一、大鼠脊髓损伤后NGF及其受体TrkA在运动神经元及神经胶质细胞表达的变化（论文文献综述）
刘矿嫔[1]（2020）在《IncRNA-Malat1及相关转录因子参与调控背根节卫星胶质细胞转分化的作用及机制研究》文中研究说明[目 的]有研究表明,外周神经系统的背根神经节（Dorsal root ganglion,DRG）中存在神经发生的现象,这种现象与感觉神经元周围一类特殊的胶质细胞-卫星胶质细胞（Satellite glial cells,SGCs）有关。前期研究发现SGCs具有可塑性,具有多向分化潜能,条件具备时可转分化为神经元。通过高通量测序筛选的lncRNA表达谱,通过lncRNA Database功能注释结合GO和KEGG富集分析,初步预测lncRNA-Malatl参与调控SGCs的转分化过程,且与proBDNF负调控信息有关。因此本研究探讨lncRNA-Malatl及相关转录因子在调控背根节内卫星胶质细胞的转分化过程中的作用及可能机制。[方法]通过前期高通量测序分析及Q-PCR验证确定与本研究相关的lncRNA后,本研究继续进行DRG-SGCs的培养,通过从新生小鼠中提取背根神经节组织,并继续培养至原代卫星胶质细胞从组织中迁出,然后将所培养的SGCs分为正常组和Anti-proBDNF干预组（干预剂量4ug/ml）,在这6个时间点（24h、3d、7d、14d、21d、28d）收集SGCs进行如下实验:Q-PCR、Elisa、细胞免疫荧光、体外lncRNA-Malatl过表达及干扰实验。[结果]1.背根神经节卫星胶质细胞（原代）培养成功。2.通过Anti-proBDNF血清对卫星胶质细胞以及大鼠单侧坐骨神经损伤模型进行干预,Q-PCR验证前期相关靶基因并预测相关转录因子,与测序情况一致。3.通过Elisa试剂盒发现SGCs能够自分泌malat1、proBDNF/BDNF及其受体,并在转分化过程中表达水平发生变化,SGCs中malat1的表达可能影响胶质细胞表型变化,在SGCs转分化过程中malat1表达受到内源性anti-proBDNF分泌影响。4.构建转染实验载体,分别为过表达载体与干扰载体进行预实验,预实验说明试剂盒内的提供的慢病毒滴度与剂量可用于作为实验中的最适值。正式转染实验结果与预实验一致。5.免疫荧光结果鉴定,发现过表达及过表达后通过anti-proBDNF的干预,可以在一定程度上逆转malat1对于细胞促凋亡的作用,使细胞数量在一定程度上恢复;而干扰malat1后,低表达的malat1可能与anti-proBDNF协同调控细胞转分化。6.Q-PCR验证结果显示转染实验前后BDNF信号通路相关因子及其受体及转录因子 AKT1、NKX2.2、CTNNB1、FZD6 存在差异表达。[结论]1.经过lncRNA表达谱分析及生物信息学分析筛选出LncRNA-malat1及其相关的转录因子可能与SGC转分化过程有关,并且可能通过BDNF信号通路发挥作用。2.在正常的背根神经节组织和卫星胶质细胞中存在malat1、BDNF/proBDNF及其受体TrkB/p75NTR,它们的表达水平受到内源性抗proBDNF影响。3.敲低/过表达malat1可能通受到proBNDF/P75NTR和BDNF/TrkB信号调控来影响背根节卫星胶质细胞转分化。
吕桃桃[2]（2020）在《利用RNA-Seq技术探究三法三穴对坐骨神经损伤大鼠的修复机制》文中指出[目的]通过行为学探究三法三穴对坐骨神经损伤（sciatic nerve injury,SNI）大鼠恢复的疗效,基于形态学观察三法三穴对SNI大鼠超微结构的影响,利用RNA-Seq技术探究三法三穴对SNI大鼠的神经传导通路关键部位即神经损伤点、背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）、脊髓背角、脊髓腹角和腓肠肌的基因表达情况,从转录组水平阐明推拿对周围神经损伤的恢复机制。[方法]将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和三法三穴组。假手术组暴露大鼠右侧坐骨神经,不做夹持。模型组通过建立右侧坐骨神经钳夹损伤模型,造成大鼠坐骨神经挤压损伤。造模7 d后,每日利用“按摩推拿手法模拟仪”（专利号:ZL 2007 1 0187403.1）对三法三穴组大鼠术侧殷门穴、承山穴、阳陵泉穴依次定量施以点法、拨法、揉法刺激1次,每法、每穴刺激1 min,每只大鼠干预9 min/d（1 min/穴/法×3法×3穴）。治疗10次休息1 d,共治疗20次。具体方法如下:1.行为学通过坐骨神经功能指数（sciatic functionalindex,SFI）评价大鼠后肢精细运动情况;斜板试验评价大鼠后肢肌力变化;累积疼痛评分评价大鼠的痛觉功能改变。探究三法三穴干预对SNI大鼠的感觉与运动功能的影响,阐明推拿促进周围神经损伤恢复的疗效。2.采用透射电镜观察大鼠神经损伤点、脊髓腹角、腓肠肌的超微结构,为三法三穴促进SNI大鼠功能恢复提供形态学依据。3.利用RNA-Seq技术检测三法三穴对SNI大鼠神经传导通路关键部位即神经损伤点、DRG、脊髓背角、脊髓腹角和腓肠肌的基因表达影响,并进行GO功能和KEGG通路等生物信息学分析,阐明推拿促进损伤神经修复的分子机制。4.从初级神经元DRG的测序结果中筛选出参与神经元突触调节、感觉神经元调节的关键差异表达基因Pdzd2、Camk2a、Mdk、C1q13、Klf7,并利用Real Time-PCR进行验证,进一步阐明推拿对周围神经损伤后疼痛功能障碍的调控机制。[结果]1.行为学结果1.1 SFI结果与基线比较,干预0次（术后7 d）模型组和三法三穴组大鼠的SFI数值明显降低;与模型组比较,干预10次后三法三穴组大鼠SFI数值升高（P<0.05）;与模型组比较,干预15次、20次后三法三穴组SFI数值显着升高（P<0.01）。1.2 斜板试验结果与假手术组比较,干预0次（术后7 d）、5次模型组和三法三穴组斜板角度显着降低（P<0.01）,模型组和三法三穴组间无统计学差异。与模型组比较,干预10次三法三穴组斜板角度开始升高（P<0.05）。与模型组比较,干预15次、20次三法三穴组斜板角度明显增加（P<0.01）,但与假手术组相比仍有显着性差异（P<0.01）。1.3 累积疼痛评分结果基线期各组大鼠累计疼痛评分一致且均为0。推拿干预0次,模型组和三法三穴组大鼠累积疼痛评分较假手术组升高（P<0.05）;干预10次和20次后,三法三穴组大鼠累积疼痛评分较模型组明显改善（P<0.05）,但与假手术组相比仍有一定差距（P<0.05）。2.