糖尿病肾病患者血清层粘连蛋白和Ⅳ型胶原测定的意义

一、糖尿病肾病患者血清层粘连蛋白及Ⅳ型胶原测定的意义（论文文献综述）

魏亚静^[1]（2018）在《血透明质酸在CKD进展中的价值及相关性分析》文中研究表明目的:通过测定CKD和AKI患者血HA的水平,研究血HA是否可用于CKD与AKI的诊断及鉴别诊断。分析CKD患者血HA和Scr、BU N、血UA、eGFR间的相关性。方法:收集自2017年12月01日2018年01月31日期间于我院的CKD患者134例（男性73例,女性61例）、AKI患者18例（男性11例,女性7例）。CKD患者依据CKD-EPI eGFR计算公式将CKD分组,CKD12期29例,CKD3期28例,CKD4期26例,CKD5期51例。与此同时收集患者临床资料并测定Scr、BUN、血UA、Hb、ALB、Upro等。采用ELI SA法测定血HA。数据分析采用SPSS 21.0统计分析软件。结果:1.在CKD12期组、AKI组、CKD3期组、CKD4期组、CKD5期组间两两之间进行血HA浓度统计学分析时选用LSD检验,P值均小于0.01,差异具有统计学意义。2.在CKD中,血HA与其他指标进行相关分析,血HA与Scr、BUN、血UA均呈现正相关（r依次为0.476,0.455,0.263;P<0.01）;与eGFR呈负相关（r=-0.213,P<0.01）。3.在CKD中,血HA与血P呈正相关（r=0.214,P=0.008）,与Hb呈负相关（r=-0.362,P=0.000）。结论:1.血HA浓度可作为CKD的诊断及鉴别诊断工具。2.在CKD中,血HA浓度与Scr、BUN、血UA间呈现正相关性,与eGFR呈负相关性。其可作为反应肾功能水平的指标。3.在CKD中,血HA浓度与血P呈正相关,与Hb呈负相关。

冯如流^[2]（2016）在《降糖保肾Ⅱ号方干预Ⅲ-Ⅳ期糖尿病肾病患者尿液Fn和Col-Ⅳ改变的疗效评价》文中指出目的 观察降糖保肾Ⅱ号方治疗Ⅲ-Ⅳ期糖尿病肾病患者的临床疗效,通过分析尿FN及Col-Ⅳ水平与尿蛋白定量、肾功能和临床症状的相关关系探讨该标志蛋白在DN发生、发展中的可能机制,为中医药治疗糖尿病肾病的研究拓展一个新的领域,提供新思路。方法 将60例患者随机分为治疗组30例,对照组30例,两组均予糖尿病肾病基础治疗,治疗组加服降糖保肾Ⅱ号方。疗程为30天,治疗前后比较两组中医证候疗效及实验室检查结果,包括尿纤连蛋白（FN）、尿Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、24小时尿蛋白定量（24hPro）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平,评价临床疗效。结果 1.在改善临床总疗效方面,治疗组30例经治疗后显效13例,有效11例,无效6例,总有效率为80%；对照组30例经治疗后显效9例,有效11例,无效10例,总有效率为66.7%。组间临床疗效差异有统计学意义（P<0.05）,治疗组疗效明显优于对照组。2.对于24h尿蛋白定量及尿液中FN、Col-Ⅳ的治疗效果比较,对照组治疗前后尿FN、Col-Ⅳ水平差异无统计学意义（P>0.05）,但治疗前后24小时尿蛋白定量差异有统计学意义（P<0.05）,治疗组24小时尿蛋白定量及尿液中FNvCol-Ⅳ的改善明显优于对照组（P<0.05）。3.在改善肾功能方面,对照组对Scr、BUN的降低不显着（P>0.05）,而治疗组能显着降低Scr的指标（P<0.05）,且疗效优于对照组（P<0.05）；对于BUN的监测,治疗组在治疗前后效果比较无显着性差异（P>0.05）。4.安全性评价：降糖保肾ⅡⅡ号方对患者三大常规、肝功能、心电图均无不良影响,且在应用本方治疗过程中患者无过敏现象和其他毒副反应发生。结论 1.中药复方降糖保肾Ⅱ号方组方严格,紧扣病机,治疗组总有效率80.0%,优于西药氯沙坦片对照组,且在治疗过程中患者没有出现明显的不良反应,疗效安全可靠。2.中药复方降糖保肾Ⅱ1号方临床上治疗糖尿病肾病的作用机理可能是该方能在一定程度上减轻糖尿病肾病患者肾小球细胞外基质（ECM）的过度积聚,从而改善尿液中FN、Col-Ⅳ水平,减少尿蛋白的漏出,改善肾小球滤过的功能,延缓肾功能的恶化。

