一、用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造（论文文献综述）
侯星[1]（2019）在《一株产α-半乳糖苷酶的成团泛菌的筛选及酶学性质的研究》文中研究指明α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase）是一种通过分解糖分子中非还原性末端的α-1,6-半乳糖苷键从而消除豆类中的抗营养因子,提高营养素利用率的酶,它可以直接水解蜜二糖因此又叫蜜二糖酶。本论文从不同的样品中筛选分离可产α-半乳糖苷酶的微生物,以寻找更多具有不同酶学性质的的α-半乳糖苷酶。从腐乳中分离得到一株可产α-半乳糖苷酶的细菌菌株,并对所得菌株的产酶条件和酶学性质进行研究,主要实验内容及实验结果如下:（1）根据X-α-Gal可在α-半乳糖苷酶的催化下产生蓝色物质的特性,用它做指示剂从豆腐乳中筛选出一株产α-半乳糖苷酶能力较高的菌株,命名为GK。对菌株GK进行16S rDNA、生理生化实验等一系列的鉴定,最终确定其为一株成团泛菌（Pantoea agglomerans）。（2）对菌株GK的生长条件和产酶条件进行研究,发现菌株GK的最适生长pH为6.5、最适生长温度为25℃,而最佳产酶条件为培养基初始pH7.0、装液量250mL/500mL、培养温度20℃、培养时间15h,此时的酶活为14.07U/mL。根据各单因素的实验结果又对温度、pH、装液量做了正交实验来分析各因素之间的交互影响,以期寻找该菌的最佳培养条件及最佳产酶条件。实验结果表明:菌株GK生长因素的影响顺序为温度>pH>装液量;菌株GK产酶因素的影响顺序为温度>装液量>pH。（3）对菌株GK所产的α-半乳糖苷酶的酶学性质进行研究发现:该酶的最适反应pH为7.0,最佳反应温度为43℃,在45℃以下和pH5.08.0的酸碱度条件下酶活都很稳定,5h内基本不变。Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ag+对该酶的抑制作用明显,基本完全抑制了酶的活力;K+和Na+对α-半乳糖苷酶的酶活性无明显影响;而EDTA则可明显促进酶活,作用24h后,酶活达到对照酶活的350%。
邱聪花[2]（2018）在《特殊环境微生物半乳糖苷酶基因的克隆、表达与性质研究》文中研究说明半乳糖苷酶是降解蜜二糖、乳糖和棉籽糖等含有半乳糖苷键的糖苷水解酶,该酶在食品、医疗和饲料等行业具有重要的应用。特殊环境来源的微生物有环境适应性,其产生的半乳糖苷酶具有潜在的特殊性质。本课题从盐碱湖、红树林和火焰山分离菌中克隆得到4个半乳糖苷酶基因,其中3个半乳糖苷酶基因在大肠杆菌或酵母中得到异源表达,同时对表达的重组半乳糖苷酶进行纯化和酶学性质研究。主要内容如下:1、以豆粕或乳糖为唯一碳源的筛选培养基,从盐碱湖、红树林和火焰山分离菌筛选到7株产半乳糖苷酶微生物。利用简并引物从3株产酶微生物克隆到4个半乳糖苷酶基因片段,这些片段的氨基酸序列与已知半乳糖苷酶的最高一致性在74%～100%。2、采用TAIL-PCR或同源克隆的方法获得4个半乳糖苷酶基因的全长,设计特异性引物,PCR扩增4个半乳糖苷酶基因,并进行生物信息学分析:半乳糖苷酶基因agalSL3-GH27、bgalSL3-GH42、agalMF5-GH27和bgalFM3-GH2的长度分别为1167、2058、1311和3045 bp,分别编码388、685、436和1014个氨基酸酸,与已知半乳糖苷酶蛋白最高一致性分别为99%、97%、99%和71%。3、纯化的重组仅-半乳糖苷酶rAgalSL3-GH27主要酶学性质:最适反应pH是5.5,在pH 5.0～10.0有很好的稳定性;最适反应温度55。℃C,在55℃以下保持好的热稳定性;在低于1.5 mol·L-1的NaCl溶液中,重组酶基本不受影响;在3 mol·L-1的NaCl和KCl溶液中有很好的稳定性;水解PNPG的比活、Km、Vmax和Kcat分别为379.78 ±5.80 U·mg-1、2.61±0.02 μmol·mL-1、452.30±0.57μmol·（mg·min）-1和345.53 ±1.27 s-1;该酶可水解蜜二糖和棉籽糖,不能水解ONPG和瓜尔豆胶4、纯化的重组β-半乳糖苷酶rBgalSL3-GH42主要酶学性质:最适反应pH为6.5,在pH 6.0～9.0保持好的稳定性;最适反应温度40℃,在40℃以下保持稳定;NaCl对重组酶的影响较小,在1.5 mol·L-1的NaCl溶液中有较好的稳定性;重组酶水解ONPG的比活、Km、Vmax和Kcat 分别为354.48 ±7.68 U·mg-1、10.76±0.38μmoL·mL-1、833.33±1.21 μmol·（mg·min）-1和1110.42±1.36 s-1;重组酶水解乳糖,不能水解PNPG。5、纯化的重组α-半乳糖苷酶rAgalMF5-GH27主要酶学性质:最适反应pH是4.5,在pH 4.0～8.0有较好的稳定性;最适反应温度为50℃C,在50℃以下保持较好的稳定性;水解PNPG的比活、Km、Vmx脉和Kcat分别为87.45±0.10 U·mg-1、0.15±0.01μmol·mL-1、80.13±0.02 μmol-（mg-min）-1和80.51±0.05 s-1;重组酶水解棉籽糖、蜜二糖及瓜尔豆胶的相对酶活力分别为1.04%、3.75%及2.31%。
石征宇[3]（2018）在《Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及酶学性质的研究》文中进行了进一步梳理α-半乳糖苷酶（α-GalActosidase）又称蜜二糖酶,在自然界中存在范围较广,属于外切糖苷酶类,能够专一催化糖链末端含α-1.6半乳糖苷键的多糖、糖蛋白、糖脂等物质,即能催化毛蕊花糖、棉籽糖、水苏糖和蜜二糖等底聚糖,还能催化一些含α-半乳糖苷键的杂多糖。目前,分离得到的α-半乳糖苷酶多为常温酶,这也极大的限制了该酶在高温行业中的使用,如饲料工业。嗜热α-半乳糖苷酶来源有限,主要分离于天然嗜热菌菌株体内,但分离过程繁琐,产量极低,不能满足于生产应用。因此,本研究利用分子生物学、微生物学和生物信息学技术,合成嗜热菌Geobacillus thermodenitrificansα-半乳糖苷酶的编码基因,利用原核表达系统来构建α-半乳糖苷酶工程菌,并研究其酶学性质和活性位点,为后续该酶的分子改造提供理论依据。本研究的主要实验内容及实验结果如下:1.本实验跟据Gen Bank数据库所提供的嗜热菌Geobacillus thermodenitrificansα-半乳糖苷酶氨基酸序列（登录号:WP＿011887668）,经人工设计Eco R I和Bam H I酶切位点,交于公司合成该编码基因。将该目的基因重组到融合表达载体p GEX-4T-3,把重组好的质粒p GEX-4T-GalA导入感受态细胞E.coil BL21（DE3）中,经验证、测序成功后获得重组工程菌E.coil BL21-p GEX-4T-GalA。2.使用生物信息学方法,发现该酶属于糖苷水解酶第36家族,理化性质结果表明,分子式为C3767H5757N1041O1083S22,理论p I值为6.29该酶分子量大小为83.66KDa。在进行跨膜预测时并未发现该酶有形成跨膜区域,说明该蛋白并非是膜蛋白。在利用网络服务器PSIPRED预测蛋白二级结构时,发现该蛋白由大量的β-Sheel和α-Helix组成,并在三维结构预测中的到验证,且在三维结构中发现一个疑似活性位点的区域。3.使用IPTG对重组工程菌E.coil BL21-p GEX-4T-GalA进行了重组蛋白的诱导表达及纯化。优化结果表明28℃、0.08mmo L/L IPTG、诱导5h为最佳诱导条件,并且此时目的蛋白以可溶性形式存在,使用亲和层析方法对粗酶进行纯化,而后对纯化出来的蛋白进行浓度测定,其结果为14.443μg/m L,比酶活82.385U/mg。4以pNPG为底物,对该酶的酶学性质进行了研究,结果显示该酶最适温度为70℃、最适p H6.0、并具有良好的热稳定性和p H稳定性,Fe3+、Ca2+、Mn2+、Zn2+对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用,其中以Zn2+对α-半乳糖苷酶的激活效果最好,Cu2+、Ag+和Hg+能够完全抑制酶活。对该酶的动力学常数进行测定,其结果Km为10.04mmo L/L,Vmax为18.25μmo L/min。5通过使用Auto Dock进行分子对接,选取最佳的分子构象用于分子动力学模拟,用MM-PBSA方法计算了小分子棉籽糖和α-半乳糖苷酶之间的结合能,计算结果显示范德华相互作用、静电相互作用和非极性溶剂化自由能是形成复合物的主要驱动力,通过对各个氨基酸残基的贡献研究发现,ASN-334、TRP-336、GLU-337、TYR-340、ASP-367、TRP-411、ASP-548、SER-576、ALA-577、PRO-579和ASP-606是对小分子棉籽糖与α-半乳糖苷酶的结合起关键作用的氨基酸残基。