透射电镜结果2.1 神经损伤点电镜结果假手术组髓鞘结构完整,排列整齐且无萎缩;与假手术组相比,模型组髓鞘完整性破坏,崩脱严重甚至形成髓鞘球,伴轴索萎缩及线粒体变性;三法三穴干预可改善神经损伤点超微结构,三法三穴组神经纤维髓鞘保留较完整,轴索无明显肿胀或萎缩,但无空泡状线粒体。2.2 脊髓腹角电镜结果假手术组脊髓腹角神经元超微结构基本正常;与假手术组相比,模型组脊髓腹角运动神经元受损严重,核仁、染色质、线粒体固缩,核膜凹凸不平;与模型组相比,三法三穴组脊髓腹角神经元受损减轻,染色质深染明显减轻,核膜较光滑、完整,线粒体等细胞器较完整,无明显固缩及肿胀。2.3 腓肠肌电镜结果假手术组肌球蛋白丝排列整齐,A带、I带、Z线、M线等典型结构明显;与假手术组相比,模型组肌丝排列紊乱及A带、I带、Z线、M线消失,肌束萎缩严重,卫星细胞坏死、凋亡,线粒体失活;三法三穴组肌丝排列有序,可清晰观察到Z线、M线,卫星细胞坏死数量明显减少,线粒体结构相对完整。3.RNA-Seq 结果将OD260/280值介于1.8-2.2,RIN评分>8的样本建库并测序。测序结果如下:3.1 神经损伤点测序结果模型组与三法三穴组的221个差异表达基因的GO功能富集在多细胞组织过程的调控、病毒防御反应、对外界刺激的反应、免疫系统过程、对生物刺激的反应、防御反应等;KEGG通路分析显示与信号转导通路、免疫系统通路、内分泌系统通路、细胞增长和凋亡通路相关。GO功能富集在横纹肌细胞分化的调控、肌肉细胞分化的调控、成肌细胞分化的调控、肌管分化的调控、横纹肌收缩、肌肉器官发育、收缩纤维部分等,与肌细胞调控相关的生物学过程。3.2 DRG测序结果三组差异表达基因共计369个;差异表达GO功能包括生物调节过程、对刺激的反应、生物过程的积极调节、参与化学突触传递的突触前过程、运动、生长、分子传感器活性等;KEGG通路富集在Wnt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路等。3.3 脊髓背角测序结果三法三穴组与模型组比较有61个差异表达基因;差异基因的GO功能富集在信号调节、突触部分、信号转导调控、细胞分化调控等;KEGG通路富集在MAPK信号通路、VEGF信号通路、AMPK信号通路等。3.4 脊髓腹角测序结果三组差异表达基因共217个;差异表达基因的GO功能与细胞过程、对刺激的反应、免疫系统过程、生物过程的负调节等相关;KEGG通路分析与免疫系统、癌症、信号转导等通路密切相关。3.5 腓肠肌测序结果三组差异表达基因的GO功能包括细胞过程单有机体过程、代谢过程、生物调控、对刺激的反应、多细胞组织过程、生物过程的正向调节等;KEGG通路富集在细胞因子-细胞因子-受体相互作用、AMPK信号通路等。4.Real Time-PCR 结果与假手术组比较,模型组DRG中差异表达基因Pdzd2、Camk2a、Mdk、Clq13、Klf7的基因表达量增加,三法三穴干预可使损伤大鼠DRG中这些基因表达降低,表达趋势与RNA-Seq获得的结果一致。[结论]1.推拿可以促进SNI大鼠的精细运动、后肢肌力及疼痛功能的恢复,改善周围神经损伤后的感觉和运动功能障碍。2.推拿可保护SNI大鼠髓鞘完整性、恢复脊髓腹角运动神经元结构以及重建腓肠肌肌丝结构,发挥对损伤神经的形态学恢复作用。3.推拿促进SNI大鼠恢复,是通过调控大鼠神经损伤点、DRG、脊髓背角、脊髓腹角和腓肠肌的基因表达实现的,其过程可涉及多个生物学过程及信号通路。4.推拿对神经损伤大鼠的修复,可能是通过降低DRG中的Pdzd2、Camk2a、Mdk、Clq13、Klf7等基因表达,促进SNI大鼠的轴突再生、感觉和运动功能的恢复。这些基因可能成为推拿促进周围神经损伤修复的重要治疗靶点。
莫岩君[3]（2020）在《三法三穴对坐骨神经损伤大鼠痛觉和脊髓背角CX3CL1/CX3CR1及CCL2的影响》文中指出目的通过观察坐骨神经夹持损伤模型大鼠（SNI）的脊髓背角上与疼痛相关趋化因子CX3CL1及其受体CX3CR1的蛋白和mRNA以及CCL2的mRNA表达变化,探讨“三法三穴”对坐骨神经损伤大鼠痛觉功能改善的作用机制是否通过与神经损伤痛觉障碍相关趋化因子发挥调节作用。方法74只雄性Sprague-Dawley大鼠,按随机数字表法将大鼠划分为正常组（n=12）、假手术组（n=24）、模型组（n=25）和三法三穴组（n=13）。模型组和三法三穴组采用坐骨神经夹持损伤方法制备实验大鼠模型,假手术组仅暴露坐骨神经。三法三穴组于造模后第7天起用按摩推拿手法模拟仪模拟点法、拨法、揉法三手法对殷门、阳陵泉、承山三个神经-肌肉相关穴位进行干预;正常组、假手术组和模型组采用抓握束缚干预。于造模后7天和干预20天对正常组、假手术组、模型组和三法三穴组进行光热耐痛阈测定;于造模后7天、干预10天和干预20天对假手术组、模型组、三法三穴组进行累积疼痛评分测定。于造模后7天和干预20天进行脊髓背角组织新鲜取材,对脊髓背角CX3CL1及其受体CX3CR1的蛋白和mRNA表达分别进行Western blotting、RT-PCR检测,对CCL2的mRNA进行RT-PCR检测;于干预20天后对模型组和三法三穴组进行多聚甲醛溶液灌注固定取材,对脊髓背角小胶质细胞免疫荧光观察。结果1.三法三穴可以改善SNI大鼠的痛觉功能1.1光热耐痛阈造模后7天,假手术组和模型组与正常组比较有显着差异（P<0.05）,且假手术组和模型组高于正常组,模型组与假手术组比较也有显着差异（P<0.05）,且模型组高于假手术组;干预20天后,模型组比正常组和假手术组高,且有统计学差异（P<0.05）,三法三穴组高于正常组,但低于模型组,有统计学差异（P<0.05）。1.2累积疼痛评分造模后7天,模型组高于假手术组,有显着差异（P<0.05）;干预10天后,模型组评分高于假手术组,有显着差异（P<0.05）,三法三穴组评分高于假手术组,有统计学差异（P<0.05）,但低于模型组,有显着差异（P<0.05）;干预20天,模型组评分高于假手术组,且有显着差异（P<0.05）,三法三穴组评分高于假手术组,有显着差异,但低于模型组,有显着差异（P<0.05）。从三个时间点横向来看,模型组呈逐渐上升趋势,三法三穴组呈下降趋势。2.三法三穴对SNI大鼠脊髓背角CX3CL1/CX3CR1、CCL2的表达影响脊髓背角CX3CL1及其受体CX3CR1蛋白和mRNA、CCL2的mRNA的检测结果:2.1 Western blotting造模后7天,各组间CX3CR1蛋白表达没有显着差异（P>0.05）;干预20天后,模型组较7天时有明显的上升趋势,但各组间无显着性差异,无统计学意义（P>0.05）,三法三穴组低于模型组且接近于正常组和假手术组,但统计学上无显着差异。