郭静^[3]（2014）在《通塞脉片对实验性糖尿病足模型的作用及机制研究》文中认为糖尿病足（DF）是因下肢远端外周血管病变及局部神经异常引起的足部感染、溃疡及深层组织破坏,是糖尿病患者常见的并发症,其发生与多个因素相关,包括长期的糖脂代谢紊乱、血液流变学异常、血管内皮损伤、微循环障碍等。通塞脉（TSM）原有的适应症是脉管炎,但是脉管炎和DF的中西医发病机制存在着相似之处,二者均是由中小动脉狭窄、闭塞导致肢端失去营养而出现溃疡、坏死的血管性疾病,且中医学均将二者归于“脱疽”范畴。因此我们将TSM用于DF的治疗,利用糖尿病足模型,评价TSM对糖尿病足模型的影响,并从血糖血脂、血液流变学、血管内皮细胞功能、VEGF信号通路等角度探讨TSM治疗DF的作用及其机制。方法（1）糖尿病足大鼠模型:选用健康雄性SD大鼠,用高脂高糖加链脲佐菌素（STZ）复制糖尿病大鼠,再行足部手术,建立DF大鼠模型。模型大鼠随机分为5组:模型组、二甲双胍0.135 g·kg-1组、通塞脉片12.44、6.22、3.11 g·kg-1三个剂量组,另设空白对照组,连续灌胃给药18 d,给药期间每天称量大鼠的饲料摄入量、饮水量;每天观察创面愈合情况,给药第4、8、13、18 d分别计算DF大鼠创面愈合率;给药第8、18d分别称量大鼠体重,取血测量空腹血糖和随机血糖。给药18 d后,取血测定血液流变学变化,用生化、放免法、Elisa法检测血清中FINS、GSP、脂质（TC,TG,HDL-C,LDL-C）、TNF-α、IL-6、MDA、SOD、NO、NOS、IVC、LN含量及血浆中ET、6-k-PGF1α、TXB2含量;Elisa法检测大鼠溃疡部位Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量;以HE染色、Masson染色观察足部溃疡面形态学变化（×200）;胰腺进行HE染色观察病变情况（×200）;采用免疫组化法检测VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS在足部溃疡部位的表达及毛细血管的数目（×200）;采用Western blot法检测VEGF、SDF1α、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS在足部溃疡部位的表达。（2）糖尿病下肢病变小鼠模型:在进行糖尿病下肢病变小鼠造模之前,我们首先进行了 DF模型小鼠的造模预试实验,但是由于小鼠足部面积较少且表皮较薄,在小鼠足部制造伤口很容易伤到血管引起出血过多,创伤较为严重,不利于后续观察,因此我们设计了糖尿病下肢病变小鼠模型。雄性ICR小鼠,用高脂高糖加四氧嘧啶（ALX）复制糖尿病模型,再行下肢手术（手术部位为下肢根部背面）,建立糖尿病下肢病变小鼠模型,根据血糖和创面面积随机分为5组:模型组、二甲双胍组、通塞脉片17.42g·kg-1组、8.71 g·kg-1组、3.85 g·kg-1组,另设10只做空白对照组。连续灌胃给药12 d,每天称量小鼠的饲料摄入量、饮水景;每天观察创面愈合情况,且于给药第4、8、12 d分别计算小鼠创面愈合率;给药第4、8、12 d分别称量小鼠体重,取血测空腹血糖。给药12d后,取血测定HbAlc,用生化、放免法检测血清中GSP、FINS、脂质（TC,TG,HDL-C,LDL-C）含量,以HE染色、Masson染色观察足部溃疡面形态学变化（×200）;胰腺行HE染色观察病变情况（×200）;分别于给药第4、8、12 d处死小鼠（每组各10只）,并采用免疫组化法检测VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS在足部溃疡部位的表达（×100）,采用 Western blot 法检测 VEGF、SDF1α、p-AKT、AKT、p-eNOS、eNOS 在足部溃疡部位的表达。结果1.TSM对糖尿病足模型创面愈合情况的影响:模型组大鼠和小鼠创面愈合缓慢,同一时间点伤口面积明显高于其它治疗组,与空白组比较均有显着性差异（P<0.05～0.01）。给予TSM治疗后伤口面积明显减少,创面愈合率明显加快,表明TSM可以促进模型动物的创面愈合,且有一定的剂量依赖性。DF大鼠治疗18 d、小鼠治疗12 d后,光镜下病理组织学观察可见DF模型组局部表皮上皮细胞中度变性,表皮与真皮炎性细胞中度浸润,病变程度显着高于空白对照组;并出现毛细血管增生,纤维结缔组织增生,皮肤附件明显减少等现象。应用TSM进行治疗后,DF模型的病变程度均减轻,可见表皮复层鳞状上皮,局部表皮上皮细胞轻度变性,少量炎性细胞浸润;真皮层见少量炎性细胞浸润,皮肤附件轻度减少,病变程度轻于模型组,其中TSM高剂量组的病变好转最为明显（P<0.050.01）。由Masson染色发现在模型大鼠治疗18 d后,空白和给药组创面基本愈合的情况下,胶原纤维合成减少;而模型组胶原纤维明显较多,平均IOD值显着高于空白对照组和TSM 12.44 g·kg-1组,表明模型组由于伤口愈合缓慢,在伤口修复阶段其合成大于分解,胶原形成较多。同时空白组和给药组Ⅲ型胶原较高,Ⅰ型胶原较少,Ⅰ/Ⅲ型胶原的比值明显低于模型组,说明创面愈合的弹性较好,瘢痕少,而模型组创面正处于愈合过程中,瘢痕多。以上结果说明TSM可以通过促进DF溃疡的愈合,加速胶原的合成,明显缩短病程,加快伤口修复。2.TSM对糖尿病足模型一般情况的影响:（1）血糖和胰岛素:DF模型动物空腹和餐后血糖均显着升高,GSP、FINS含量明显增加,胰岛素敏感性降低,胰岛素抵抗加剧（P<0.05～0.01）。HE染色中,模型组胰腺内胰岛结构不清,数目减少,细胞中度变性及坏死,部分导管空泡变性。给予TSM治疗后DF模型动物空腹血糖和餐后血糖均有所降低,GSP含量降低,并可显着降低IR,提高ISI,减轻胰腺变性及坏死（P<0.05～0.01）。说明TSM可以通过降低血糖,减少GSP含量,减轻IR,提高胰岛素敏感性,改善胰岛的结构和形态,促进模型动物的创面愈合。（2）血脂:模型组TC、TG和LDL-C水平均明显升高,HDL-C水平明显降低（P<0.01）,表明血脂代谢异常。在给予TSM治疗后TC、TG、LDL-C水平均降低,HDL-C水平升高,尤以TSM高剂量组降低最明显（P<0.01）,说明TSM对脂质代谢具有调节作用,可通过改善脂代谢异常、减轻血脂紊乱、降低胰岛素抵抗。3.TSM对糖尿病足模型氧化应激和促炎症因子的影响:（1）氧化应激:模型大鼠血清MDA含量明显升高,而抗氧化的SOD活力明显降低（P<0.01）,表明大鼠体内抗氧化系统平衡失调,清除氧自由基的能力降低,脂质过氧化产物明显增加。给予TSM治疗后,血清中SOD活力明显增强,同时MDA含量明显降低（P<0.05～0.01）。表明TSM可以提高模型大鼠清除氧自由基的能力,增强其抗氧化能力,从而减轻过氧化物对血管内皮细胞的直接损伤。（2）促炎症因子:模型大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6显着升高（P<0.01）,TSM 12.44g·kg1组可降低血清中TNF-α、IL-6水平（P<0.05）,说明TSM可以通过抑制TNF-α、IL-6的释放,减轻炎症对血管内皮细胞的损伤。4.TSM对糖尿病足模型血管内皮功能的影响:（I）血液流变学:DF模型大鼠血浆中PT、TT、APTT明显缩短,全血黏度、血浆黏度、血小板聚集率明显升高（P<0.01），表明大鼠体内血液黏度升高,血小板聚集、黏附增强,血流变发生异常,加重血管内皮损伤,促使血管功能发生障碍。给予TSM治疗后,血浆中PT、TT、APTT明显延长,同时全血黏度、血浆黏度、血小板聚集率明显降低（P<0.05～0.01）。表明TSM具有抗凝血、降低血液黏度、改善微循环等综合治疗作用,可以机体凝血功能,促进DF伤口愈合。（2）血管内皮活性因子:DF模型大鼠血清中NO、NOS含量、血浆中6-k-PGF1α水平明显下降,血浆中ET、TXB2、ET/NO、TXB2/6-K-PGF1α比值明显升高,与空白组比较均有显着性差异（P<0.01）。说明DF大鼠ET和NO、PGI2和TXA2的平衡被破坏,容易导致血小板聚集、血栓形成,加重血管内皮细胞损伤的程度。TSM三个剂量组均可升高血清中NO、NOS含量,降低ET/NO、TXB2/6-K-PGF1α比值,其中TSM 12.44 g·kg-1组可以明显升高血浆6-k-PGF1α水平,与模型组比较均有显着性差异（P<0.05～0.01）,表明TSM改善ET和NO、PGI2TXA2在体内的平衡,可以保护血管内皮细胞,改善微循环。（3）血管基底膜:DF模型大鼠血清LN、IVCL含量明显增加（P<0.01）,表明大鼠体内血管细胞外基质合成增加并发生积聚,血管基底膜增厚,引起微循环障碍和肢端缺血,加重了 DF病变,延缓伤口愈合。给予TSM治疗后,血清中LN、IVCL含量明显降低（P<0.05～0.01）,表明TSM可以提高模型大鼠降低血管基底膜的能力,增强对血管内皮的保护作用,从而减轻DF病变,加速溃疡的修复。5.TSM对糖尿病足模型VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路的影响:给药后18d模型组大鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平和毛细血管数目明显高于空白组（P<0.05,0.01）:TSM 12.44g·kg-1 组VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达明显低于模型组,毛细血管的数目明显低于模型组（P<0.05,0.01）。模型组小鼠治疗后4、8 d模型组小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显低于空白组,治疗后12d模型组小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显高于空白组,TSM高剂量组治疗后4、8d小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显高于模型组,12d小鼠VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的表达水平明显低于模型组,说明在伤口修复的后期,给药组VEGF-PI3K/AKT-eNOS的表达呈增长趋势,在伤口修复的后期,给药组VEGF-PI3K/AKT-eNOS的表达呈减少趋势,创面已基本修复完全。提示TSM可以通过调节VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路的表达,促进伤口愈合,加速修复。结论1.TSM三个剂量组均可促进DF模型的创面愈合,并呈现出一定的剂量依赖性。2.TSM可以通过降低DF模型动物的血糖、血脂,改善脂质代谢紊乱,提高胰岛素敏感性,调节胰岛素抵抗,维护SOD和MDA的平衡、减轻炎症反应,促进DF的伤口愈合,缩短病程,改善创面表皮和真皮的形态变化,加速胶原纤维的形成。3.TSM可以调节DF模型动物的血管内皮活性因子,减少血清NO、NOS和血浆6-k-PGF1α含量,增加ET、TXB2含量,改善ET和NO、PGI2和TXA2在体内的平衡,降低血液黏度和血小板聚集率,调节机体的血液流变性,从而保护血管内皮细胞,减少细胞外基质成分和血管基底膜的合成,抑制血管微循环障碍。4.TSM治疗DF的作用与调节VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路有关,可以通过VEGF、SDF1α、p-AKT、p-eNOS的蛋白含量,可以促进DF伤口部位的新生毛细血管形成,通过为伤口部位提供良好的血液供应,加快伤口愈合。综上所述,TSM可以降低模型动物的血糖血脂和胰岛素抵抗,抑制过氧化反应和过度炎症,改善血液流变性和血管内皮细胞功能,减少血管中细胞外基质成分的过度沉积,调节VEGF-PI3K/AKT-eNOS信号通路,促进DF伤口愈合,对于减少2型DF的发生来说具有重要意义。