张继文[4]（2017）在《基因剂量及内质网分泌相关蛋白对α-半乳糖苷酶表达的影响》文中研究表明α-半乳糖苷酶是一种能够催化水解各类以α键结合的非还原性末端α-半乳糖苷化合物的外切糖苷水解酶。本研究的主要目的是利用分子生物学技术和手段,构建并表达热稳定性好,酶活高的α-半乳糖苷酶重组基因酵母工程菌。本研究将Neosartorya fischeri P1α-半乳糖苷酶Gal A基因序列进行全基因人工合成,并连接到酵母表达载体pAO815上,构建了α-半乳糖苷酶重组表达质粒pAO-Gal A,随后成功将重组表达载体电转入毕赤酵母中进行表达。表达的α-半乳糖苷酶Gal A的最适pH为4.5,最适温度为50℃;单拷贝的α-半乳糖苷酶Gal A平均酶活达到55.74U/mL。终浓度20 mmol/mL的Fe Cl2可以大幅提高α-半乳糖苷酶的酶活。之后又成功构建了α-半乳糖苷酶两拷贝和三拷贝重组表达质粒,并转入酵母中进行了表达。两拷贝的α-半乳糖苷酶重组表达菌株的α-半乳糖苷酶酶活达到95.22 U/mL,比单拷贝菌株酶活提高70.83%;而三拷贝重组表达菌株发酵液平均酶活为35.93 U/mL,比单拷贝菌株酶活降低35.54%。本研究还构建了4种与内质网分泌蛋白相关基因与α-半乳糖苷酶基因共表达的重组表达菌株,结果显示HAC1-Gal A共表达重组菌株的平均酶活为64.24 U/mL,PDI-Gal A共表达重组菌株平均酶活68.7 U/mL,Ero1-Gal A共表达重组菌株平均酶活70.71 U/mL,分别比α-半乳糖苷酶单拷贝重组表达菌株酶活提高15.25%、23.25%和26.86%。Hsp40-Gal A共表达重组菌株平均酶活30.67 U/mL,比α-半乳糖苷酶单拷贝重组表达菌株酶活降低了44.99%;将两拷贝重组表达菌株小摇瓶发酵酶活最高的菌株进行14 L水平的发酵罐高密度发酵,发酵120 h的上清液稀释40倍后,α-半乳糖苷酶酶活达到791.23 U/mL。加入终浓度20 mmol/mL的FeCl2到反应体系中时,酶活达到1400U/mL。本研究的意义:通过利用分子生物学技术和手段构建并表达热稳定性好,酶活高的α-半乳糖苷酶重组基因酵母工程菌,提高α-半乳糖苷酶的表达量,降低生产成本,为α-半乳糖苷酶的工业应用提供优良的候选酶。
张丽丽[5]（2015）在《短双歧杆菌α-半乳糖苷酶：分子改造、转糖基性质及结晶研究》文中提出糖苷酶能以糖基供体和糖基受体一步合成糖苷产物,反应途径简单,底物价格便宜,广泛应用于酶促糖苷化反应,但糖苷酶催化的反应中,部分反应产物可以作为酶底物被重新水解,导致产物产量不高。近年来糖苷酶的分子改造研究大幅提高了糖苷酶的转苷效率,使得糖苷酶真正成为糖苷合成的有力工具。α-半乳糖苷酶是一类重要的糖苷酶,催化α-半乳糖苷键发生水解,某些种类的α-半乳糖苷酶在水解α-半乳糖苷键的同时,还具有转半乳糖基活性,可用于合成α-低聚半乳糖和α-半乳糖苷化合物,应用于食品保健及医药业等。该类酶转糖基合成的键型以Galα1-3和Galα1-6键型为主,仅有本课题组报道的短双歧杆菌（Bifidobacterium breve） 203和一种植物来源的α-半乳糖苷酶能够催化合成Galα1-4键型。Galα1-4存在于重要的细胞表面糖链如志贺毒素受体Gb3糖链（globotriose,Galα1-4Galβ1-4Glc）及肿瘤细胞表面抗原Globo-H中,体外获得该类糖链有利于研发抗菌药物及肿瘤疫苗,因而具有Galα1-4区域选择性的α-半乳糖苷酶在合成寡糖药物方面具有重要的应用价值。α-半乳糖苷酶催化的糖苷合成反应遵循糖苷酶的一般作用机制,产物产量不高。目前国际上分子改造α-半乳糖苷酶提高转苷活性的研究已经开展,但仅有4例在分析酶蛋白结构的基础上进行定点突变获得了高效转糖基酶的报道,通过随机突变提高α-半乳糖苷酶转糖基活性的研究未见报道。虽然已发现了两种α-半乳糖苷酶能合成Galα1-4键,但尚未应用于合成Galα1-4寡糖药物如globotriose或其衍生物。另一方面,某些糖苷酶在催化转糖基活性时,其区域选择性会因受体结构的改变而发生变化,本论文研究发现了 B. breve 203 α-半乳糖苷酶对不同糖基受体的区域选择性存在差异,但目前尚无文献报道解释糖苷酶转糖基区域选择性的分子机理,已有的α-半乳糖苷酶的晶体结构研究主要集中在水解性质的研究。基于此,本论文首次通过随机突变的方式对B. breve 203 α-半乳糖苷酶进行分子改造,获得了高效转苷酶,并应用该酶合成了 globotriose衍生物,填补了国际上糖苷酶法合成globotriose衍生物的空白,同时研究了该酶以多种受体分子进行转糖基的区域选择性,探索了该酶的结晶条件,为进一步获得高质量单晶用于解释高效突变酶转苷效率提高的结构因素以及酶转糖基区域选择性的分子机理奠定了基础。前期工作中,从B.breve 203中纯化出α-半乳糖苷酶Aga2,其N-端氨基酸序列为A-I-M-D-F-H-G,该酶具有转糖基活性。通过分析不同菌株α-半乳糖苷酶基因的同源性,扩增B.breve 203 α-半乳糖苷酶基因保守区,将其制成探针进行Southern杂交,首次获得B.breve 203 α-半乳糖苷酶基因aga2,基因大小为2226 bp,编码741个氨基酸,理论分子量约为81.5 kDa。该基因的GenBank登录号为DQ267828。用pET-22b将aga2基因在大肠杆菌中进行了异源表达,重组酶Aga2性质与纯化酶Aga2基本一致。单亚基分子量约为80.5 kDa,与由核苷酸序列推测的蛋白理论分子量基本一致,活性状态分子量约为152 kDa,是一个双亚基蛋白。除水解活性外,该酶以蜜二糖（Galα1-6Glc）为底物时能够催化转糖基反应合成新型寡糖Galα1-4Galα1-6Glc。本论文首先对B.breve 203 α-半乳糖苷酶Aga2进行了随机突变的分子改造。采用易错PCR对基因aga2进行随机突变,通过X-α-Gal平板蓝白斑初筛水解活性和TLC复筛转糖基活性,从约4000个重组子中筛选获得了两个转糖基活性高于原始重组酶Aga2的突变酶RM70和RM103,以蜜二糖为底物的转糖基效率分别为45% （RM103）和47% （RM70）,均比原始重组Aga2 （26%）高出了约20个百分点。突变酶RM70和RM103均能高效表达为可溶性蛋白,存在的突变位点未影响蛋白质的正确折叠。基因测序显示RM70中存在3个突变位点G218S,D457A和H729R,RM103中存在2个突变位点V564E和H573L。通过定点突变构建了上述5个突变位点的单位点突变酶,分析这5种突变酶以蜜二糖为底物的转糖基效率,发现氨基酸V564、H573和H729在提高Aga2转糖基活性中发挥着正向作用。通过定点突变将氨基酸V564、H573和H729分别突变为不同类型的氨基酸（I/V、S、M、N、D、R/K、Y、W和H）,并分析相应突变酶以蜜二糖为受体的转糖基效率,发现氨基酸V564对Aga2转糖基活性的提高发挥着至关重要的作用,将其从缬氨酸突变为天冬酰胺后（V564N）,转糖基效率大大提高,由原始重组Aga2的26%提高至58%。原始酶Aga2和突变酶V564N、H573N以及H729S的三维模拟结构显示,突变酶V564N的催化腔洞相比原始酶变得更浅更宽,可能使底物或转糖基产物更容易进入反应洞穴或更容易与酶脱离进而提高转糖基活性;氨基酸位点573的氨基酸由原始酶的组氨酸突变为天冬酰胺后,更容易与水分子形成H-键,可能通过在催化腔洞外捕获水分子而降低催化中心水活度,进而提高转糖基活性;氨基酸位点729位于远离催化结构域的C端结构域上,其提高转糖基活性的原因尚不清楚。研究了上述高效转糖基突变酶以对硝基苯半乳糖苷为糖基供体、乳糖或乳糖衍生物为糖基受体合成globotriose或其衍生物的转糖基反应。在以乳糖为受体的转糖基反应中催化合成 Ga l α1-3Galβ1-4Glc、Galβ1-4（Galα1-6）Glcα 和Galα1-6Galβ1-4Glc三种寡糖,未检测到目标产物globotriose,但产生了另一种重要的药用寡糖α-Gal抗原寡糖。重点对以甲基乳糖为受体的转糖基反应进行了研究,此反应中通过一步反应同时合成了 α-Gal抗原和globotriose衍生物两类重要药用寡糖。