造模后7天,各组CX3CL1蛋白的表达没有显着差异（P>0.05）;干预20天后,假手术组蛋白表达量有下降趋势,模型组有上升趋势,但各组间没有显着性差异（P>0.05）,无统计学意义。2.2 RT—PCR造模后7天,与模型组相比,假手术组CX3CR1的mRNA表达高于模型组,但无显着差异（P>0.05）;干预20天后,三法三穴组和模型组mRNA表达相比有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。造模后7天,与模型组相比,假手术组CX3CL1的mRNA表达高于模型组,但无显着差异（P>0.05）;干预20天后,三法三穴组和模型组mRNA表达相比有下降趋势,但无统计学差异（P>0.05）。造模后7天,模型组的CCL2的mRNA的表达高于假手术组,无统计学意义（P>0.05）;干预20天后,模型组CCL2的mRNA高于假手术组,三法三穴组低于模型组和假手术组,差异有统计学意义（P<0.05）。3.脊髓背角小胶质细胞形态观察在荧光显微镜下将患侧脊髓背角放大400倍观察,干预20天的三法三穴组脊髓背角小胶质细胞呈未活化或部分活化,有高分枝状和杆状,胞体较小,突起较长。干预20天的模型组脊髓背角小胶质细胞突起较三法三穴组短,呈完全或部分活化状态,部分胞体增大。结论三法三穴对坐骨神经损伤大鼠痛觉功能有改善作用,但与趋化因子CX3CL1/CX3CR1表达无关,而可能和CCL2有关。三法三穴可以影响脊髓背角的小胶质细胞活化状态。
孙磊[4]（2019）在《HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中研究指明第一部分HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤是脊柱骨折脱位的严重并发症,常导致损伤节段以远感觉、运动及其他躯体功能严重障碍,不仅给患者的身心造成巨大的影响,还会对其家庭及社会带来沉重的负担。目前,临床上还没有找到一种令人满意的方法来治疗或治愈此疾病。间充质干细胞（MSCs）属于多能干细胞,具有自我复制及多向分化潜能。MSCs能分泌多种神经营养因子和细胞因子,具有免疫调节,抗细胞凋亡和抗炎作用,能够促进神经细胞的存活及再生。神经干细胞（NSCs）是能够自我复制及具有多种神经细胞分化潜能的干细胞,能够促进脊髓损伤后受损的神经通路的修复重建。但由于受到损伤脊髓局部炎性环境的影响,移植的NSCs存活率较低。有研究表明,MSCs可以调节NSCs生长的微环境,提高其存活率。此外,许多研究指出,MSCs可以减少与干细胞移植相关的肿瘤形成。我们应用hUC-MSCs与hNSCs联合移植治疗大鼠脊髓损伤,经查阅国内外文献,未见有报道。本研究旨在找寻治疗脊髓损伤更为有效的方法及探索其内在机制,为将来hUC-MSCs与hNSCs的临床应用垫定基础。研究目的（1）研究hUC-MSCs与hNSCs联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用。（2）研究hUC-MSCs与hNSCs单独移植修复大鼠脊髓损伤的作用及对二者进行比较研究。（3）通过免疫组化、免疫荧光、Elisa实验、LFB-CV染色等方法来研究探索hUC-MSCs与hNSCs移植修复大鼠脊髓损伤的作用机制。研究方法（1）HUC-MSCs的分离、培养及鉴定新鲜脐带于孕38～40周的健康产妇剖宫产术中获取。我们应用组织块贴壁法培养hUC-MSCs。将自脐带分离的华通胶切成细小碎块后,转入细胞培养瓶中,在添加有相应添加剂的DMEM完全培养基中培养。在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养7～10天后,吸除组织块,重铺贴壁细胞,每3天换液1次。细胞经传代后,收集第3～5代细胞用于移植实验。以流式细胞仪鉴定细胞表面特异标志物;细胞经成骨成脂诱导分化后,应用茜素红S染色及油红0染色鉴定其分化能力。（2）HNSCs的分离、培养及鉴定我们采用常规人工流产的8～10周龄胚胎来获取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在5%CO2的培养箱中37℃下培养。每周2次换液,7～10天便可形成神经球。细胞经传代后,获取第3～5代NSCs备移植用。同时应用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞特异性标志物;细胞经诱导分化后,以抗β-tubulinⅢ与抗GFAP抗体通过免疫荧光鉴定其分化能力。（3）实验分组、脊髓损伤模型制作及细胞移植本研究采用NYU撞击器对成年雌性Wistar大鼠建立中度脊髓挫伤模型。造模后第二天BBB评分≤2的大鼠被选用。本实验共选取了 108只脊髓损伤大鼠进行研究,随机分为以下五组:1)hUC-MSCs组;2)hNSCs组;3)hUC-MSCs+hNSCs组;4)PBS组（对照组）;5)Sham组（假手术组）。我们在大鼠脊髓损伤1周后于T10节段行干细胞髓内注射移植治疗。（4）指标检测在大鼠SCI之前和之后1天用BBB评分法对所有动物进行评估,然后每周一次直至实验结束。细胞移植后2周,处死部分大鼠并提取脊髓组织,行冰冻切片,进行免疫荧光和免疫组织化学检测,观察及评估移植干细胞的存活、分化及受损脊髓BDNF的表达。细胞移植后2周处死部分大鼠,提取新鲜脊髓组织行脊髓匀浆,以夹心ELISA法检测BDNF的表达。在大鼠SCI造模后第8周,将实验动物处死并提取脊髓组织,行石蜡切片,进行Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,检测脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的数量。研究结果（1）细胞培养及鉴定我们以组织块贴壁培养方法从脐带华通胶基质中成功分离培养出hUC-MSCs。获取的第三代细胞经流式细胞仪检测其表面标志物,结果为高表达CD44,CD90,CD105,而CD34和CD45则表达阴性。经成骨与成脂培养基诱导分化后,茜素红S染色及油红0染色均为阳性结果,表明其具有成骨及成脂分化能力。我们通过从常规人工流产的胚胎前脑组织中成功分离和培养出hNSCs。其细胞标志物Nestin和SOX2免疫荧光染色阳性。经诱导分化后,免疫荧光结果显示β-tubulinⅢ与GFAP抗体染色阳性,证实其具有分化为神经元及星形胶质细胞的能力。（2）BBB评分结果自大鼠SCI后第2周至实验结束,hUC-MSCs+hNSCs组BBB评分明显高于其他3个治疗组,结果存在显着统计学差异。