戴军有^[4]（2014）在《早期2型糖尿病肾病预测因素及辨证分型与客观指标的相关性研究》文中研究说明目的:1、通过流行病学调查,探索早期2型糖尿病肾病的主要危险因素。2、探索血清脂联素（APN）、血清五聚蛋白3（PTX3）、尿内皮素（uET）、尿表皮生长因子（EGF）、尿视黄醇结合蛋白（RBP）等指标对2型糖尿病患者并发早期肾病的危险预测。3、通过流行病学调查,总结早期2型糖尿病肾病的证候分布,并探索证候与部分实验室指标的关系。4、探索早期2型糖尿病肾病血瘀证血糖、血脂、血液流变学、炎症、纤溶及内皮系统异常相关的指标变化,为早期2型糖尿病肾病血瘀证提供客观化依据。方法:采用临床流行病学横断面调查方法,多中心收集早期2型糖尿病肾病（DN,A组）182例及单纯糖尿病（DM,B组）170例,健康对照30例（C组）,早期DN组辨证为血瘀证亚组104例（A1组）,非血瘀证亚组78例（A2组）。收集患者证候（症状）、体征（含舌、脉象）及一般资料（含年龄、病程、血压及腰臀比）等临床信息,对证候及舌、脉象按程度无、轻、中、重级别分别给予0、1、2、3权重计分,由副主任及以上医师总结证型分布。留取各组患者的血液和尿液标本,高压液相色谱法测糖化血红蛋白（HbA1c）;生化法测空腹血糖（FPG）、血脂、血肌酐（CR）、胱抑素C（CysC）及血尿酸（UA）;免疫比浊法测C反应蛋白（CRP）;硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）;ELISA法检测血内皮素（sET）、纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、组织纤溶酶原激活物（t-PA）、血清正五聚蛋白3（PTX3）、血清脂联素（APN）、血清同型半胱氨酸（Hcy）及血尿视黄醇结合蛋白（RBP）。自动清洗血流变分析仪检测血液流变指标,血液流变指标包括:纤维蛋白原（Fib）,血浆粘度（PV,1OOs-1）,全血高切粘度（HSR,200s-1）,全血低切粘度（LSR,5s-1）,红细胞变形指数（TK）。血脂包括:甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）及脂蛋白（a）。收集24小时尿并记录尿量,放免法测尿内皮素（uET）、尿α1微球蛋白（α1-MG）、尿微量白蛋白（mALB）及尿表皮生长因子（EGF）,计算尿白蛋白排泄率（UAER）。用肾小球滤过率计算器（eGFR Calculator,用MDRD公式）估算肾小球滤过率（GFR）。并对上述所得一般资料、中医证型、实验室指标进行统计学分析。结果:1两组人口学资料与比较早期糖尿病肾病组（A组）和单纯糖尿病组（B组）性别构成比、民族分布、受教育程度无明显差别。年龄分布显示:A组50～70年龄段早期糖尿病肾病最多见、占45.60%,且年龄越大发病率越高;B组50～59年龄段单纯糖尿病最多、占50.00%,而60～70年龄段单纯糖尿病反而有所减少。病程分布显示:A组5～10年和10年以上所占比例较高,分别为30.22%和55.49%;B组则以5～10年和5年以下所占比例较高,分别为40.59%和45.29%;两组5年以下和10年以上病程比较均有统计学意义（P<0.05）。吸烟史分布显示:A组吸烟人数明显高于不吸烟人数,差异有统计学意义（P<0.05）;B组吸烟人数与不吸烟人数相差较小,A、B两组比较无明显差异（P>0.05）。饮酒史分布显示:A组饮酒人数与不饮酒人数、B组饮酒人数与不饮酒人数相近,A、B两组比较无明显差异（P>0.05）。2证型（候）分布与比较①证型分布与比较早期DN本证以气阴两虚为主、占62.1%,其次为阴虚热盛、占21.9%,阴阳两虚和脾肾气虚较少、分别占7.7%、8.2%;标证以血瘀证、湿热证为多,分别占73.6%、30.8%,痰瘀证和寒湿证较少、分别占17.6%、6.6%。单纯DM本证以阴虚热盛、气阴两虚为主,气阴两虚最多、占57.1%,其次为阴虚燥热、占35.8%,阴阳两虚较少、占7%;标证为血瘀证、占48.2%。两组比较:本证阴虚热盛差异有统计学意义（P<0.05）,余证差异无统计学意义（P>0.05）;标证血瘀证差异有统计学意义（P<0.05）。②证候分布与比较早期DN主要证候:气虚128例、占70.33%,阴虚127例、占69.78%,阳虚14例、占7.69%,血瘀134例、占73.6%,湿热56例、占30.8%,寒湿12例、占6.6%,痰瘀32例、占17.6%。单纯DM主要证候:气虚97例、占57.06%,阴虚109例、占64.12%,阳虚12例、占7.06%,血瘀82例、占48.2%。两组比较:气虚差异有统计学意义（P<0.05）,阴虚和阳虚差异均无统计学意义（P>0.05）。3早期DN危险因素分析以早期糖尿病肾病为因变量,其它指标为自变量,进行logistic分析。其中course、SBP、WHR、HbA1c先后被列入方程,为早期糖尿病肾病的独立危险因素（P<0.01）。4 DN不同证型血脂及HbA1c比较TG、TC、LDL依阴虚热盛、脾肾气虚、气阴两虚、阴阳两虚的顺序逐渐升高,HDL则相反。阴阳两虚与阴虚热盛、气阴两虚TG、TC、HDL、LDL、HbA1c差异有统计学意义（P<0.05）。脾肾气虚与阴虚热盛TG、LDL、HbA1c差异有统计学意义（P<0.05）,TC、HDL差异无统计学意义（P>0.05）。阴阳两虚与脾肾气虚HbA1c差异有统计学意义（P<0.05）。气阴两虚与阴虚热盛HbA1c差异有统计学意义（P<0.05）。5尿蛋白排泄率比较早期糖尿病肾病组（A组）和单纯糖尿病组（B组）不同证型UAER水平比较:组间比较,除阴阳两虚外,其余证型差异均有统计学意义（P<0.05）。组内比较:血瘀证与非血瘀证差异有统计学意义（P<0.05）;阴虚热盛、气阴两虚、气阴两虚中任意两型比较差异均无统计学意义（P>0.05）。A、B两组不同证候UAER水平比较:气虚差异有统计学意义（P<0.05）,阳虚和阴虚差异均无统计学意义（P>0.05）。阴虚证与非阴虚证、气虚证与非气虚证、湿热证与非湿热证、痰瘀证与非痰瘀证,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,阳虚证与非阳虚证、寒湿证与非寒湿证,差异均无统计学意义（P>0.05）。6各组间观察指标比较①与单纯糖尿病组（B组）比较,早期糖尿病肾病组（A组）EGF降低,UAER、Hcy、RBP、PTX3、uET、APN、CRP、α1-MG 及 CysC 升高,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。②早期糖尿病肾病组（A组）和单纯糖尿病组（B组）两组病程、SBP、DBP、WHR、HbA1c、TG、HDL、Lp-α、UA、GFR及 UAER 差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,FPG、LDL、TC、CR差异无统计学意义（P>0.05）。③各组血脂及HbA1c比较:（1）与非血瘀组比较,血瘀组HbA1c、TG及LDL升高,HDL降低,差异有统计学意义（P<0.05）,TC差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组比较,血瘀组HbA1c、TG、TC及LDL升高,HDL降低,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。（2）与非血瘀组比较,血瘀组Fib、TK、PV及LSR升高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,HSR差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组比较,血瘀组PV、TK、Fib、HSR及LSR升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）与非血瘀组比较,血瘀组sET及PAI-1升高,NO及t-PA降低,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与正常组比较,血瘀组sET及PAI-1升高,NO及t-PA降低,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。（4）与非血瘀组相比,血瘀组Hcy、PTX3升高,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与正常组比较,血瘀组Hcy、PTX3升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。7相关性分析临床工作中,我们发现大多数肥胖的糖尿病肾病患者血脂往往更高、高血糖更难控制,HbA1c较高的患者常常伴有高脂血症、且病程较长,等等。为了明确早期糖尿病肾病各危险因素相互之间的联系,本研究进行了 Spearman相关分析,结果显示:HbA1c与 TG、Course,WHR 与 TG、HbA1c 呈正相关,相关系数分别为 0.542、0.725、0.471、0.582,均P<0.05;其余指标之间相关性无统计学意义（P>0.05）。HbA1c与HSR、LSR呈正相关,且LSR与HSR呈正相关,相关系数分别为0.62、0.70、0.80,均 P<0.01。TK 与 HSR、PV、LSR 呈正相关,相关系数分别为 0.33、0.82、0.44,P<0.05或P<0.01。Fib与TG、TC呈正相关,相关系数分别为0.62、0.57,均P<0.01。sET与PTX3、PAI-1均呈正相关,相关系数分别为0.52、0.62,均P<0.05。sET与NO、PAI-1与t-PA均呈显着负相关,相关系数分别为0.78、0.66,均P<0.01。NO与t-PA呈正相关,相关系数分别为0.41,P<0.05。APN与CRP,UAER与APN、CysC、CRP均呈正相关,相关系数分别为0.731、0.614、0.563、0.562,均 P<0.05。EGF 与 APN、UAER 呈负相关（P<0.05）,相关系数分别为 0.660、0.482,均 P<0.05。UAER 与 Hcy、RBP、PTX3、α1-MG、uET 均呈正相关,相关系数分别为 0.715、0.586、0.649、0.479、0.673,均 P<0.05。uET 与 PTX3,RBP与α1-MG均呈正相关,相关系数分别为0.562、0.468,均P<0.05。结论:1、联合检测EGF、APN、PTX3、RBP、uET、CysC、Hcy等指标有助于早期发现糖尿病肾病。2、早期DN本证以气阴两虚证为主,标证以血瘀证为主,益气养阴、活血化瘀是中医主要治法之一。3、早期DN血瘀证患者存在非感染性炎症和血糖、血脂、血液流变学、纤溶及血管内皮系统异常,相关生物学指标可为早期DN血瘀证客观化提供依据;中医活血化瘀治疗早期DN的有效性,可能与改善血液流变学、非感染性炎症、纤溶及血管内皮系统异常等机制有关。4、严格控制血糖、血压、体重及戒烟等有利于延缓DN的发生、发展。