原始重组酶Aga2和突变酶RM70、RM103、V564N、H573N和H729S以甲基乳糖为受体催化的转糖基反应产生相同的产物,均出现两个转糖基产物。突变酶RM70催化转糖基产物的总产率（28%）与原始酶（28%）相同,突变酶RM103、H573N和H729S提高的幅度较小,仅提高了 3%-5%,突变酶V564N提高的幅度最大,比原始酶高出10%。因此选用突变酶V564N用于后续的扩大反应,研究了反应条件对转糖基产物产率的影响,在反应温度25℃-40℃以及pH 6.5-8.5范围内,转糖基产物产量变化不大,反应10分钟转糖基产物产率即能达到最大值,随后产率保持不变,稳定在最高值。与原始重组酶Aga2相比,突变酶V564N表现出不水解转糖基产物的性质。将转糖基产物通过HPLC法进行分离纯化,通过质谱和NMR （1H、13C、COSY、HMBC和HSQC）鉴定转糖基产物结构为 Galα1-3Galβ1-4GlcβOMe 和 Galα1-4Galβ1-4GlcβOMe。该研究首次通过酶法反应一步获得两种重要的Galα1-3和Galα1-4键型寡糖,并且α-半乳糖苷酶合成globotriose衍生的能力为国际上首次发现。进一步研究表明,B. breve 203 α-半乳糖苷酶具有广泛的糖基受体选择性,由于突变酶V564N具有更高的转苷效率,并且突变酶V564N与原始酶转糖基区域选择性一致,因而选择突变酶V564N研究了酶对各种不同糖基受体的区域选择性。以对硝基苯半乳糖苷为糖基供体,以葡二糖如海藻糖（Galα1-1Glcα）、曲二糖（Galα1-2Glc）、黑曲霉糖（Galα1-3Glc）、麦芽糖（Galα1-4Glc）、异麦芽糖（Galα1-6Glc）、槐糖（Galβ1-2Glc）、昆布二糖（Galβ1-3Glc）、纤维二糖（Galβ1-4Glc）和龙胆二糖（Galβ1-6Glc）为糖基受体建立转糖基反应,结果发现所有反应均有新的转糖基产物生成。突变酶V564N在以空间位阻较大的分子为受体时,如α-构型连接的葡二糖（海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖）和龙胆二糖,转糖基区域选择性专一,只催化单一产物的产生;在以空间位阻较小的分子为受体时,如β-构型连接的葡二糖（槐糖、昆布二糖、纤维二糖）,转糖基区域选择性多样,催化多种同分异构体的合成,以槐糖为受体时,有一个主产物和两个同分异构体副产物;以纤维二糖为受体,有两个含量相当的主产物和一个副产物。对以葡二糖海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、纤维二糖和龙胆二糖为受体的转糖基主要产物通过质谱和NMR（1H、13C、COSY、HMBC和HSQC）进行结构鉴定,产物结构分别为Galα 1 -6Glcα 1-1 Glcα 、 Glcα1 -2（Galα1 -6）Glcβ 、 Galα1 -6Glcα1 -3Glc 、Galα1 -6Glcα1 -4Glc 、 Galα 1 -6Glcα1 -6Glcβ、 Galα1-6Glcβ1-2Glcα 、Gala1-6Glcβ1-3Glcα、Galα1-6Glcβ1-4Glcβ和 Galα1-6Glcβ1-6Glc。其中,以海藻糖、黑曲霉糖、麦芽糖、异麦芽糖、槐糖、昆布二糖、纤维二糖和龙胆二糖为受体时合成直链型Galα1-6键型寡糖为单一产物或主要产物,而以曲二糖为受体的转糖基反应只合成支链型的Galα1-6键产物。这与该酶以蜜二糖或甲基乳糖为受体转糖基的区域选择性完全不同,酶对不同受体表现区域选择性的分子机理尚不清楚。对B.breve 203 α-半乳糖苷酶Aga2的蛋白质晶体生长进行了探索,期望获得高质量单晶,用于结构解析,阐释高效突变酶转苷效率提高以及该酶转糖基区域选择性的分子机理。通过镍亲和层析、Source 15Q阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析纯化获得了纯度和均一性满足蛋白质结晶的要求的Aga2蛋白质。利用 Crystal screen、Crystal screen Ⅰ、Index 1-96、Natrix、SaltRx、PEGRx-1、PEGRx-2、PEG ion-1、PEG ion-2、Wizard Ⅰ、WizardⅡ、WizardⅢ共 14 个试剂盒对Aga2蛋白质的晶体生长条件进行普筛,获得一个用于蛋白质晶体生长的条件 PEGRx-2 33 （4% 2-propanol、0.1 M Bis-Tris pH 9.0、20% PEG monomethyl ethero 5000）,在此基础上通过矩阵法、改变晶体生长温度、种晶以及添加additive和detergent等手段对Aga2蛋白质晶体生长条件进行优化,最终在结晶条件为4%v/v 2-propanol、0.1 M Bis-Tris propane pH 8.95、21% PEG 5000、添加 detergent试剂ANAPOE（?）-X-114、蛋白质浓度为9 mg、4℃生长时获得可用于X-ray衍射的蛋白质晶体。该蛋白质晶体的分辨率为3.2 A,空间群为P212121,但由于晶体分辨率低和已知数据库中蛋白质的同源性低,未能解析出Aga2蛋白质的相角问题。进一步通过硒代培养基将Aga2中的甲硫氨酸替换为硒代甲硫氨酸,希望通过多波长反常散射法解决蛋白质的相角问题,硒代Aga2经纯化后按Aga2蛋白质晶体生长条件PEGRx-2 33进行生长,经过矩阵法优化晶体生长条件后获得分辨率为2.8 A的蛋白质晶体,但硒代后的蛋白质晶格排列不正确,无法对蛋白质结构进行解析。目前正在进一步对硒代Aga2蛋白质晶体生长条件进行优化,同时尝试对蛋白质自身进行修饰（如截短蛋白）,期望最终获得高质量蛋白质晶体用于结构解析。
李素波,贠志敏,高红伟,张雪,檀英霞,张士坤,季守平,宫锋[6]（2015）在《制备脆弱拟杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶单抗用于检测通用型红细胞中的微量残留酶》文中认为目的建立一种检测微量脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）来源的α-半乳糖苷酶的方法用于测定酶解转变的通用型红细胞上的残留酶。方法用脆弱拟杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90%）免疫BALB/c小鼠,制备单抗;用稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株制备腹水单抗,再经HiT rap rP rotein A柱纯化获得高纯度的抗体;间接ELISA法测定单抗效价,Western印迹法评价单抗特异性。联合纯化后的单抗和兔多抗采用间接ELISA法检测酶解法制备的通用型红细胞和洗涤液中的残留酶量。结果获得了高效价高纯度的单抗,Western印迹实验显示该抗体可特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合;间接ELISA法检测微量α-半乳糖苷酶的下限为1 ng/ml,红细胞按1∶4的体积比经4次洗涤后,其残留酶量<10 ng/ml。结论所建立的在血型转变过程中检测微量残留α-半乳糖苷酶的方法,可用于酶解法制备的通用型红细胞的安全性评价。
田庆[7]（2014）在《外切糖苷酶清除人体器官血型抗原的实验研究》文中认为目的：实验研究外切糖苷酶清除人的红细胞及肝脏血型抗原,探讨人体器官血型转换的可行性；方法：一、绿色咖啡豆来源α-半乳糖苷酶清除人的细胞表面的B型抗原；由于α-半乳糖苷酶的最适反应温度是25℃,最适宜的ph为6.5,反应的最佳溶液为磷酸钾盐缓冲液。实验不同稀释度的α-半乳糖苷酶清除红细胞表面的血型抗原,筛选对酶清除血型抗原的最适反应酶浓度,10倍稀释的α-半乳糖苷酶处理磷酸钾盐溶液稀释的悬浮红细胞60min,流式细胞仪分析α-半乳糖苷酶对红细胞B抗原清除效果；在不同温度条件下（4℃、25℃）,对比观察酶的活性变化；采用肝移植手术中病肝为实验对象,建立肝脏的灌注模型。用UW液+/-α-半乳糖苷酶灌注离体肝脏标本,灌注液保存4h,免疫荧光技术分析肝组织血型抗原的变化,从器官水平探讨α-半乳糖苷酶体对肝脏B血型抗原的清除效果.实验组和对照组,组内不同时间段的血型抗原的水平进行单因素方差分析,对比组内血型抗原水平差异是否有统计学意义；组间相同时间段血型抗原水平进行独立样本资料的t检验,对比组间同一时间点血型抗原水平差异是否有统计学意义。