自大鼠SCI后4周开始,hNSCs组评分高于PBS组,其差异具有统计学意义（P<0.05）,并持续至试验结束。在大鼠SCI后第5周,hUC-MSCs组的BBB评分迅速增加,与PBS组相比有显着差异,并且这种趋势一直持续到第8周（P<0.01）。在整个实验过程中,hUC-MSCs组大鼠的BBB评分与hNSCs组相比,差异无统计学意义。（3）干细胞的存活与分化关于细胞移植后2周所移植干细胞存活的计数,hUC-MSCs+hNSCs组明显高于hNSCs组（P<0.05）和hUC-MSCs组（P<0.01）。在PBS组（阴性对照组）中未发现有HuNu 阳性细胞。hUC-MSCs组与hNSCs组相比,差异无统计学意义。在 hUC-MSCs 组中,未观察到 HuNu-GFAP、HuNu-β-tubulinⅢ 或 HuNu-CNP抗体双标阳性的细胞,说明所移植存活的干细胞未向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化。而在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中均可观察到上述双标阳性细胞,表明此2组中所移植的干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。根据免疫荧光图像,我们还可以观察到存活的hUC-MSCs分布比较集中,大部分位于注射移植点附近,与宿主组织未能很好的整合;但在hNSCs组和hUC-MSCs+hNSCs组中,所移植干细胞比较分散,游走距离较远,与宿主组织整合较好。（4）BDNF免疫组化及ELISA检测结果干细胞移植2周后受损脊髓组织BDNF免疫组化表达结果为:三个干细胞移植组较PBS组明显增高,其差异具有统计学意义（PBS组vs hUC-MSCs+hNSCs组,P<0.01;PBS组vs hUC-MSCs组与hNSCs组,P<0.05）。但在三个干细胞移植组两两之间,差异无统计学意义。脊髓组织匀浆的BDNF表达ELISA检测结果与免疫组织化学结果一致。（5）脊髓损伤部位髓鞘及脊髓前角运动神经元的检测结果在大鼠SCI后第8周,我们行脊髓横切面Luxol Fast Blue-Cresyl Violet染色,结果显示4个脊髓损伤组的脊髓横切面可见大量坏死细胞碎片,轴突退变和空洞。各组髓鞘染色的IOD值,三个干细胞移植组均较PBS组高,差异具有统计学意义（PBS 组 vs hUC-MSCs+hNSCs 组,P<0.01;PBS 组 vs hUC-MSCs 组与hNSCs 组,P<0.05）。hUC-MSCs+hNSCs 组髓鞘染色 IOD 值最高（hUC-MSCs+hNSCs组 vs UC-MSCs 组,P<0.01,hUC-MSCs+hNSCs 组 vs hNSCs 组,P<0.05）。三个干细胞移植组脊髓灰质前角中运动神经元的数量显着高于PBS组（hUC-MSCs+hNSCs 组与 hUC-MSCs 组 vs PBS 组,P<0.01;hNSCs 组 vs PBS组,P<0.05）。三个干细胞移植组与假手术组相比,其脊髓前角运动神经元数量均明显减少（P<0.01）,但此三组两两之间无统计学差异。研究结论（1）本研究表明,hNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs在大鼠脊髓损伤亚急性期局部髓内移植均能够促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,且联合移植组效果更佳。（2）联合移植hNSCs和hUC-MSCs可以促进所移植干细胞的存活。（3）HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs三种细胞移植方法均能促进脊髓损伤瘢痕周围BDNF的分泌。（4）HUC-MSCs单独移植后于体内未分化为神经谱系细胞,hNSCs则在移植后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。（5）HNSCs,hUC-MSCs或hNSCs+hUC-MSCs移植均能够增加受损脊髓髓鞘的数量及脊髓前角运动神经元的数量。联合移植对增加髓鞘数量的作用效果最显着。第二部分HNSCs联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究研究背景脊髓损伤（SCI）是指由于脊髓组织受到各种损伤因素的破坏,导致躯体神经功能发生暂时或永久性的改变。脊髓一旦严重损伤,修复将十分困难。关于脊髓损伤的治疗主要集中在两个方面,神经保护与神经再生。神经保护能够防止或减缓神经损伤后继发性损害,而神经再生则旨在恢复中断的神经通路,恢复神经功能。目前,干细胞移植是脊髓损伤治疗的研究热点。由于干细胞可以分化成脊髓损伤后所缺失的多种类型的细胞,而且还能够分泌多种营养因子,调节损伤局部炎性反应,干细胞移植成为将来修复受损脊髓缺失组织和促进神经保护和神经再生十分有前景的方法。而NSCs,作为神经再生的种子细胞,更具有其独特的优势。脊髓损伤破坏了大脑和身体之间的通信,导致大脑失去了对完整躯体神经肌肉系统的控制。目前研究者已经开发了许多神经假体,以通过中枢和外周神经系统的功能性电刺激（FES）来恢复部分躯体功能,并能够加强肌肉强度及减轻其萎缩。研究发现,电刺激的作用并非局限于此,受损脊髓部位局部的电刺激,还具有改善局部血液循环,抵消局部内生电流,维持细胞膜的稳定性,激活内源性神经再生等功能。由于脊髓损伤的病理生理过程复杂,靠单一的治疗方式,很难有满意的疗效。而联合多种方法治疗,是目前修复脊髓损伤的一个趋势。我们已有前期研究证实,MSCs联合电刺激治疗脊髓损伤比单独行细胞移植或电刺激效果更好。关于hNSCs联合电刺激治疗脊髓损伤,目前国内外还未有研究报道,我们进行此项研究,旨在寻求更好的治疗脊髓损伤的方法及探索其作用机制,为将来治疗甚至治愈脊髓损伤垫定基础。研究目的（1）研究hNSCs移植联合电刺激对大鼠脊髓损伤的治疗作用。（2）探索hNSCs移植、电刺激分别对大鼠脊髓损伤的治疗作用及对二者进行比较研究。（3）通过免疫组化、免疫荧光、组织western blot等方法探索hNSCs及电刺激对脊髓损伤修复的病理生理机制。（4）探索电刺激对所移植的hNSCs在损伤脊髓局部存活、向神经元分化等生物学行为的影响。研究方法（1）hNSCs的分离、培养我们选择常规人工流产的8-10周龄胚胎来提取前脑组织。通过机械分离法提取细胞,加入到NSCs无血清培养基中,在含5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养。每周2次换液。