杜正驰,赵妍^[5]（2013）在《血清TGF β1,Ⅳ型胶原,层粘连蛋白与糖尿病肾病的关系》文中研究说明目的:研究2型糖尿病患者血清TGF-β1,Ⅳ型胶原,层粘连蛋白水平与糖尿病肾病之间的关系和对早期糖尿病肾病的诊断意义。方法:应用ELASA法测定61例2型糖尿病患者和18例健康者的血清Ⅳ型胶原,层粘连蛋白,血清TGF-β1水平。2型糖尿病患者根据尿蛋白排泄率（UAER）分为UAER正常组和糖尿病肾病组。糖尿病肾病组进一步根据UAER分为微量蛋白尿组和临床肾病组。结果用SPSS12.0统计学软件做统计学分析。结果:糖尿病患者的血清TGF-β1,Ⅳ型胶原,层粘连蛋白水平高于正常对照组（P<0.01）;糖尿病患者各组的血清Ⅳ型胶原和层粘连蛋白水平随UAER增高依次增加（P<0.01）;糖尿病各组间血清TGF-β1水平无明显差异（P>0.05）。结论:2型糖尿病患者血清Ⅳ型胶原,层粘连蛋白,TGF-β1水平均高于正常人,血清Ⅳ型胶原,层粘连蛋白,TGF-β1与DN的发生,发展有密切的关系,血清Ⅳ型胶原可以作为诊断早期糖尿病肾病的指标,血清Ⅳ型胶原还是反映糖尿病肾病严重程度的重要预测指标。