二、基因重组的α-N-乙酰半乳糖苷酶清除人的红细胞表面的A型抗原；制备5%的A型红细胞悬液,经不同稀释度的α-N-乙酰半乳糖胺酶处理60min,流式细胞仪分析,绘制不同稀释度的酶对血型抗原清除率的曲线,筛选对酶清除血型抗原的最适反应酶浓度；在不同温度条件下（4℃、37℃）,对比观察酶的活性变化；采用肝移植手术中病肝为实验对象,用UW液+/-α-N-乙酰半乳糖苷酶灌注离体A型肝脏标本,灌注液保存4h,免疫荧光技术分析肝组织血型抗原的变化,从器官水平探讨α-N-乙酰半乳糖苷酶对肝脏A血型抗原的清除效果。实验组和对照组,组内不同时间段的血型抗原的水平进行单因素的方法分析,对比组内血型抗原水平差异是否有统计学意义；组间相同段血型抗原水平进行独立样本资料的t检验,对比组间同一时间点血型抗原水平差异是否有统计学意义。结果：（1）不同稀释度的α-半乳糖苷酶对红细胞表面B抗原的清除效率不同,10倍稀释度的α-半乳糖苷酶清除B抗原效率最高；低温降低了α-半乳糖苷酶清除血型抗原的效率。用UW液+α-Gal灌注离体的B血型肝脏标本,低温保存4h,肝脏B抗原的含量明显减少。实验组内不同时间血型抗原水平经过ANOVA分析,P值<0.01,差异有统计学意义。实验组肝组织B抗原平均水平1h减少至58%,2h为10%,4h为4%,而对照组血型抗原水平未见明显的变化；（2）不同稀释度的α-NAGA对红细胞A型抗原的清除效率不同,100倍稀释的α-NAGA可以较好的清除红细胞的A抗原；对比4℃与37℃条件下,酶对血型抗原的清除效果,低温可降低酶活性,在4℃条件下,α-NAGA仍具有清除红细胞表面29%血型抗原能力；用UW液+α-NAGA灌注离体的A血型肝脏标本,灌注结束低温保存4h,与灌注前相比,灌注后的肝脏A血型抗原的含量明显降低。实验组内不同时间血型抗原水平经过ANOVA分析,P值<0.01,差异有统计学意义。实验组肝组织A抗原平均水平,1h减少为46%、2h为15%、4h为3%；结论：（1）α-半乳糖苷酶可有效清除红细胞表面B血型抗原,实现B→0的血型转换；用UW液+α-半乳糖苷酶体外灌注离体B型肝脏标本,肝组织内血型抗原的含量明显降低,肝组织血型抗原清除后,但并未达到不可检测的水平；（2）α-N-7,酰半乳糖苷酶可有效清除红细胞表面A血型抗原,实现A→0的血型转换；用UW液+α-N-乙酰半乳糖苷酶灌注离体A型肝脏标本,器官在4℃保存4小时,肝组织A抗原的含量明显降低。
高红伟,李素波,艾雪,李妙,王颖丽,让文亮,季守平,宫锋[8]（2011）在《新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究》文中指出观察脆弱类杆菌来源的新型重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株的遗传稳定性。在有选择压力（Kan+）条件下,将重组α-半乳糖苷酶工程菌菌株在LB固体培养基上采用划线法连续传60代,每隔20代取样保存菌种,最后同时进行菌体形态、生长速度和抗生素抗性、平板传代及诱导过程中的质粒稳定性、限制酶切图谱、测序、表达量和酶活力检测。结果表明细菌形态、生长速度和抗生素抗性等与原始种子库无明显差异;LB固体培养基上传60代后质粒稳定性接近100%,但诱导过程中质粒易丢失。第20、40和60代提取质粒进行酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见α-半乳糖苷酶基因变异。原代菌株及第20、40和60代菌株经诱导培养,其α-半乳糖苷酶表达水平、酶活力及菌体蛋白的SDS-PAGE图谱均无明显差异。说明α-半乳糖苷酶工程菌株在平板传代中具有良好的遗传稳定性
高红伟,李素波,鲍国强,檀英霞,王玲燕,金泗虎,王颖丽,季守平,宫锋[9]（2011）在《原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究》文中进行了进一步梳理本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件（6.8）下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。
孙家志,龙建英,徐传妍[10]（2011）在《疾病所致ABO血型变异及改造研究进展》文中指出ABH血型抗原是在红细胞、内皮细胞、上皮细胞表面的糖蛋白或糖脂类蛋白上发现的碳水化合物结构。血型物质的前体H受糖基转移酶的修饰和
二、用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造（论文提纲范文）
（1）一株产α-半乳糖苷酶的成团泛菌的筛选及酶学性质的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 α-D-半乳糖苷酶 |
| 1.1.1 α-半乳糖苷酶来源及国内外研究现状 |
| 1.1.2 α-半乳糖苷酶性质 |
| 1.1.3 α-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.1.3.1 α-半乳糖苷酶在饲料中的应用 |
| 1.1.3.2 α-半乳糖苷酶在食品领域上的应用 |
| 1.1.3.3 α-半乳糖苷酶在医学方面的应用 |
| 1.1.3.4 α-半乳糖苷酶在其他行业的应用 |
| 1.2 成团泛菌 |
| 1.2.1 成团泛菌的由来 |
| 1.2.2 成团泛菌的作用 |
| 1.3 本实验的主要内容、目的及创新性 |
| 1.3.1 本实验的主要内容 |
| 1.3.2 本试验的目的 |
| 1.3.3 本研究的创新点 |
| 第二章 产α-半乳糖苷酶的成团泛菌的筛选和鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 主要实验药品 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 培养基与溶液的配制 |
| 2.1.4.1 培养基的配制 |
| 2.1.4.2 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产α-半乳糖苷酶菌种的分离和纯化 |
| 2.2.2 菌株的鉴定 |
| 2.2.2.1 菌株16S rDNA鉴定 |
| 2.2.2.2 菌株形态学和生理生化特征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株16S rDNA鉴定 |
| 2.3.2 菌株形态学和生理生化特征 |
| 2.4 结论和讨论 |
| 第三章 菌株生长及产酶条件的优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 主要实验药品 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.1.4 培养基及试剂配方 |
| 3.2 α-半乳糖苷酶活测定方法 |
| 3.2.1 粗酶液的制备 |
| 3.2.2 酶活的测定 |
| 3.2.3 标准曲线的绘制 |
| 3.2.4 胞内酶和胞外酶的判断 |
| 3.3 菌株GK的生长和产酶条件优化 |
| 3.3.1 温度对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.3.2 培养基初始pH对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.3.3 菌株生长及产酶随时间的变化 |
| 3.3.4 碳源对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.3.5 氮源对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.3.6 不同金属离子及螯合剂对菌株生长的影响 |
| 3.3.7 不同接种量对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.3.8 摇瓶装液量对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.3.9正交实验 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 温度对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.4.2 初始pH对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.4.3 菌株生长及产酶随时间的变化 |