7-10天便可形成神经球,细胞经传代后,获取第3-5代NSCs备用。（2）动物分组、脊髓损伤动物模型制作、细胞移植及电刺激我们于大鼠胸10水平以NYU脊髓打击器建立大鼠SCI模型。选取SCI造模成功的成年雌性Wistar大鼠共100只。随机分为4组,分别为hNSCs组,ES组,hNSCs+ES组及PBS组（对照组）,每组25只大鼠。在SCI模型建成1周后行刺激电极安装固定手术及hNSCs移植手术。自安装刺激电极后第二天开始,电刺激组给予电刺激干预,每日2次,直至造模后第10周实验结束。（3）指标检测在大鼠SCI之前和之后1天及之后每周进行后肢运动功能BBB评分至第10周实验结束。实验结束时处死大鼠并提取脊髓组织。行脊髓组织切片,进行免疫组化及免疫荧光检测,观察hNSCs的存活、分化情况;观察NF-H、GFAP的表达情况;HE染色观察局部空洞形成情况;脊髓组织匀浆后行Western blot检测,观察受损脊髓组织内NF-H,NGF蛋白表达情况。研究结果（1）BBB评分本实验结束时,各组大鼠后肢功能BBB评分由高到低排列分别为:hNSCs+ES组,ES组,hNSCs组,PBS组;各组间表达差异均具有显着统计学意义（p<0.01）。（2）免疫荧光hNSCs的存活及向神经元分化的检测所移植hNSCs的存活检测结果为:hNSCs+ES组存活数量大于hNSCs组,差异具有统计学意义（p<0.05）。所移植存活的细胞分化为神经元的数量,hNSCs+ES组大于hNSCs组,差异有统计学意义（p<0.05）。（3）NF-H免疫荧光表达结果HNSCs组、ES组及hNSCs+ES组脊髓损伤部位瘢痕组织周围NF-H的表达较PBS组均增高,差异具有统计学意义（PBS组vs hNSCs组,P<0.05;PBS组vs ES组及hNSCs+ES组,P<0.01）。三个治疗组NF-H表达由高到低为hNSCs+ES组、ES组及hNSCs,三组两两之间表达差异亦具有统计学意义（hNSCs+ES组vs ES组,p<0.05;hNSCs+ES 组 vs hNSCs 组,p<0.01;ES 组 vs hNSCs 组,P<0.01）。（4）免疫组化检测GFAP在脊髓损伤部位胶质瘢痕中的表达脊髓损伤部位胶质瘢痕组织GFAP表达,三个治疗组与对照组（PBS组）相比,GFAP表达降低,差异具有统计学意义（PBS组vs hNSCs组及hNSCs+ES组,P<0.01;PBS组vs ES组,p<0.05）。其中,hNSCs+ES组表达最低,与其余三组相比差异具有统计学意义（hNSCs+ES组vs hNSCs组,p<0.05;hNSCs+ES组vs ES及 PBS 组,p<0.01）。（5）脊髓损伤部位坏死空洞区域HE染色HE染色检测脊髓损伤局部坏死空洞面积,hNSCs组及hNSCs+ES组小于PBS组,数据差异有统计学意义（hNSCs组vs PBS组,p<0.05;hNSCs+ES组vs PBS组,p<0.01）。ES组面积数值虽比PBS组小,但差异无统计学意义。（6）Western blot检测受损脊髓组织匀浆NF-H及NGF表达NF-H的检测结果,三个治疗组,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs组较对照组均明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）。hNSCs+ES组较ES及hNSCs组表达增高,差异具有统计学意义（P<0.01）。ES组较hNSCs组亦明显增高（P<0.01）。关于NGF的western blot检测,hNSCs+ES组、ES组及hNSCs三个治疗组较PBS组均明显增高,差异具有统计学意义（P<0.01）;但三个治疗组间差异没有统计学意义。研究结论（1）HNSCs移植及电刺激均能促进脊髓损伤大鼠后肢功能的恢复,以二者联合应用效果最好。（2）电刺激能促进hNSCs的存活,并能提高其分化为神经元的数量。（3）HNSCs移植及电刺激在体内能通过促进受损脊髓组织中NGF分泌、NF-H的表达,下调损伤局部GFAP的表达,抑制受损脊髓局部胶质瘢痕形成等机制,促进受损脊髓的修复。
任周梁[5]（2019）在《Gal-3在大鼠急性脊髓损伤炎症反应中的作用及调控机制研究》文中进行了进一步梳理目的:阐明半乳糖凝集素3（Gal-3）在大鼠急性脊髓损伤（SCI）炎症反应中的作用及调控机制。方法:第一部分:Gal-3在大鼠急性脊髓损伤模型中的表达及作用研究（体内实验）;（1）12只雄性SD大鼠随机分为对照组和SCI组（每组n=6）。Allen’s法打击脊髓造模,术后24h对大鼠进行眼眶静脉采血。分别于24h、48h和72h对各组大鼠进行BBB评分,然后被处死取损伤处脊髓组织进行含水量测定和苏木精-伊红（HE）染色,采用取血样进行酶联免疫吸附实验（ELISA）,检测p65、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA、SOD、CAT以及GSH-PX的表达水平。使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）测定Gal-3 mRNA的表达。（2）18只雄性SD大鼠随机分为对照组,SCI组和SCI+GB1107组（每组n=6）,重复上述实验过程。第二部分:Gal-3促进大鼠急性脊髓损伤炎症反应的可能机制研究（体内实验）;（1）12只雄性SD大鼠随机分为对照组和SCI组（每组n=6）,术后24h处死大鼠、脊髓组织取样用于基因芯片技术,筛选Gal-3在SCI模型中的调控靶点。（2）12只雄性SD大鼠建立脊髓损伤模型,随机分为阴性对照组和Gal-3干预组（每组n=6）,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测Gal-3、TXNIP和NLRP3蛋白的表达。（3）18只雄性SD大鼠随机分为对照组、SCI组和SCI+GB1107组,Western blot检测Gal-3、TXNIP和NLRP3蛋白的表达。第三部分:Gal-3通过ROS/TXNIP/NLRP3信号通路促进脊髓损伤后神经炎症反应的研究（体外实验）;（1）LPS诱导PC12细胞构建体外神经炎症模型,48h后收集PC12细胞,随机分为对照组、LPS组和LPS+si-Gal-3组,使用Western blot法检测Gal-3、硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）和NOD样受体家族蛋白3（NLRP3）的表达,ELISA法检测细胞中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-PX以及IL-1β的水平,免疫荧光染色显示Gal-3的表达。