Bartha株对Balb／c小白LD~5的测定 |
| 2.12 鄂A株、TK~-／gG~-／LacZ~+突变株及Bartha株对成年家兔LD~(50)测定 |
| 2.13 不同剂量TK~-／gG~-／LacZ~+突变株对猪的安全性测定 |
| 2.14 基因缺失突变株遗传特征稳定性的测定 |
| 2.15 最小免疫剂量的筛选 |
| 2.16 弱毒疫苗生产工艺研究 |
| 2.17 疫苗的安全性测定 |
| 2.18 疫苗的免疫效力试验 |
| 2.19 疫苗的免疫期测定 |
| 2.20 仔猪母源抗体的测定 |
| 2.21 母源抗体对疫苗的影响测定 |
| 2.22 疫苗的保存期测定 |
| 2.23 几种供试疫苗的免疫性能比较 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 伪狂犬病鄂A株及其基因突变株、Bartha株在BHK-21细胞上的增殖滴度 |
| 3.2 鄂A株野毒株、TK~-、TK~-／gG~-／LacZ~+及Bartha株对小白鼠LD_(50)的测定 |
| 3.3 鄂A株、TK~-／gG~-株和Bartha株对成年家兔毒力测定 |
| 3.4 不同剂量突变株对猪的安全性测定结果 |
| 3.5 伪狂犬病病毒TK~-／gG~-／LacZ~+突变株的遗传标志稳定性 |
| 3.6 最小免疫剂量的测定结果 |
| 3.7 TK~-／gG~-／LacZ~+突变株在鸡胚纤维细胞中的生长滴度 |
| 3.8 基因缺失弱毒疫苗的安全性 |
| 3.9 疫苗的效力试验 |
| 3.10 疫苗的免疫持续期 |
| 3.11 疫苗免疫后母源抗体持续期 |
| 3.12 野毒株与基因缺失免疫原性的比较 |
| 3.13 疫苗不同保存条件下毒价的测定 |
| 3.14 不同疫苗的效力和免疫原性比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 伪狂犬病研究的热点 |
| 4.2 疫苗研究的重要性和紧迫性 |
| 4.3 不同毒株增殖滴度的比较 |
| 4.4 基因工程缺失疫苗安全性应考虑的问题 |
| 4.5 疫苗株毒株稳定性的意义 |
| 4.6 关于疫苗最小免疫剂量的确定 |
| 4.7 关于疫苗生产工艺 |
| 4.8 关于疫苗的免疫效力 |
| 4.9 关于疫苗的水平传播 |
| 4.10 该疫苗的抗体产生规律 |
| 4.11 不同遗传背景疫苗之间的比较 |
| 5 小结 |
| 第3章 检测伪狂犬病血清抗体乳胶凝集试验的建立和应用 |
| 1 研究目的 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料及溶液的配制 |
| 2.2 伪狂犬病病毒鄂A株标准血清制备 |
| 2.3 伪狂犬病病毒的增殖、沉淀和浓缩、含量的测定 |
| 2.4 乳胶的预处理 |
| 2.5 乳胶凝集抗原的制备 |
| 2.6 乳胶凝集试验的操作过程 |
| 2.7 乳胶凝集抗原质量的鉴定 |
| 2.8 待检血清处理方法对凝集试验效果的影响 |
| 2.9 乳胶凝集试验与中和试验的比较 |
| 2.10 乳胶凝集抗原有效期的测定 |
| 2.11 部分田间试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗原制备时最佳浓度的选择结果 |
| 3.2 抗原制备时最适蛋白浓度的确定 |
| 3.3 抗原特异性的测定 |
| 3.4 血清处理与否对结果的影响 |
| 3.5 全血中伪狂犬病抗体的定性检测 |
| 3.6 乳胶凝集试验与中和试验的比较结果 |
| 3.7 抗原保存期的测定 |
| 3.8 部分田间试验的结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本研究的现实意义 |
| 4.2 各种条件的选择 |
| 4.3 本法的主要特点 |
| 4.4 与中和试验的比较 |
| 4.5 田间试验的评价 |
| 5 小结 |
| 第4章 伪狂犬病病毒鄂A株gE基因转移载体构建 |
| 1 研究目的 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 限制性内切酶及工具酶 |
| 2.3 引物与BamHI接头 |
| 2.4 DNA快速纯化回收试剂盒 |
| 2.5 主要试剂 |
| 2.6 溶液(试剂)的配制 |
| 2.7 感受态细胞的制备 |
| 2.8 质粒DNA的转化 |
| 2.9 质粒DNA小量提取 |
| 2.10 目的DNA的酶切、回收 |
| 2.11 载体DNA的处理 |
| 2.12 连接 |
| 2.13 含PrV gE基因片段的获得 |
| 2.14 重组质粒SKFB的获得 |
| 2.15 BamHI接头的加入 |
| 2.16 插入LacZ表达盒的重组质粒的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PUC6.6的获得及酶切鉴定 |
| 3.2 含目的基因SK4.1重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.3 SK4.1中LacZ表达盒的插入及其鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录(已发表的文章) |
四、可能导致美国爆发超强毒新城疫的危险因素（论文参考文献）
- [1]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [2]非主要组织相容性复合体宿主遗传变异对马立克氏病疫苗效力的影响[D]. 常爽. 吉林大学, 2010(08)
- [3]山东省家禽肿瘤性疾病流行病学调查及GIS预警系统的建立[D]. 张洪海. 山东农业大学, 2009(03)
- [4]鸡传染性法氏囊病病毒感染与血管内凝血的研究[D]. 王韫. 河北农业大学, 2008(08)
- [5]H7亚型禽流感病毒HA、HA1基因重组杆状病毒表达及其抗原性检测[D]. 贾珊珊. 东北农业大学, 2007(02)
- [6]畜禽传染病发生的新特点与流行病学防制[J]. 陈溥言. 中国禽业导刊, 2006(23)
- [7]人类禽流感病毒感染特点与防治对策[J]. 钱皎,王睿. 国外医学.呼吸系统分册, 2005(01)
- [8]外源性核酸影响感染法氏囊病毒雏鸡免疫功能的研究[D]. 高海. 山西农业大学, 2004(06)
- [9]基因芯片检测新城疫病毒和PCR结合内切酶分析鉴别新城疫强弱毒株的研究[D]. 耿捷. 西北农林科技大学, 2004(04)
- [10]猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究[D]. 何启盖. 华中农业大学, 2000(03)