| 3.4.4 碳源对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.4.5 氮源对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.4.6 不同金属离子及螯合剂对菌株生长的影响 |
| 3.4.7 不同接种量对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.4.8 不同摇瓶装液量对菌株生长及产酶的影响 |
| 3.4.9 正交优化实验 |
| 3.5 结论与讨论 |
| 第四章 成团泛菌α-半乳糖苷酶酶学性质研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 主要实验药品 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.1.4 溶液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 粗酶液的制备 |
| 4.2.2 硫酸铵分级沉淀 |
| 4.2.3 透析 |
| 4.3 α-半乳糖苷酶酶学性质研究 |
| 4.3.1 最适温度及温度稳定性 |
| 4.3.2 最适pH及pH稳定性 |
| 4.3.3 不同金属离子对酶活性的影响 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 硫酸铵分级沉淀 |
| 4.4.2 透析 |
| 4.4.3 温度对酶活的影响 |
| 4.4.4 温度稳定性 |
| 4.4.5 最适pH |
| 4.4.6 pH稳定性 |
| 4.4.7 金属离子及络合物对α-半乳糖苷酶的影响 |
| 4.5 结论与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（2）特殊环境微生物半乳糖苷酶基因的克隆、表达与性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 半乳糖苷酶简介 |
| 1.1.1 半乳糖苷酶的来源 |
| 1.1.2 半乳糖苷酶的分类 |
| 1.1.2.1 α-半乳糖苷酶 |
| 1.1.2.2 β-半乳糖苷酶 |
| 1.1.3 半乳糖苷酶的酶学性质 |
| 1.1.4 半乳糖苷酶的催化机制 |
| 1.2 半乳糖苷酶的酶活测定 |
| 1.3 半乳糖苷酶基因的克隆与表达 |
| 1.3.1 半乳糖苷酶基因的克隆 |
| 1.3.2 半乳糖苷酶基因的表达 |
| 1.4 半乳糖苷酶的应用 |
| 1.4.1 β-半乳糖苷酶在医疗领域的应用 |
| 1.4.1.1 酶疗法治疗安德森法布里疾病 |
| 1.4.1.2 人B→O血型改造 |
| 1.4.2 半乳糖苷酶在工业的应用 |
| 1.4.2.1 半乳糖苷酶作用于纸浆漂白 |
| 1.4.2.2 α-半乳糖苷酶用于牲畜日粮的生产 |
| 1.4.2.3 α-半乳糖苷酶用于蔗糖工业的生产 |
| 1.4.3 β-半乳糖苷酶在食品工业的应用 |
| 1.4.4 β-半乳糖苷酶在环保方面的应用 |
| 1.5 课题选题依据及研究内容 |
| 1.5.1 课题选题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 产半乳糖苷酶微生物的筛选、鉴定及半乳糖苷酶保守区基因的克隆 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 引物合成及DNA测序 |
| 2.1.5 常用缓冲溶液和储备液 |
| 2.1.6 培养基 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产半乳糖苷酶微生物的筛选 |
| 2.2.1.1 产半乳糖苷酶微生物的初筛 |
| 2.2.1.2 产半乳糖苷酶微生物的复筛 |
| 2.2.2 产半乳糖苷酶菌株的鉴定 |
| 2.2.2.1 形态学观察 |
| 2.2.2.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.2.3 真菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.2.4 真菌ITS的PCR扩增 |
| 2.2.2.5 扩增产物回收与纯化 |
| 2.2.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.2.2.7 目的条带的连接和转化 |
| 2.2.2.8 挑选阳性克隆子及DNA测序 |
| 2.2.3 半乳糖苷酶保守区基因克隆 |
| 2.2.3.1 简并引物设计 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 产半乳糖苷酶微生物的筛选 |
| 2.3.2 产半乳糖苷酶微生物的鉴定 |
| 2.3.2.1 菌株形态观察 |
| 2.3.2.2 真菌ITS序列分析 |
| 2.3.3 半乳糖苷酶保守区基因的克隆及分析 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 半乳糖苷酶基因全长的克隆及分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物合成及DNA测序 |
| 3.1.4 常用缓冲液和储液 |
| 3.1.5 培养基 |
| 3.1.6 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 bgalFM3-GH2半乳糖苷酶基因全长获得 |
| 3.2.1.1 特异性引物(SP)的设计 |
| 3.2.1.2 TAIL-PCR反应体系及程序 |
| 3.2.1.3 目标产物的回收、连接、转化和测序 |
| 3.2.1.4 bgalFM3-GH2基因全长序列的拼接 |
| 3.2.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 3.2.3 真菌总RNA提取及cDNA的合成 |
| 3.2.3.1 真菌总RNA提取 |
| 3.2.3.2 cDNA第一链的合成 |
| 3.2.4 半乳糖苷酶基因全长克隆及分析 |
| 3.2.4.1 半乳糖苷酶基因特异性引物设计 |
| 3.2.4.2 半乳糖苷酶基因PCR扩增 |
| 3.2.4.3 半乳糖苷酶基因连接、转化和测序 |
| 3.2.4.4 半乳糖苷酶基因序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 半乳糖苷酶基因的获得 |
| 3.3.1.1 bgalFM3-GH2半乳糖苷酶基因全长序列的获得 |
| 3.3.1.2 半乳糖苷酶基因克隆 |
| 3.3.2 半乳糖苷酶基因全长序列的分析 |
| 3.3.3 半乳糖苷酶氨基酸序列的相关分析 |
| 3.3.3.1 氨基酸序列比对分析 |
| 3.3.3.2 蛋白质糖基化位点预测 |
| 3.3.3.3 蛋白质结构预测 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 细菌来源半乳糖苷酶基因的表达、纯化与性质研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物合成及DNA测序 |
| 4.1.4 常用缓冲液和储液 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌重组表达质粒的构建 |
| 4.2.1.1 半乳糖苷酶基因的克隆、酶切与连接 |
| 4.2.1.2 重组质粒转化大肠杆菌与验证 |
| 4.2.2 重组大肠杆菌的构建 |
| 4.2.2.1 大肠杆菌BL21感受态制备 |
| 4.2.2.2 重组质粒pET-22b-Z转化 |
| 4.2.3 半乳糖苷酶基因的异源表达 |
| 4.2.4 重组半乳糖苷酶的收集和纯化 |
| 4.2.4.1 重组半乳糖苷酶诱导和收集 |
| 4.2.4.2 重组半乳糖苷酶的纯化 |
| 4.2.5 半乳糖苷酶SDS-PAGE分析 |
| 4.2.6 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.2.7 重组酶的酶活测定 |
| 4.2.7.1 α-半乳糖苷酶rAgalSL3-GH27酶活的测定 |
| 4.2.7.2 β-半乳糖苷酶rBgalSL3-GH42酶活的测定 |
| 4.2.8 重组酶性质的测定 |
| 4.2.8.1 重组酶的最适反应pH及pH稳定性 |