（2）确定活性氧自由基（ROS）抑制剂调控Gal-3对氧化应激的作用,随机分为对照组、LPS组、LPS+si-Gal-3转染组和LPS+si-Gal-3+H2O2组,LPS+ROS抑制剂以及LPS+ROS抑制剂+Gal-3组,ELISA法检测各组细胞中ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-PX以及IL-1β的表达水平,Western blot检测TXNIP和NLRP3蛋白的表达。（3）明确TXNIP/NLRP3在Gal-3促神经炎症中的作用:将PC12细胞随机分为6组,分别为对照组、LPS组、LPS+si-TXNIP组、LPS+si-TXNIP+Gal-3组、LPS+si-NLRP3组以及LPS+si-NLRP3+Gal-3组,ELISA法检测各组IL-β的表达水平,Western blot分别检测TXNIP和NLRP3蛋白的表达。结果:第一部分（1）SCI组各时间点的BBB评分明显低于对照组（P<0.05）,SCI+GB1107组各时间点的BBB评分明显高于SCI组（P<0.05）;（2）SCI组组织含水量明显高于对照组,SCI+GB1107组明显高于SCI组（P<0.05）;（3）对照组脊髓组织完整,细胞形态正常,胞核和胞质染色清晰,而SCI组打击部位出现组织坏死、细胞变性、水肿、结构紊乱,伴有不同程度的出血及中性粒细胞浸润为主要表现,SCI+GB1107组脊髓损伤情况明显缓解,组织坏死、细胞变性、水肿、出血及等情况均有改善;（4）与对照组相比,SCI组大鼠血清p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平明显增加,SOD,CAT、GSH-PX活性明显降低;与SCI组相比,SCI+GB1107组大鼠血清p65、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平明显降低,SOD,CAT、GSH-PX活性明显增加（P<0.05）;（5）与对照组相比,SCI组大鼠脊髓组织中Gal-3 mRNA表达水平明显增加;与SCI组相比,SCI+GB1107组大鼠脊髓组织中Gal-3 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。第二部分:（1）与对照组相比,SCI组中差异最大的有8个基因上调,7个基因下调;GO分析生物学过程共涉及8种。PPI分析差异表达基因总共23个节点,共有七种配对关系,信号通路主要集中在NLRP3和TXNIP蛋白。（2）与对照组相比,Gal-3干预组Gal-3、TXNIP以及NLPR3蛋白明显高于阴性对照组;与SCI组相比,SCI+GB1107组中Gal-3、TXNIP以及NLPR3蛋白表达明显降低（P<0.05）。第三部分:（1）与LPS组相比,LPS+si-Gal-3转染组IL-1β、MDA、ROS表达水平明显降低,SOD、CAT以及GSH-PX的水平明显升高（P<0.05）;（2）LPS+ROS抑制剂+Gal-3组表达水平明显高于LPS+ROS抑制剂组（P<0.05）;（3）Gal-3的过表达诱导TXNIP/NLRP3蛋白表达,并增加IL-1β水平。结论:体内SCI模型中,Gal-3表达上调,抑制Gal-3表达可减弱脊髓损伤后神经炎症反应。体外诱导PC12模型中,抑制Gal-3的表达可减弱损伤后神经炎症和ROS的产生;ROS可调控Gal-3对氧化应激的作用。总之,Gal-3通过激活ROS/TXNIP/NLRP3信号通路促进SCI后的神经炎症反应;Gal-3可能是SCI的一种潜在治疗策略。
李文媛[6]（2019）在《转录因子KLF7对脊髓损伤后脊髓下行固有束可塑性作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:脊髓损伤（SCI）致残给患者及其家庭带来极大痛苦和巨大的经济负担,因此寻找有效治疗SCI的策略,已成为当前亟待解决的社会问题。脊髓下行固有神经元（DPSN）在自发运动和随意运动的产生和调控中发挥重要的作用,SCI后皮质脊髓束（CST）可通过轴突发芽重新连接支配DPSN轴突,DPSN轴突可塑性改变能够促进其通过和跨越病变部位,使中枢指令通过DPSN轴突功能性介导,有效传递到病变部位以下的脊髓结构中,这提供了一个神经传导的替代途径即“功能性中继”的作用,促进脊髓功能的重建。目前DPSN轴突可塑性是脊髓损伤后功能重建的重要治疗靶点。核转录因子KLF7在神经系统中广泛存在,近年研究表明KLF7对中枢神经系统轴突再生、神经胶质细胞分化和髓鞘形成都发挥重要作用。敲除KLF7基因可导致中枢神经、视网膜和嗅觉神经损伤后轴突再生障碍,KLF7高表达能够促进脊髓损伤后CST轴突再生。本课题组前期研究发现:①AAV-KLF7病毒联合脱细胞神经支架桥接坐骨神经神经缺损,有效促进周围神经再生。②KLF7能够促进周围神经损伤后感觉和运动轴突再生、髓鞘形成和功能恢复。③KLF7转染施万细胞（SCs）后,促进SCs增殖。但KLF7对脊髓损伤后DPSN轴突可塑性作用及机制研究尚未见报道。本项目拟以DPSN轴突再生、突触生成、髓鞘形成及功能恢复等为切入点,探讨KLF7体外对脊髓神经元突起及脊髓背根节（DRG）神经元轴突再生的作用机制;阐明KLF7体内调控SCI损伤后DPSN轴突可塑性及功能重建的作用及其机制,为临床脊髓损伤治疗提供新的治疗策略和靶点。研究方法:一、体外实验:1、脊髓神经元分离培养,应用AAV-GFP病毒转染脊髓神经元,检测AAV病毒转染率。应用AAV-KLF7、AAV-NC腺相关病毒转染脊髓神经元,将实验细胞分为AAV-KLF7组、AAV-NC组、Control组;2、免疫荧光染色检测各组脊髓神经元KLF7表达及脊髓神经元突起形态特征;3、Westernblot和PCR检测各组脊髓神经元细胞KLF7及靶点NGF、TrkA蛋白和mRNA的表达;4、IncuCyte ZOOM实时分析AAV-KLF7对脊髓神经元突起生长的作用;5、DRG神经元培养,免疫荧光染色和Sholl分析检测AAV-KLF7及AAV-NC病毒转染的DRG神经元轴突再生情况。