王保兴^[6]（2011）在《Megsin对糖尿病小鼠肾组织ERK及ECM作用的影响》文中认为目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病严重并发症之一,它的危害巨大,不积极治疗,最终可发展成终末期肾衰竭。糖尿病肾病在美国和欧洲已成为引起终末期肾病的最常见病因,约占终末期肾病接受透析的40%。2001年,对我国30个省市自治区住院患者的调查发现,DN患病率约为33%,因此探索DN的发病机制及防治策略成为目前广大肾脏病学者关注的课题。研究认为,糖尿病肾病的发病机制与糖脂代谢紊乱、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活、高血压所致的肾血流动力学改变、氧化应激、血管活性物质及细胞因子、遗传因素等多因素有关。DN的病变特征是肾小球肥大,其病理学基础是肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell, GMC）增殖、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）积聚,从而导致肾小球高滤过和蛋白尿,最后导致肾小球硬化和肾间质纤维化。ECM的积聚是由于ECM合成增加和降解减少所致,多种原因,比如细胞因子或生长因子等促进了系膜增殖、系膜细胞肥大和基质分泌增加。同时还存在着ECM降解减少,目前已知道参与ECM降解的酶主要有三类:丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）及半胱氨酸蛋白酶。基质金属蛋白酶可以降解ECM中的Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型胶原。纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor, PAI-1）能够抑制丝氨酸蛋白酶,使ECM降解减少。它们的动态失衡直接参与了ECM的积聚。Megsin（mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin）是一种系膜细胞优势表达基因,属serpin超家族成员,其能够与丝氨酸蛋白酶结合,发挥丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。已有研究发现,在IgA肾病的系膜细胞中,其基因与蛋白表达水平显着上调。提示megsin作为serpin的成员,必定参与了GMC的某些病理生理过程。糖尿病肾病作为一种以系膜细胞增生和系膜基质积聚为主要病理改变的疾病,megsin基因怎样参与糖尿病肾病的发病过程及其作用途径如何目前尚未阐明。因此探讨megsin在GMC细胞外基质合成与降解中的作用对于深入揭示糖尿病肾病的发生机制具有重要意义。本课题建立糖尿病CD-1小鼠模型并转染Megsin基因,同时应用RNA干扰技术使megsin在小鼠肾脏组织中过表达或表达抑制,从整体、细胞和分子水平观察megsin、血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB , PDGF-BB ）、细胞外信号调节蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK1/2）、转化生长因子β1（transforming growthfactor-β1,TGF-β1）、Ⅳ型胶原（collagen IV）等表达的变化,从而探讨megsin在糖尿病肾病发病过程中可能的细胞信号传导通路及其对ECM合成的影响;通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Extracellular matrix metalloproteinases inducer,EMMPRIN）、MMP-9及IV胶原表达的变化,探讨megsin对高糖环境下系膜细胞ECM降解的影响;通过药物干预,观察吡格列酮（pioglitazone）对高糖环境中megsin、MMP-2、PAI-1及IV型胶原表达的影响,为进一步探讨megsin在糖尿病肾损害中发病中的作用及其防治提供新的途径。方法:第一部分:选取清洁级健康雄性CD-1小鼠60只,行单侧肾切除,2周后切口完全愈合。随机抽取45只腹腔注射链尿佐菌素（streptozotocin,STZ）150mg/kg制备糖尿病小鼠模型。将检测成模的45只小鼠随机分为三组,构建megsin表达质粒并经尾静脉注射转染小鼠（D组,n=15）每周一次、单纯糖尿病组（B组,n=15）、糖尿病+空质粒转染组（C组,n=15）,将只做单侧肾切除的小鼠作为正常对照组（A组,n=15）。实验共12周,在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及肾组织标本,检测其血糖（BG）、血清肌酐（Scr）、小鼠肾重与体重比值（KW/BW）、尿蛋白（UP）。在2、4、12周末收集肾组织标本,分别应用免疫组化染色和蛋白印记法测定肾组织中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原的表达。建立稳定表达megsin小鼠系膜细胞株,高糖环境下培养48小时（D组）,同时设立小鼠系膜细胞低糖培养组（A组, 5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖培养组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+转染空质粒培养组（C组）和转染megsin质粒+高糖+ U0126组（E组）,分别于12、24、48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN的表达,应用蛋白印记法测定各组总蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度。第二部分:动物模型制备同第二部分,经尾静脉注射megsin siRNA质粒转染CD-1糖尿病小鼠（D组）,每周注射1次,并设立糖尿病组（B组）、糖尿病+空质粒转染组（C组）,单侧肾切除对照组（A组）,每组各15只小鼠,实验共12周,在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及肾组织标本,检测其BG、Scr)、小鼠肾重与体重比值（KW/BW）及UP。在2、4、12周末收集肾组织标本,分别应用免疫组化染色和蛋白印记法测定肾组织中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原的表达。体外培养小鼠系膜细胞,应用脂质体作为载体瞬时转染megsin siRNA质粒,在高糖环境下培养48小时（D组,）,并设立小鼠系膜细胞低糖培养组（A组,5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖培养组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+空质粒培养组（C组）,于12、24、48小时末收集每组细胞和上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及纤维连接蛋白的表达,应用蛋白印记法测定各组总蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度。第三部分:建立稳定表达megsin的小鼠系膜细胞,在高糖环境下培养48小时（D组）;应用脂质体2000作为载体瞬时转染megsin siRNA质粒,在高糖环境下培养48小时,（E组）,并设立小鼠系膜细胞低糖培养组（A组,5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖培养组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+空质粒培养组（C组）,分别于12、24、48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、EMMPRIN及MMP-9的表达,应用蛋白印记法测定各组megsin、EMMPRIN和MMP-9蛋白的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度。第四部分:取小鼠系膜细胞种植于96孔板,采用MTT法分别检测低糖、高糖及干预药物吡格列酮对系膜细胞增殖状态的影响。采用6孔板和25cm2塑料培养瓶培养细胞,将细胞分成3组:低糖组（A组,5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+吡格列酮组（C组）,于48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、EMMPRIN、MMP-2、PAI-1的表达,应用蛋白印记法测定各组总蛋白中megsin、EMMPRIN、MMP-2、PAI-1的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度（结果用总蛋白校正）。结果:第一部分:1动物实验:与A组相比, B组、C组小鼠在第4周时可见KW/BW、Scr、UP升高（P<0.01）,D组升高更为明显（P<0.01）;12周时,上述改变更加显着。从第2周开始,光镜下观察B组、C组小鼠可见肾小球内细胞数增多,肾小球体积稍增大,系膜区基质增多;PAS染色可见阳性红染物质增加,Masson染色可见胶原纤维增多;D组变化较B组、C组明显;到12周末时上述变化更为显着。免疫组化及蛋白印记结果显示,与A组先比,第2周末即可见B组、C组、D组CD-1小鼠肾组织中megsin表达增强（P<0.01）,D组与B、C组相比,表达更加明显（P<0.01）。B组、C组、D组随着时间延长,megsin在肾组织的表达逐渐加强,至12周末表达最强,各时间点之间相比,具有统计学差异（P均<0.01）。B组、C组、D组PDGF-BB、pERK1/2、TGF-?1、FN及IV型胶原在第2周末表达增强,与A组相比具有统计学差异（P均<0.01）,D组与B、C组相比,表达更加显着（P均<0.01）。B组、C组、D组随着时间延长,上述指标在肾组织的表达逐渐加强,至12周末表达最强。蛋白印记检测megsin、PDGF-BB、pERK1/2及TGF-β1蛋白在各组、各时间点表达的结果与免疫组化相一致。2体外系膜细胞培养:免疫细胞化学结果显示,高糖培养组（B组）及转染空质粒组（C组）从12h开始,megsin、PDGF-BB表达即开始增强,且随时间表达有逐渐增强的趋势,至48小时表达最强,与A组同时相相比,差异具有统计学意义（P均<0.01）,两组各时间点之间相比,megsin及PDGF-BB表达也具有统计学意义（P均<0.01）。而经转染megsin质粒（D组）后,megsin及PDGF-BB表达在各时间点随时间延长表达显着增强,与B组各时相相比具有统计学意义（P均<0.01）。经过U0126干预（E组）后发现,在各时间点与D组相比,megsin、PDGF-BB表达没有显着降低（P均>0.05）。高糖培养组（B组）及转染空质粒组（C组）从12h开始,pERK1/2、TGF-?1及FN表达即开始增强,且随时间表达有逐渐增强的趋势,至48小时表达最强,与A组同时相相比,差异具有统计学意义（P均<0.01）,两组组各时间点之间相比,三者表达也具有统计学意义（P均<0.01）。而经转染megsin质粒（D组）后,pERK1/2、TGF-?1及FN表达在各时间点随时间延长表达显着增强,与B组各时相相比具有统计学意义（P均<0.01）。经过U0126干预（E组）后发现,在各时间点与D组相比,三者表达显着降低（P均<0.01）。蛋白印记法检测megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1蛋白在各组、各时间点表达与免疫细胞化学检测结果相一致。细胞上清液IV型胶原测定结果显示B组和C组上清液中IV型胶原含量随时间延长逐渐增加,48h达高峰,与A组同时相相比,其含量具有统计学差异（P均<0.01）;D组与B组同时相相比,上清液中IV型胶原的含量则随时间延长增加显着,差异具有统计学意义（P均<0.01）;与D组同时相相比,E组其含量则显着降低,具有统计学差异（P均<0.01）。第二部分:1.动物实验:B组、C组、D组小鼠注射STZ45天后即出现多饮、多食、多尿表现,而A组则无上述表现。B组、C组小鼠KW/BW、血清肌酐和UP在第2周开始升高,D组较A组略有下降,但与A组相比差异无统计学意义;与A组相比, B组小鼠从第4周开始,KW/BW、血清肌酐、UP升高（P<0.01）,C组升高更为明显（P<0.01）;D组与B组相比KW/BW、血清肌酐、UP下降（P<0.01）,12周时,上述改变更加显着。从第二周开始,光镜下观察B组、C组小鼠肾小球体积稍增大,基底膜普遍增厚,系膜区基质增多,D组变化较B组减轻;到12周末时上述变化更为显着。免疫组化和蛋白印记结果显示,与A组相比,B组从第二周开始,其肾小球megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原表达增强（P<0.01）;D组转染megsin siRNA后,与B组相比肾小球megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原表达减弱,差异具有统计学意义（P<0.01）;随着时间的延长,与A组相比,B组肾小球megsin、pERK1/2、PDGF-BB、TGF-β1及IV型胶原表达进一步加强（P<0.01）,12周是表达最强,D组上述各项指标较B组减弱（P<0.01）。B组和C组上述指标在各时间点相比差异无统计学意义（P>0.05）。2.细胞培养:免疫细胞化学及蛋白印记结果显示,从12小时开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表达及蛋白水平开始升高（P<0.01）,48小时达高峰,C组与B组相比差异无统计学意义（P>0.05）;D组与B组同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表达及蛋白水平减弱,具有统计学差异（P<0.01）;从12小时开始,与A组相比,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）开始升高,48小时达高峰（<0.01）,C组与B组同期相比差异无统计学意义（>0.05）,但D组与B组同期相比,系膜细胞上清液中IV胶原浓度显着下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。第三部分:免疫细胞化学及蛋白印记结果显示,与A组相比,从12小时开始,B组小鼠系膜细胞megsin表达及蛋白水平开始升高（P<0.01）,48小时达高峰,C组与B组相比差异无统计学意义（P>0.05）;D组与B组同期相比,megsin表达及蛋白水平升高更加明显（P<0.01）;E组与B组、D组同期相比,megsin表达及蛋白水平均显着减弱（P<0.01）;从12小时开始,B组较A组EMMPRIN、MMP-9表达及蛋白水平下降,差异具有统计学意义（P<0.01）,48小时达高峰,C组与B组相比差异无统计学意义（P>0.05）;D组与B组同期相比,EMMPRIN、MMP-9表达及蛋白水平下降更加明显,具有统计学差异（P<0.01）;E组与B组、D组同时相相比,EMMPRIN及MMP-9表达明显增强及蛋白水显着升高（P<0.01）;从12小时开始,与A组相比,B组小鼠MC上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）开始升高,48小时达高峰（<0.01）,D组与B组相比,MC上清液中IV胶原浓度升高更明显（P<0.01）,E组与B组、D组同期相比,系膜细胞上清液中IV胶原浓度则有显着性下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。第四部分:免疫细胞化学及蛋白印记结果显示,与A组相比, 48h时B组小鼠系膜细胞megsin、PAI-1表达及蛋白水平升高（P<0.01）,C组与B组同期相比,megsin及PAI-1表达减弱及蛋白水平降低（P<0.01）;B组较A组EMMPRIN、MMP-2表达减弱及蛋白水平下降（P<0.01）,C组与B组同期相比,EMMPRIN、MMP-9表达增强及蛋白水平升高,具有统计学差异（P<0.01）;与A组相比,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）升高（<0.01）,C组与B组同期相比,系膜细胞上清液中IV胶原浓度明显下降（P<0.01）。结论:1动物实验及细胞培养研究表明,糖尿病状态下megsin基因在肾小球表达增强,与肾小球系膜增殖及ECM积聚相一致,提示megsin在糖尿病小鼠肾损害的发病机制中具有一定的作用。2过表达的megsin可促进糖尿病小鼠肾组织或系膜细胞ECM积聚,其作用机制一方面可能是通过PDGF-BB诱导的ERK通路激活,TGF-?1表达增加,使FN的表达及IV型胶原的含量增加而实现的;另一方面过表达的megsin可抑制糖尿病小鼠肾组织或系膜细胞EMMPRIN、MMP-9的表达,导致了ECM的降解减少,从而参与了糖尿病小鼠肾损害的发病过程。3 megsin siRNA和吡格列酮可下调糖尿病小鼠肾组织或系膜细胞megsin基因的表达,通过抑制ERK通路转导或促进基质金属蛋白酶合成,使ECM的合成减少和降解增加,从而延缓了ECM积聚的病理过程,为人类早期糖尿病肾病的防治提供了新的思路和理论依据。