| 4.2.8.2 重组酶的最适反应温度及热稳定性 |
| 4.2.8.3 金属离子及化学试剂对重组酶的影响 |
| 4.2.8.4 NaCl对重组酶活性及稳定性的影响 |
| 4.2.8.5 KCl对重组酶活性及稳定性的影响 |
| 4.2.8.6 重组酶比活的测定 |
| 4.2.8.7 重组酶K_m、V_(max)和k_(cat)的测定 |
| 4.2.8.8 重组酶的底物特异性 |
| 4.2.8.9 TLC分析重组酶的底物特异性 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组酶的分离和纯化 |
| 4.3.2 重组酶rAgalSL3-GH27的酶学性质分析 |
| 4.3.2.1 重组酶rAgalSL3-GH27的基本酶学性质 |
| 4.3.2.2 金属离子及化学试剂对重组酶rAgalSL3-GH27活性的影响 |
| 4.3.2.3 NaCl对重组酶rAgalSL3-GH27活性及稳定性的影响 |
| 4.3.2.4 KCl对重组酶rAgalSL3-GH27活性及稳定性的影响 |
| 4.3.2.5 重组酶rAgalSL3-GH27 K_m、V_(max)和k_(cat)的测定 |
| 4.3.2.6 重组酶rAgalSL3-GH27底物特异性分析 |
| 4.3.3 重组酶rBgalSL3-GH42酶学性质分析 |
| 4.3.3.1 重组酶rBgalSL3-GH42的基本酶学性质 |
| 4.3.3.2 金属离子及化学试剂对重组酶rBgalSL3-GH42活性的影响 |
| 4.3.3.3 NaCl对重组酶rBgalSL3-GH42活性及稳定性的影响 |
| 4.3.3.4 KCl对重组酶rBgalSL3-GH42活性及稳定性的影响 |
| 4.3.3.5 重组酶rBgalSL3-GH42 K_m、V_(max)和k_(cat)的测定 |
| 4.3.3.6 重组酶rBgalSL3-GH42的底物特异性 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 真菌来源半乳糖苷酶基因的表达、纯化及性质研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 引物合成及DNA测序 |
| 5.1.4 常用缓冲液和储备液 |
| 5.1.5 培养基 |
| 5.1.6 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 毕赤酵母表达重组质粒的构建 |
| 5.2.1.1 半乳糖苷酶基因的克隆、酶切与连接 |
| 5.2.1.2 半乳糖苷酶基因的酶切与连接 |
| 5.2.1.3 重组质粒转化及验证 |
| 5.2.2 重组毕赤酵母菌株的构建 |
| 5.2.2.1 重组质粒的线性化 |
| 5.2.2.2 毕赤酵母X33感受态细胞的制备 |
| 5.2.2.3 电转化X33 |
| 5.2.3 重组毕赤酵母菌株的筛选 |
| 5.2.4 重组酶半乳糖苷酶rAgalMF5-GH27酶活的测定 |
| 5.2.5 重组酶的大量诱导和分离纯化 |
| 5.2.5.1 重组酶的大批量诱导 |
| 5.2.5.2 中空纤维浓缩和硫酸铵沉淀 |
| 5.2.5.3 镍柱亲和层析纯化重组蛋白 |
| 5.2.5.4 SDS-PAGE分析及重组酶rAgalMF5-GH27的去糖基化处理 |
| 5.2.6 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.2.7 重组酶半乳糖苷酶rAgalMF5-GH27性质的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组酶在毕赤酵母的表达和纯化 |
| 5.3.2 重组酶rAgalMF5-GH27的酶学性质分析 |
| 5.3.2.1 重组酶rAgalMF5-GH27的基本酶学性质 |
| 5.3.2.2 金属离子及化学试剂对重组酶rAgalMF5-GH27活性的影响 |
| 5.3.2.3 NaCl对重组酶rAgalMF5-GH27活性及稳定性的影响 |
| 5.3.2.4 KCl对重组酶rAgalMF5-GH27活性及稳定性的影响 |
| 5.3.2.5 重组酶rAgalMF5-GH27 K_m、V_(max)和k_(cat)的测定 |
| 5.3.2.6 重组酶rAgalMF5-GH27的底物特异性 |
| 5.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及酶学性质的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 α-半乳糖苷酶的概述 |
| 1.1.1 α-半乳糖苷酶的来源 |
| 1.1.2 α-半乳糖苷酶的生化性质 |
| 1.1.3 α-半乳糖苷酶的分类 |
| 1.2 α-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.2.1 α-半乳糖苷酶在饲料工业中的应用 |
| 1.2.2 α-半乳糖苷酶食品工业中的应用 |
| 1.2.3 α-半乳糖苷酶在造纸工业中的应用 |
| 1.2.4 α-半乳糖苷酶在化学工业上的应用 |
| 1.2.5 α-半乳糖苷酶在医疗领域的应用 |
| 1.3 本研究的主要研究内容、目的和创新点 |
| 1.3.1 本研究的主要内容及目的 |
| 1.3.2 创新点 |
| 第二章 Geobacillus thermodenitrificansα-半乳糖苷酶基因合成与工程菌构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种及质粒 |
| 2.1.2 主要实验药品 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 培养基及试剂配方 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 目的基因的获取 |
| 2.2.2 合成基因的验证 |
| 2.2.3 重组表达载体构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 目的基因的获取 |
| 2.3.2 PCR扩增验证 |
| 2.3.3 合成菌与E.coil p GEX-4T-3 质粒双酶切 |
| 2.3.4 重组工程菌验证及测序 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Geobacillus thermodenitrificans Gal A基因生物信息学分析 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 氨基酸序列分析 |
| 3.1.2 理化性质分析 |
| 3.1.3 二级结构预测 |
| 3.1.4 三级结构预测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 理化性质分析 |
| 3.2.3 α-半乳糖苷酶亲疏水性分析 |
| 3.2.4 α-半乳糖苷酶跨膜区分析 |
| 3.2.5 α-半乳糖苷酶二级结构预测 |
| 3.2.6 α-半乳糖苷酶三维结构预测分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 第四章 重组α-半乳糖苷酶的表达及纯化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌种 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要实验药品 |
| 4.1.4 主要试剂配置及培养基配方 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 |
| 4.2.2 重组α-半乳糖苷酶诱导表达及分子量确定 |
| 4.2.3 重组α-半乳糖苷酶诱导表达条件优化 |
| 4.2.4 重组α-半乳糖苷酶可溶性验证 |
| 4.2.5 重组α-半乳糖苷酶的纯化 |
| 4.2.6 蛋白浓度测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组α-半乳糖苷酶诱导表达及分子量确定 |
| 4.3.2 诱导条件优化 |
| 4.3.3 重组α-半乳糖苷酶可溶性验证 |
| 4.3.4 重组蛋白的分离纯化 |