二、体内实验:1、应用路易斯维尔损伤系统仪器（LISA）制备小鼠脊髓T10节段Contusion损伤模型;2、Westernblot检测SCI术前及术后1d、lw、2w、3w、4w脊髓损伤灶KLF7表达动态变化;3、在小鼠脊髓T7-9节段间注射AAV-NC和AAV-KLF7,实验动物分为SCI+AAV-KLF7组、SCI+AAV-NC组、Sham组;4、Westernblot检测KLF7、NGF、TrkA、GAP43和P0蛋白表达;5、甲酚紫伊红染色、Luxol Fast Blue法及Neurolucida系统检测SCI后5w各组小鼠损伤灶面积、体积及髓鞘保留情况;6、荧光金（FG）逆行示踪DPSN结合免疫荧光标记AAV-KLF7转染DPSN,验证AAV-KLF7是否有效转染T7-9节段DPSN;7、T7-8节段生物素葡聚糖胺（BDA）注射顺向示踪DPSN轴突,免疫荧光染色检测损伤灶T10节段GFAP（标记星形胶质细胞）和BDA,检测KLF7对损伤灶DPSN轴突可塑性作用;8、霍乱毒素B（CTB）坐骨神经注射逆行示踪标记腰段运动神经元胞体和树突,BDA顺向示踪DPSN轴突,免疫荧光染色检测突触素（SYP）,激光共聚焦和免疫荧光三标检测L4-5节段DPSN轴突与运动神经元突触形成情况;9、电子显微镜检测损伤灶周围轴突髓鞘形成情况;10、免疫荧光染色标记T7-9节段KLF7和CC1（标记少突胶质细胞）、NG2（标记少突胶质前体细胞）、GFAP（标记星形胶质细胞）,明确KLF7在各细胞内表达。三、功能重建检测:1、患侧胫骨前肌（TA）湿重及Roots-Karnovsky染色计数运动终板密度;2、BMS评分检测;3、Grid walking检测;4、电生理检测;5、Hargreaves检测结果:1、免疫荧光染色检测AAV-GFP转染脊髓神经元的转染率为84.70±5.57%。与AAV-NC组比较,AAV-KLF7组KLF7蛋白表达显着增高（P<0.001）。同时发现AAV-KLF7组神经元突起平均长度较AAV-NC组显着增高（P<0.001）。2、Western blot和PCR检测结果表明:与AAV-NC组和Control组比较,AAV-KLF7组KLF7蛋白及其mRNA表达均显着增高（P<0.05）;而且AAV-KLF7组NGF、TrkA蛋白及其mRNA表达亦显着高于AAV-NC组和Control组（P<0.05）,但KLF7、NGF、TrkA蛋白和mRNA表达在AAV-NC组与Control组之间无显着差异（P>0.05）。3、IncuCyte ZOOM系统检测结果表明:相比于AAV-NC组,AAV-KLF7组神经元突起长度和突起分支数量在病毒转染后3d和4d均显着增加（P<0.05）。4、Sholl分析结果表明AAV-KLF7组DRG神经元轴突平均长度显着高于AAV-NC 组,AAV-KLF7 组在 0-60°、180-240°、240-300°及 300-360°角度 DRG 神经元轴突总长度亦显着高于AAV-NC组（P<0.001）。5、Western blot结果显示:脊髓胸段组织基线水平KLF7蛋白表达较低。SCI后1 d损伤灶中KLF7蛋白表达增高,KLF7表达峰值出现在SCI后1-2 w,在SCI后3-4w恢复到基线水平（P<0.00l）。6、Western blot检测结果显示:与Sham组和SCI+AAV-NC组损伤灶组织KLF7蛋白仅少量表达相比,SCI+AAV-KLF7组KLF7蛋白表达显着增加（P<0.001）。与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组损伤灶组织NGF、TrkA和GAP43蛋白表达增高,其中SCI+AAV-KLF7组NGF、TrkA和GAP43蛋白表达显着高于SCI+AAV-NC组（P<005）。与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组P0蛋白表达显着降低,其中SCI+AAV-KLF7组P0蛋白表达显着高于SCI+AAV-NC 组（P<0.05）。7、甲酚紫伊红染色、Luxol Fast Blue及Neurolucida系统检测结果显示:SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组脊髓损伤灶面积百分比和体积百分比无显着差异（>0.05）,但SCI+AAV-KLF7组残余髓鞘百分比显着高于SCI+AAV-NC组（P<0.05）。8、FG逆行示踪DPSN和免疫荧光染色结果显示:SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组T7-9节段FG逆行标记细胞数量无显着差异（P>0.05）,但SCI+AAV-KLF7组KLF7蛋白表达和FG/KLF7共标神经元百分比显着高于SCI+AAV-NC 组（P<0.05）。9、BDA顺向示踪DPSN轴突和免疫荧光染色结果显示:在T10损伤灶节段,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组GFAP蛋白表达无显着差异（P>0.05）,但SCI+AAV-KLF7组BDA蛋白表达显着高于SCI+AAV-NC组（P<0.05）。10、CTB逆行标记腰段运动神经元胞体和树突,BDA顺向示踪DPSN轴突,免疫荧光染色结果显示:在L4-5节段,SCI+AAV-KLF7组、SCI+AAV-NC组和Sham组CTB逆行标记脊髓前角运动神经元数量无显着差异（P>0.05）。与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组BDA相对密度和SYP相对密度/运动神经元显着降低,其中SCI+AAV-KLF7组BDA相对密度和SYP相对密度/运动神经元显着高于SCI+AAV-NC组（P<0.05）。11、电镜结果显示:Sham组T10节段轴突有髓鞘比率显着高于SCI+AAV-KLF7和 SCI+AAV-NC组;SCI+AAV-KLF7组损伤灶周围轴突髓鞘比率显着高于SCI+AAV-NC 组（P<0.001）。12、免疫荧光染色结果显示:在T7-9节段,多数NG2阳性细胞表达KLF7,NG2/KLF7共标神经元百分比为84.22±6.95%。仅少数CC1阳性细胞表达KLF7,CC1/KLF7共标神经元百分比为10.23±2.39%,未发现有GFAP阳性细胞表达KLF7。13、SCI 后 5w,与 Sham 组比较,SCI+AAV-KLF7 组和SCI+AAV-NC 组 TA湿重显着降低,TA湿重在SCI+AAV-KLF7和SCI+AAV-NC组之间无显着性差异（P>0.05）。此外,运动终板染色显示SCI+AAV-KLF7组、SCI+AAV-NC组和Sham组三组运动终板数量/肌纤维无显着差异（P>0.05）。