郭莉^[7]（2010）在《Megsin基因对高糖环境下小鼠肾脏系膜细胞EMMPRIN、MMP-2表达的影响》文中研究表明目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一,它已成为终末期肾功能衰竭（end-stage renal failer,ESRF）的主要原因之一,因此探索DN的发病机制及防治策略成为目前广大肾脏病学者关注的课题。DN的发病受多种因素影响,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解、合成失调和重塑导致的肾小球硬化和肾小管间质纤维化是DN的主要病理表现,其中调控ECM代谢的ECM降解酶类的表达与活性异常发挥着重要的作用。Miyata等从人系膜细胞的基因表达库中分离出一种在系膜细胞优势表达的基因Megsin（mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin）,属丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。已有研究发现,其在以系膜细胞增生、系膜基质积聚为主要病理改变的糖尿病肾病中,其基因与蛋白表达水平显着上调。Megsin基因与蛋白的表达上调在糖尿病肾病发病机制中的作用尚不完全清楚。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是调控肾脏ECM代谢的一个重要的降解系统,包括明胶酶、间质胶原酶、基质溶素、弹力蛋白酶以及分泌型和膜型MMP等,它们的活性均依赖锌离子,活化的基质金属蛋白酶可以协同地降解多种ECM成分,其中MMP-2、MMP-9是起关键作用的酶。最近Ohtomo等研究发现,megsin能抑制MMP-2、MMP-9和纤溶酶的活性,megsin的特异性单克隆中和抗体能增强上述三者的活性,且作用机制与转化生长因子β（TGF-β）无直接关系。故探讨megsin在细胞外基质代谢中的作用对于深入揭示糖尿病肾病的发生机制具有重要意义。本研究拟通过体外培养肾小球系膜细胞（Mc）,并采用细胞转染技术,对系膜细胞megsin基因的表达进行干预,观察高糖环境中megsin过表达和抑制状态下小鼠Mc中megsin、EMMPRIN、MMP-2、Ⅳ型胶原表达水平的变化,探讨高糖环境下megsin基因在ECM代谢过程中的作用,为进一步揭示糖尿病肾病的发病机制及寻找早期防治方法提供实验性理论依据。方法:将培养的小鼠肾小球Mc随机分为五组:即正常对照组:（A组,D-葡萄糖5.5mmol/L）、高糖组:（B组,D-葡萄糖30mmol/L）、高糖+空质粒组（C组,D-葡萄糖30mmol/L）、高糖+megsin质粒组:（D组,D-葡萄糖30mmol/L）、高糖+megsin siRNA组:（E组,D-葡萄糖30mmol/L）。大量提取已构建的空质粒、过表达megsin质粒和表达megsin siRNA质粒,按实验分组设计应用脂质体2000瞬时转染相应质粒（western blot法测定各组细胞megsin蛋白表达量以检测转染效率）并给予相应刺激,分别在培养12、24、48小时后收集细胞,采用免疫细胞化学和蛋白印迹（Western blot）方法测定Megsin、EMMPRIN、MMP-2的表达情况,用放免法测定各组细胞上清中Ⅳ型胶原的含量（结果用总蛋白校正）。结果:1免疫细胞化学结果显示:megsin表达于系膜细胞的胞浆中,A组有微弱表达,呈浅棕黄色。各时间点,B组megsin蛋白的表达量较A组升高,随时间延长表达逐渐增强,（p<0.01）;C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）;与同时期C组相比,D组megsin蛋白水平升高明显,呈深棕黄色强表达,差异有显着性（p<0.01）,E组megsin蛋白水平降低明显,差异有显着性（p<0.01）。EMMPRIN和MMP-2表达于系膜细胞的胞浆中,A组呈深棕黄色强表达。各时间点,B组EMMPRIN、MMP-2蛋白的表达量较A组降低,且随时间延长其表达被抑制（p<0.01）,C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）;与同时期C组相比,D组EMMPRIN、MMP-2蛋白水平降低明显,有微弱表达,呈浅棕黄色,差异有显着性（p<0.01）;E组EMMPRIN、MMP-2蛋白水平升高明显,差异有显着性（p<0.01）。2 Western blot结果显示:megsin在A组有少量表达,各时间点,B组的表达量较A组升高,且随时间延长其表达呈上升趋势（p<0.01）;C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）;与同时期C组相比,D组megsin升高明显,差异有显着性（p<0.01）,E组megsin降低明显,差异有显着性（p<0.01）。EMMPRIN和MMP-2在A组有大量表达,各时间点,B组EMMPRIN、MMP-2蛋白的表达量较A组降低,且随时间延长其表达呈下降趋势（p<0.01）,48h时EMMPRIN、MMP-2水平降至最低;C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）;与同时期C组相比,D组EMMPRIN、MMP-2水平降低明显,差异有显着性（p<0.01）,E组EMMPRIN、MMP-2水平升高明显,差异有显着性（P<0.01）。3放免法检测细胞上清液IV型胶原从12h开始,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白浓度校正）较A组开始升高,48h达到高峰（P<0.01）;C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）;与同时期C组相比,D组IV型胶原浓度升高明显,差异有显着性（P<0.01）,E组IV型胶原浓度降低明显,差异有显着性（P<0.01）。结论:1体外实验证实,高糖环境下培养的系膜细胞中megsin的表达增高,EMMPRIN和MMP-2表达降低,提示megsin、EMMPRIN和MMP-2在DN发生机制中起一定作用。2高糖状态下,系膜细胞过表达megsin导致EMMPRIN和MMP-2的表达下降,Ⅳ型胶原增加;转染megsin siRNA质粒对megsin基因进行干扰后megsin的表达降低,EMMPRIN和MMP-2的表达上升,Ⅳ型胶原减少。提示megsin促进早期DN发生的机制可能部分通过EMMPRIN影响MMP-2的表达,抑制Ⅳ型胶原降解,从而导致细胞外基质进行性堆积。3应用megsin RNA干扰技术可以缓解细胞外基质积聚的病理过程,为人类早期DN的防治提供了新思路。