| 4.3.5 蛋白浓度的测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 第五章 重组蛋白酶学性质的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验主要仪器 |
| 5.1.2 实验主要药品及试剂配置方法 |
| 5.1.3 菌种 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 纯酶制备 |
| 5.2.2 α-半乳糖苷酶酶活测定 |
| 5.2.3 α-半乳糖苷酶酶学性质研究 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 标准曲线绘制 |
| 5.3.2 最适反应温度 |
| 5.3.3 温度稳定性 |
| 5.3.4 最适pH |
| 5.3.5 pH稳定性 |
| 5.3.6 金属离子及化合物对α-半乳糖苷酶的影响 |
| 5.3.7 α-半乳糖苷酶动力学常数测定 |
| 5.4 结论与讨论 |
| 第六章 基于分子模拟技术来研究源于Geobacillusthermodenitrificansα-半乳糖苷酶的活性位点 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 葡聚糖酶结构的制备 |
| 6.1.2 配体分子的制备 |
| 6.1.3 分子对接 |
| 6.1.4 分子动力学模拟 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 分子对接 |
| 6.2.2 均方根偏差分析 |
| 6.2.3 棉籽糖和α-半乳糖苷酶之间的接触数和分子间的距离 |
| 6.2.4 复合物结合自由能 |
| 6.2.5 活性位点氨基酸残基的贡献 |
| 6.2.6 氢键分析 |
| 6.3 结论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）基因剂量及内质网分泌相关蛋白对α-半乳糖苷酶表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 α-半乳糖苷酶简介 |
| 1.1.1 α-半乳糖苷酶的来源 |
| 1.1.2 α-半乳糖苷酶的分类 |
| 1.1.3 α-半乳糖苷酶的结构与功能 |
| 1.1.4 α-半乳糖苷酶的应用 |
| 1.2 酵母表达系统的研究进展 |
| 1.3 基因剂量对毕赤酵母表达系统的影响 |
| 1.3.1 多拷贝方法的分类 |
| 1.3.2 多拷贝表达载体的构建方法 |
| 1.4 内质网分泌相关蛋白对酵母表达系统的影响 |
| 1.4.1 分子伴侣 |
| 1.4.2 非折叠蛋白响应 |
| 1.5 研究意义与目的 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 酶及生化试剂 |
| 2.1.3 主要培养基及溶液 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 α-半乳糖苷酶重组表达质粒的构建 |
| 2.2.2 α-半乳糖苷酶重组表达菌株的构建和表达 |
| 2.2.3 α-半乳糖苷酶酶学性质的研究 |
| 2.2.4 α-半乳糖苷酶多拷贝重组表达菌株的构建和表达 |
| 2.2.5 内质网分泌蛋白相关基因与 α-半乳糖苷酶基因共表达重组质粒及菌株的构建 |
| 2.2.6 α-半乳糖苷酶多拷贝重组酵母菌株Gal A基因拷贝数的检测 |
| 2.2.7 α-半乳糖苷酶重组表达酵母 14 L水平的高密度发酵 |
| 3 实验结果和讨论 |
| 3.1 实验结果 |
| 3.1.1 α-半乳糖苷酶重组表达质粒的构建 |
| 3.1.2 α-半乳糖苷酶的酶学性质 |
| 3.1.3 α-半乳糖苷酶多拷贝重组表达质粒的构建 |
| 3.1.4 荧光定量PCR检测多拷贝重组表达菌株Gal A基因插入拷贝数 |
| 3.1.5 基因剂量对 α-半乳糖苷酶表达的影响 |
| 3.1.6 内质网分泌蛋白相关基因与 α-半乳糖苷酶基因共表达重组质粒及菌株的构建 |
| 3.1.7 共表达与内质网分泌相关蛋白对 α-半乳糖苷酶表达量的影响 |
| 3.1.8 α-半乳糖苷酶 14L水平的高密度发酵 |
| 3.2 讨论 |
| 3.2.1 基因剂量对 α-半乳糖苷酶表达的影响 |
| 3.2.2 内质网分泌蛋白相关基因对 α-半乳糖苷酶表达的影响 |
| 3.2.3 α-半乳糖苷的研究现状 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）短双歧杆菌α-半乳糖苷酶：分子改造、转糖基性质及结晶研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 糖生物学概述 |
| 1.1.1 糖生物学 |
| 1.1.2 糖链的结构解析和糖链合成 |
| 1.2 糖苷酶及其在糖类合成中的应用 |
| 1.2.1 糖苷酶的作用机制 |
| 1.2.2 糖苷酶在糖类合成中的应用 |
| 1.2.3 糖苷酶的分子改造 |
| 1.3 α-半乳糖苷酶的研究进展 |
| 1.3.1 α-半乳糖苷酶的分类 |
| 1.3.2 α-半乳糖苷酶应用 |
| 1.3.3 α-半乳糖苷酶分子改造研究进展 |
| 1.3.4 α-半乳糖苷酶晶体结构研究进展 |
| 1.4 蛋白质晶体学 |
| 1.4.1 蛋白质晶体生长的原理 |
| 1.4.2 蛋白质晶体生长条件的方法 |
| 1.4.3 蛋白质晶体生长条件的筛选 |
| 1.4.4 提高蛋白质晶体质量的策略 |
| 1.5 本论文的工作基础、研究内容及意义 |
| 1.5.1 工作基础 |
| 1.5.2 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 转糖基α-半乳糖苷酶Aga2的分子改造 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 菌株和质粒 |
| 2.1.3 培养基和培养条件 |
| 2.1.4 DNA操作技术 |
| 2.1.5 重组蛋白的IPTG诱导表达 |
| 2.1.6 α-半乳糖苷酶水解活力测定 |
| 2.1.7 高效突变酶的筛选 |
| 2.1.8 TLC层析 |
| 2.1.9 HPLC层析 |
| 2.1.10 镍亲和层析分离提纯His-tag突变酶 |
| 2.1.11 蛋白质含量测定 |
| 2.1.12 蛋白质电泳技术 |
| 2.1.13 突变酶动力学参数测定 |
| 2.1.14 Aga2及其突变酶的同源模建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Aga2的随机突变及高效转苷酶的筛选 |
| 2.2.2 Aga2的定点突变及高效转苷酶的筛选 |
| 2.2.3 高效突变酶的大量表达和纯化 |
| 2.2.4 高效突变酶的动力学分析 |
| 2.2.5 高效突变酶的突变氨基酸位点分析 |
| 2.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 转糖基α-半乳糖苷酶Aga2突变酶合成药用寡糖globotriose衍生物的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要试剂和仪器 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 培养基和培养条件 |
| 3.1.4 蛋白质操作技术 |
| 3.1.5 重组原始酶Aga2和突变酶以乳糖和甲基乳糖为受体的转糖基反应 |
| 3.1.6 离子色谱(HPAEC)分析方法 |
| 3.1.7 突变酶V564N以甲基乳糖为受体的转糖基反应的条件优化 |
| 3.1.8 转糖基产物的分离纯化 |
| 3.1.9 转糖基产物的结构鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 原始重组酶Aga2和突变酶以乳糖为受体的转糖基反应 |
| 3.2.2 以乳糖为受体的转糖基产物的离子色谱(HPAEC)分析 |
| 3.2.3 以乳糖为受体的转糖基产物的纯化和结构鉴定 |
| 3.2.4 原始重组酶Aga2和突变酶以甲基乳糖为受体的转糖基反应 |
| 3.2.5 突变酶V564N以甲基乳糖为受体合成转糖基产物的条件优化 |
| 3.2.9 以甲基乳糖为受体的转糖基产物的纯化 |
| 3.2.10 以甲基乳糖为受体的转糖基产物的结构鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 转糖基α-半乳糖苷酶区域选择性的研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 突变酶V564N以葡二糖为受体的转糖基反应 |
| 4.1.3 转糖基产物的分离纯化 |
| 4.1.4 转糖基产物的结构鉴定 |
| 4.2 结果和讨论 |
| 4.2.1 突变酶V564N以葡二糖为受体的转糖基区域选择性研究 |
| 4.2.2 讨论 |
| 本章小结 |
| 第五章 转糖基α-半乳糖苷酶Aga2的蛋白质晶体生长研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试剂和仪器 |
| 5.1.2 菌株和质粒 |
| 5.1.3 培养基和培养条件 |
| 5.1.4 蛋白质操作技术 |
| 5.1.5 原始重组Aga2和硒代重组Aga2的纯化 |
| 5.1.6 硒代重组Aga2的硒代替换率计算 |
| 5.1.7 原始重组Aga2蛋白质结晶条件的普筛 |
| 5.1.8 原始重组Aga2结晶条件的优化 |
| 5.1.9 硒代重组Aga2的蛋白质结晶 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 原始重组Aga2的纯化 |
| 5.2.2 原始重组Aga2蛋白质晶体的生长及优化 |
| 5.2.3 硒代重组Aga2的纯化 |
| 5.2.4 硒代重组Aga2的硒代率 |
| 5.2.5 硒代重组Aga2蛋白质晶体的生长及优化 |
| 5.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 1 以乳糖和甲基乳糖为受体的转糖基产物的核磁共振图谱 |
| 2 以葡二糖为受体的转糖基产物的质谱和核磁共振图谱 |
| 参考文献 |
| 论文发表与专利申请 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）制备脆弱拟杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶单抗用于检测通用型红细胞中的微量残留酶（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1 实验动物与试剂 |
| 1. 2 动物免疫 |
| 1. 3 细胞融合及杂交瘤筛选 |
| 1. 4 杂交瘤核型分析及 IgG 亚类鉴定 |
| 1. 5 单抗腹水的制备与纯化 |
| 1. 6 抗体特异性鉴定 |
| 1. 7 通用型红细胞中残留酶的检测 |
| 2 结果 |
| 2. 1 血清效价的测定 |
| 2. 2 杂交瘤细胞系的建立及抗体类型鉴定 |
| 2. 3 腹水单抗的纯化及特异性鉴定 |
| 2. 4 残留酶检测 |
| 3 讨论 |
（7）外切糖苷酶清除人体器官血型抗原的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、α-半乳糖苷酶清除人体器官B抗原的实验研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 标本采集 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器及设备 |
| 1.1.5 α-半乳糖苷酶清除人体红细胞表面的B抗原 |
| 1.1.6 α-半乳糖苷酶清除人的肝脏组织的B抗原 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 不同稀释度α-半乳糖苷酶清除红细胞表面B型抗原 |
| 1.2.2 10倍稀释度α-Gal清除红细胞表面B Ag |
| 1.2.3 凝集实验 |
| 1.2.4 不同温度α-Gal酶解RBC的A型抗原比较 |
| 1.2.5 α-半乳糖苷酶对离体肝脏血型抗原的清除 |
| 1.2.6 肝脏灌注前后病理结构变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、α-N-乙酰半乳糖胺酶清除人体器官B抗原的实验研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 标本采集 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器及设备 |
| 2.1.5 α-NAGA清除人的红细胞表面的A抗原 |
| 2.1.6 α-NAGA清除人的肝脏组织的A抗原 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 不同稀释度α-NAGA清除红细胞表面B型抗原的规律 |
| 2.2.2 凝集实验 |
| 2.2.3 不同温度下α-NAGA清除红细胞的B抗原 |
| 2.2.4 α-NAGA对离体肝脏血型抗原的清除 |
| 2.2.5 肝脏灌注前后病理结构变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与仪器 |
| 1.1.2 菌株与培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌株传代方法及质粒稳定性鉴定 |
| 1.2.2 菌落形态和生长观察 |
| 1.2.3 质粒酶切鉴定 |
| 1.2.4 插入片段DNA序列测定 |
| 1.2.5 α-半乳糖苷酶在工程菌株中的表达 |
| 1.2.6 α-半乳糖苷酶的比活测定 |
| 1.2.7 红细胞酶解试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 菌落形态与生长 |
| 2.2 质粒稳定性检查 |
| 2.3 质粒酶切鉴定 |
| 2.4 α-半乳糖苷酶在工程菌株中的表达 |
| 2.5 重组α-半乳糖苷酶用于B→O血型改造 |
| 3 讨论 |
（9）原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究（论文提纲范文）
| 材料和方法 |
| 材料 |
| 重组α-半乳糖苷酶的诱导表达及诱导条件的优化 |
| α-半乳糖苷酶活性测定 |
| 蛋白浓度测定 |
| 发酵液预处理 |
| α-半乳糖苷酶的纯化 |
| 重组α-半乳糖苷酶应用于B→O血型改造 |
| 红细胞表面抗原的流式细胞术检测 |
| 结果 |
| 重组α-半乳糖苷酶工程菌表达条件的优化 |
| 基因重组α-半乳糖苷酶的纯化 |
| 重组α-半乳糖苷酶用于B→O血型改造 |
| 讨论 |
四、用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造（论文参考文献）
- [1]一株产α-半乳糖苷酶的成团泛菌的筛选及酶学性质的研究[D]. 侯星. 广西科技大学, 2019(09)
- [2]特殊环境微生物半乳糖苷酶基因的克隆、表达与性质研究[D]. 邱聪花. 福州大学, 2018(03)
- [3]Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及酶学性质的研究[D]. 石征宇. 广西科技大学, 2018(03)
- [4]基因剂量及内质网分泌相关蛋白对α-半乳糖苷酶表达的影响[D]. 张继文. 武汉轻工大学, 2017(06)
- [5]短双歧杆菌α-半乳糖苷酶：分子改造、转糖基性质及结晶研究[D]. 张丽丽. 山东大学, 2015(01)
- [6]制备脆弱拟杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶单抗用于检测通用型红细胞中的微量残留酶[J]. 李素波,贠志敏,高红伟,张雪,檀英霞,张士坤,季守平,宫锋. 军事医学, 2015(04)
- [7]外切糖苷酶清除人体器官血型抗原的实验研究[D]. 田庆. 天津医科大学, 2014(01)
- [8]新型基因重组α-半乳糖苷酶工程菌菌种稳定性研究[J]. 高红伟,李素波,艾雪,李妙,王颖丽,让文亮,季守平,宫锋. 生物技术通报, 2011(07)
- [9]原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究[J]. 高红伟,李素波,鲍国强,檀英霞,王玲燕,金泗虎,王颖丽,季守平,宫锋. 中国实验血液学杂志, 2011(02)
- [10]疾病所致ABO血型变异及改造研究进展[J]. 孙家志,龙建英,徐传妍. 中国实验诊断学, 2011(03)