刘茂东^[8]（2009）在《Megsin在糖尿病肾病发病机制中的作用》文中指出目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症。随着全球范围内糖尿病（diabetes mellitus,DM）发病率逐年升高,糖尿病肾病逐渐成为导致终末期肾衰竭（end-stage renal failure,ESRF）的首位或主要病因,患者最终只能依靠透析或肾移植维持生命,严重影响了生存质量,给家庭和社会带来沉重的经济负担和精神压力。如何早期有效防治糖尿病肾病是当今国内外学者热切关注的课题。糖尿病肾病的病理特征是肾小球系膜细胞增生、肥大,细胞外基质积聚,最终发生肾小球硬化。肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）是肾脏重要的固有细胞（inherent cell）之一,在肾脏的组织结构和生理功能方面发挥着重要作用,具有产生细胞外基质、分泌细胞因子、吞噬和清除异物等多种功能。肾小球系膜细胞也是多种致病因子作用的主要靶细胞,在病变进展中扮演着重要角色。Megsin是一种系膜细胞优势表达基因,定位于18q21.3,编码蛋白N末端可变反应活性环（reactive site loop,RSL）与丝氨酸蛋白酶结合,发挥丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,serpin）活性。Serpin家族成员众多,功能涉及凝血、纤溶、炎症、细胞增殖、凋亡、信号转导、消化等多个系统,serpin与其作用底物丝氨酸蛋白酶之间的动态平衡与机体各项生理活动的正常进行息息相关,推测megsin作为serpin的成员之一,势必参与系膜细胞的某些生理活动,探讨megsin在肾小球系膜细胞中的作用对于深入揭示糖尿病肾病的发生机制具有重要意义。本研究拟通过临床和基础研究两方面,观察megsin在糖尿病状态下肾组织中的表达变化;分别构建megsin表达质粒和megsin siRNA表达质粒,转染CD-1小鼠和小鼠肾脏系膜细胞,从整体、细胞和分子水平探讨megsin与系膜细胞增殖程度、细胞外基质代谢关键酶基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase,MMP-2）/组织型抑制剂-2（tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-2）以及细胞周期抑制蛋白P27水平之间的关系,探讨megsin在糖尿病肾病早期的致病机制;通过Sprague-dawlay（SD）大鼠糖尿病模型干预实验,观察羟甲基戊二酰辅酶A（Ahydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A,HMG-CoA）还原酶抑制剂（HMG-CoA reductase inhibitor , HCRI）对肾组织megsin表达的影响,最终来阐明megsin参与早期糖尿病肾病发生的作用,筛选从基因或蛋白水平阻断megsin致病作用的有效途径,为进一步阐明糖尿病肾病发病的分子机制及其防治提供一条新思路。方法:第一部分:从我院肾内科2006年6月至2007年6月住院患者中选择符合1999年WHO糖尿病诊断标准的2型糖尿病患者60例和原发性肾病综合征患者38例,经肾活检病理检查并结合临床资料确诊糖尿病肾病18例和微小病变性肾小球病,确定为研究对象,另外5例正常肾组织（选自我院泌尿外科肾癌患者手术切除的肾脏病灶远周部分）作为正常对照组,进行免疫组织化学染色,并半定量分析各组肾组织标本中megsin的表达。第二部分:建立单侧肾切除+链脲佐菌素诱导的CD-1小鼠糖尿病模型,构建megsin表达质粒并经尾静脉注射转染小鼠（C组,n=15）,每周1次,同时设立单纯单侧肾切除组（A组,n=15）和单侧肾切除+糖尿病+空质粒转染组（B组,n=15）,实验共12周,分别于第1、2和12周末收集各组小鼠血、尿和肾组织标本,测定血糖（blood glucose,BG）、血肌酐（serum creatinine,Scr）、肾重/体重比值（Kidney weight/body weight ratio,KW/BW）、尿蛋白（Urinary protein,UP）,分别应用免疫组织化学染色和western blot测定肾组织中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和IV型胶原的表达;建立稳定表达megsin的小鼠系膜细胞株（D组）,高糖环境中培养48小时,同时设立野生型小鼠系膜细胞正常糖培养组（A组）、高糖培养组（B组）和megsin质粒对照+高糖培养组（C组）,分别于12、24和48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用western blot测定各组总蛋白中megsin、MMP-2、TIMP-2和P27的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原浓度（结果用总蛋白校正）。第三部分:动物模型制备同第二部分,构建megsin siRNA表达质粒并经尾静脉注射转染糖尿病小鼠（C组,n=15）,每周1次,同时设立单纯单侧肾切除组（A组,n=15）和单侧肾切除+糖尿病+空质粒转染组（B组,n=15）,实验共12周,分别于第1、2和12周末收集各组小鼠血、尿和肾组织标本,测定血糖（blood glucose,BG）、血肌酐（serumcreatinine,Scr）、肾重/体重比值（Kidney weight/body weight ratio,KW/BW）、尿蛋白（Urinary protein,UP）,分别应用免疫组织化学染色和western blot测定肾组织中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和IV型胶原的表达;体外培养小鼠系膜细胞,应用脂质体2000瞬时转染megsin siRNA质粒,高糖环境中培养48小时,同时设立小鼠系膜细胞正常糖培养组、高糖培养组和空质粒+高糖培养组,分别于12、24和48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用western blot测定各组总蛋白中megsin、MMP-2、TIMP-2和P27的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原浓度（结果用总蛋白校正）。第四部分:建立链脲佐菌素诱导的SD大鼠糖尿病模型,给予氟伐他汀干预（2mg·kg-1·d-1灌胃,DF组,n=6）,同时设立糖尿病对照组（DC组,n=6）和正常对照组（NC组,n=6）,于实验第6周末用代谢笼收集各组大鼠血、尿及肾组织标本,测定BG、血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、血肌酐（serum creatinine,Scr）和尿肌酐（urine creatinine,Ucr）,并计算肌酐清除率（creatinine clearance rate,Ccr）,结果用体重校正,放免法测定24h尿白蛋白排泄率（urine albumin excretion rate,UAER）,免疫组织化学染色半定量分析各组大鼠肾组织megsin、IV型胶原和层黏连蛋白（laminin,LN）的表达,并行肾组织过碘酸-希夫（periodic acid-schiff,PAS）染色,普通光镜下观察肾小球病理学改变。结果:第一部分:正常肾组织和微小病变性肾小球病患者肾组织中megsin在肾小球系膜区无表达或仅微弱表达,两组间差异无显着性（p>0.05）,而在糖尿病肾病患者肾组织肾小球表达增强,与其他两组比较差异有显着性（p<0.01）。第二部分:1.动物实验糖尿病小鼠成模4～5天后出现多饮、多食、多尿表现;第1周末B组小鼠肾小球固有细胞数目增多,免疫组化和western blot结果显示肾小球megsin、TIMP-2、P27和IV型胶原表达增强,MMP-2表达减弱,C组变化更显着,三组间差异有显着性意义（p<0.05）;第2周末上述各指标变化更为明显,三组间比较有显着性差异（p<0.05）;第12周末B组小鼠肾小球固有细胞数目减少,与A组无差异（p>0.05）,P27表达水平回落,但仍高于A组（p<0.05）,与C组无差异（p>0.05）,其他指标如megsin、TIMP-2和IV型胶原进一步增强,但仍弱于C组,MMP-2表达水平进一步降低,但仍高于C组（p<0.05）。第12周末UP、Scr和KW/BW比值在A组最低,在C组最高,B组次之,三组间差异有显着性意义（P<0.05）。2.细胞培养从12h开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、P27和TIMP-2蛋白水平开始升高,48h达到高峰,48h时MMP-2水平降至最低（P<0.05）,C组和B组相比差异无显着性（P>0.05）,但D组变化趋势更明显,与B组和C组相比差异有显着性意义（P<0.05）;从12h开始,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）较A组开始升高,48h达到高峰（P<0.05）,C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）,但D组系膜细胞上清液中IV型胶原浓度升高最明显,与其他组相比差异有显着性意义（P<0.05）。第三部分:1.动物实验糖尿病小鼠成模4～5天后出现与第二部分类似的糖尿病症状;第1周末B组小鼠与A组相比,肾小球固有细胞数目增多,免疫组化和western blot结果显示肾小球megsin、TIMP-2、P27和IV型胶原表达增强,MMP-2表达减弱,C组上述各指标介于A组和B组之间,三组间差异有显着性意义（p<0.05）;第2周末B组小鼠肾小球固有细胞数目、组织中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和IV型胶原表达变化更明显,C组上述各指标介于A组和B组之间,三组间比较有显着性差异（p<0.05）;第12周末B组小鼠肾小球固有细胞数目减少,P27表达水平下降,但二者仍高于A组或C组（p<0.05）,其他指标如megsin、TIMP-2和IV型胶原进一步增强,MMP-2表达水平进一步降低,C组上述各指标介于A组和B组之间,三组间差异有显着性意义（p<0.05）。第12周末UP、Scr和KW/BW比值在A组最低,在B组最高,C组次之,三组间差异有显着性意义（P<0.05）。2.细胞培养从12h开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、P27和TIMP-2蛋白水平开始升高,48h达到高峰,48h时MMP-2水平降至最低（P<0.05）,C组和B组相比差异无显着性（P>0.05）;D组与B组或C组同期相比,megsin、P27和TIMP-2蛋白水平降低,MMP-2升高,差异有显着性意义（P<0.05）;从12h开始,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白浓度校正）较A组开始升高,48h达到高峰（P<0.05）,C组与B组相比差异无显着性（P>0.05）;D组与C组相比,系膜细胞上清液中IV型胶原浓度降低,差异有显着性意义（P<0.05）。第四部分:实验第6周末DF组和DC组大鼠血糖无差异,但均高于NC组（P<0.01）;DC组大鼠肾小球嗜PAS阳性物轻度增多,固有细胞数目增多,血清中TC、TG、Ccr、UAER、肾脏/体重比值以及免疫组化结果显示组织中megsin、IV型胶原和层黏连蛋白水平高于NC组,DF组上述指标低于DC组,但高于NC组,三组间差异有显着性意义（P<0.05）。结论:1.临床和实验研究表明,糖尿病状态下megsin在肾小球表达增强,与肾小球系膜增殖、细胞外基质积聚相一致,提示megsin在糖尿病肾病发生机制中起一定作用。2.体内和体外实验证实,过表达megsin可上调肾组织或系膜细胞TIMP-2、P27的表达,下调MMP-2的表达,提示megsin促发糖尿病肾病发生的机制与MMP-2/TIMPs和P27有关,但具体作用途径有待进一步研究阐明。3. megsin siRNA质粒和HMG-CoA还原酶抑制剂可分别从基因水平和蛋白水平下调megsin的表达,进而下调TIMP-2和P27、上调MMP-2在肾组织中的表达来延缓系膜增殖、细胞外基质积聚病理过程,为人类糖尿病肾病的防治提供了新思路。

沈文清,梁波,傅君舟^[9]（2008）在《细胞外基质与肾纤维化》文中研究表明

杨益宁^[10]（2006）在《糖基化终产物对人肾系膜细胞胞外基质和MMP-2表达的影响及氨基胍干预》文中研究表明目的:观察糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）对人肾系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC）合成和分泌Ⅳ型胶原及层粘连蛋白（laminin,LN）的影响以及药物盐酸氨基胍（aminoguanidine,AG）的干预作用;观察AGEs对HRMC基质金属蛋白酶-2（matrix metallo proteinase-2,MMP-2）表达的影响以及AG的干预效应。方法:1、运用体外制备的糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA）干预HRMC,以及氨基胍单独或与AGE-BSA共同干预HRMC;2、放射免疫分析法检测HRMC上清液中Ⅳ型胶原、LN含量;3、逆转录聚合酶链式反应检测MMP-2 mRNA表达,蛋白免疫印迹检测MMP-2蛋白表达。结果:1、AGE-BSA呈浓度、时间依赖性增加HRMC上清中Ⅳ型胶原和LN的含量（P<0.05）;2、盐酸氨基胍可减低HRMC上清中由AGE-BSA升高的Ⅳ型胶原、LN含量（P<0.05）;3、HRMC的MMP-2 mRNA和蛋白表达水平随着AGE-BSA浓度增加和干预时间延长而降低（P<0.05）;4、盐酸氨基胍与AGE-BSA共同干预HRMC,可部分恢复MMP-2 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）。结论:1、AGE-BSA诱导HRMC合成和分泌Ⅳ型胶原、LN增加,提示AGEs可能引起胞外基质不恰当积聚;2、AGE-BSA降低HRMC的MMP-2表达,提示AGEs可能通过MMP-2参与糖尿病肾病的发生发展;3、盐酸氨基胍可以下调由AGE-BSA诱导的Ⅳ型胶原、LN合成分泌增加,可抑制由AGE-BSA诱导的HRMC MMP-2表达减低,提示盐酸氨基胍可能通过干预AGE-BSA与细胞的相互作用,降低AGE-BSA的生物学效应,影响胞外基质和MMP-2水平,从而发挥肾保护效应。

二、糖尿病肾病患者血清层粘连蛋白及Ⅳ型胶原测定的意义（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、糖尿病肾病患者血清层粘连蛋白及Ⅳ型胶原测定的意义（论文提纲范文）

（1）血透明质酸在CKD进展中的价值及相关性分析（论文提纲范文）

（2）降糖保肾Ⅱ号方干预Ⅲ-Ⅳ期糖尿病肾病患者尿液Fn和Col-Ⅳ改变的疗效评价（论文提纲范文）

（3）通塞脉片对实验性糖尿病足模型的作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）早期2型糖尿病肾病预测因素及辨证分型与客观指标的相关性研究（论文提纲范文）

（5）血清TGF β1,Ⅳ型胶原,层粘连蛋白与糖尿病肾病的关系（论文提纲范文）

（6）Megsin对糖尿病小鼠肾组织ERK及ECM作用的影响（论文提纲范文）

（7）Megsin基因对高糖环境下小鼠肾脏系膜细胞EMMPRIN、MMP-2表达的影响（论文提纲范文）

（8）Megsin在糖尿病肾病发病机制中的作用（论文提纲范文）

（9）细胞外基质与肾纤维化（论文提纲范文）

（10）糖基化终产物对人肾系膜细胞胞外基质和MMP-2表达的影响及氨基胍干预（论文提纲范文）

四、糖尿病肾病患者血清层粘连蛋白及Ⅳ型胶原测定的意义（论文参考文献）

• [1]血透明质酸在CKD进展中的价值及相关性分析[D]. 魏亚静. 河北医科大学, 2018(01)
• [2]降糖保肾Ⅱ号方干预Ⅲ-Ⅳ期糖尿病肾病患者尿液Fn和Col-Ⅳ改变的疗效评价[D]. 冯如流. 浙江中医药大学, 2016(03)
• [3]通塞脉片对实验性糖尿病足模型的作用及机制研究[D]. 郭静. 南京中医药大学, 2014(05)
• [4]早期2型糖尿病肾病预测因素及辨证分型与客观指标的相关性研究[D]. 戴军有. 北京中医药大学, 2014(04)
• [5]血清TGF β1,Ⅳ型胶原,层粘连蛋白与糖尿病肾病的关系[J]. 杜正驰,赵妍. 黑龙江医药, 2013(03)
• [6]Megsin对糖尿病小鼠肾组织ERK及ECM作用的影响[D]. 王保兴. 河北医科大学, 2011(10)
• [7]Megsin基因对高糖环境下小鼠肾脏系膜细胞EMMPRIN、MMP-2表达的影响[D]. 郭莉. 河北医科大学, 2010(04)
• [8]Megsin在糖尿病肾病发病机制中的作用[D]. 刘茂东. 河北医科大学, 2009(10)
• [9]细胞外基质与肾纤维化[J]. 沈文清,梁波,傅君舟. 临床医学, 2008(11)
• [10]糖基化终产物对人肾系膜细胞胞外基质和MMP-2表达的影响及氨基胍干预[D]. 杨益宁. 东南大学, 2006(04)

标签：糖尿病论文;  显著性差异论文;  显著性水平论文;  血清蛋白论文;  质粒载体论文;