14、行为学检测结果:①BMS评分结果表明:SCI后5w,SCI+AAV-KLF7组BMS评分显着高于SCI+AAV-NC组（P<0.05）;②Grid walking检测结果表明:SCI+AAV-KLF7组网格行走错误数显着低于SCI+AAV-NC组（P<0.05）;③电生理结果显示:与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组波幅显着降低,潜伏期显着延长,其中SCI+AAV-KLF7组较SCI+AAV-NC组波幅显着增高,而潜伏期显着缩短（P<0.05）;④Hargreaves检测结果显示:与Sham组比较,SCI+AAV-KLF7组和SCI+AAV-NC组热缩足反射潜伏期显着增高,而SCI+AAV-KLF7组反射潜伏期与SCI+AAV-NC组无显着性差异（P>0.05）。结论:1、AAV-KLF7能够有效转染脊髓和DRG神经元,增加脊髓神经元KLF7、NGF、TrkA的表达,进而促进脊髓神经元神经突和DRG轴突生长。2、KLF7通过上调靶基因NGF、TrkA、GAP43的表达,促进DPSN轴突可塑性及与腰段运动神经元突触形成。3、KLF7能使SCI后降低的P0上调,且在少突胶质前体细胞表达,促进损伤灶周围髓鞘形成。4、AAV-KLF7促进SCI后运动功能恢复。
龚立琼[7]（2018）在《电针对兔面神经损伤后面神经核团中神经生长因子及其受体表达的影响研究》文中指出目的:本研究旨在建立兔周围性面神经损伤模型,通过电针刺激后,观察其对兔面瘫症状和面神经元形态学的影响以及对神经生长因子及其受体表达的影响,探讨电针在周围性面神经损伤治疗中的作用机理。方法:将新西兰大白兔（n=66）随机分为正常组（n=6）、模型组（n=30）、电针组（n=30）;正常组不做处理,对模型组和电针组兔建立右侧面神经上颊支压榨损伤模型,造模成功后每天对电针组进行电针刺激,取穴“颊车”、“地仓”、“四白”、“阳白”、“翳风”、“颧髎”,予以疏密波刺激,选择频率18-20Hz、电压1.5V,“合谷”穴仅埋针不予以电刺激,30分钟/次,1次/天,模型组不予以治疗。以面神经损伤后第1、4、7、14、28天为取材时间点,对模型组、电针组分别取3只兔作苏木精-伊红染色观察面神经元的形态学以及免疫组织化学染色检测面神经核团中NGF及其受体TrkA和p75NTR的表达部位及强度,正常组3只同样进入检测;对模型组、电针组各时间点余3只兔取材,采用荧光定量PCR法检测面神经核团中NGF及其受体TrkA和p75NTR mRNA的表达情况,正常组3只同样进入检测,在实验过程中的每个时间点观察记录实验兔的面瘫情况。结果:1、新西兰大白兔的面瘫情况观察:面神经损伤后第1、4天,模型组和电针组兔面瘫情况无明显差别,均有眼睑闭合不全、口角歪斜表现,未见触须拂动;术后第7、14、28天,电针组兔口角歪斜逐渐改善,拂动触须逐渐增多,而模型组无明显触须拂动并且口角歪斜改善不如电针组明显。2、苏木素-伊红染色观察右侧面神经元的形态学变化:正常组面神经元呈多边多角形,胞浆可见较深染色的尼氏体,胞核居中;术后第1天:两组神经元的形态与正常组类似;术后第4、7天:模型组可见神经元胞体增大、肿胀,尼氏小体减少,核仁移位到周边部,电针组神经元也有类似模型组神经元的表现,但病理改变较模型组轻;术后第14、28天:电针组神经元形态逐渐恢复并于术后第28天未见肿胀神经元存在,但模型组可见肿胀神经元的存在,尼氏小体不致密,神经元胞体结构恢复不完全表现。3、免疫组织化学染色结果:NGF及其受体TrkA和p75NTR三者均表达于面神经元的胞浆。模型组和电针组中NGF的表达出现一个下降后逐渐增加然后维持高水平的过程,术后第1、4、7天,模型组中NGF的平均光密度值低于正常组（P<0.05）,而术后第28天则高于正常组（P<0.05）;而电针组NGF的平均光密度在术后均一直高于模型组（P<0.05）。两组中TrkA的表达出现先增加然后降低最后增加的变化过程,术后第1、4、14、28天,模型组中TrkA的平均光密度值高于正常组（P<0.05）;而电针组中TrkA的平均光密度在术后第7、14、28天都高于模型组（P<0.05）。模型组和电针组中p75NTR的表达出现一个下降后逐渐增加然后维持高水平的过程;术后第1天,模型组中p75NTR的平均光密度值低于正常组（P<0.05）,至术后第28天,模型组中p75NTR的平均光密度值高于正常组（P<0.05）;术后第7、14、28天,电针组p75NTR的平均光密度都高于模型组（P<0.05）。4、荧光定量PCR检测结果:NGF mRNA的相对表达量:术后模型组和电针组中NGF mRNA的相对表达量出现下降后增加然后降低再增加的过程。术后第14、28天,电针组中NGF mRNA的相对表达量高于模型组（P<0.05）。TrkA mRNA的相对表达量:术后模型组和电针组中TrkA mRNA的相对表达量出现逐渐增加然后降低的过程,术后第7、14、28天,电针组中TrkA mRNA的相对表达量高于模型组（P<0.05）。p75NTR mRNA的相对表达量:术后模型组和电针组中p75NTR mRNA的相对表达量出现下降后增加然后降低再增加的过程,术后第14、28天,电针组中的p75NTR mRNA相对表达量高于模型组（P<0.05）。结论:1、电针可以促进兔面神经损伤后面瘫症状的改善。2、电针可以减轻面神经损伤后神经元形态学的病理变化,促进神经元形态的恢复。3、面神经核团中NGF和p75NTR的表达在面神经损伤后降低,随着损伤的修复表达增加,TrkA持续高表达;NGF可能不仅通过结合TrkA发挥积极的神经元保护作用,还通过与p75NTR结合促进p75NTR介导胞体存活。4、电针可以提高面神经核团中NGF、TrkA、p75NTR的表达,并可能促进NGF与TrkA和p75NTR的分别结合,这可能是电针在面神经损伤后修复过程中发挥积极作用的机制。
元小红[8]（2017）在《电针结合济生肾气丸治疗脊髓损伤后神经源性膀胱的研究》文中研究表明正常的排尿反射是沿从脑、脊髓到膀胱、尿道平滑肌这样一条协调完整的通路进行。由交感、副交感、躯体周围神经共同参与,任何与排尿有关的神经受到损害后,引起的排尿功能障碍称为神经源性膀胱（neurogenic bladder,NB）。NB是一类由神经病变或损害引起的膀胱和（或）尿道的功能障碍性疾病,常同时伴有膀胱尿道功能的协调性失常。可产生复杂的排尿症状,而排尿不畅或尿潴留是其中最常见的症状之一。NB是脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后的常见并发症,是SCI患者最常见的临床问题,症状根据脊髓损伤平面的不同可以分为不同类型,常见为:①逼尿肌反射亢进;②逼尿肌无反射。而之后伴随的肾功能衰竭、肾和膀胱结石、膀胱癌症、尿路感染（UTI）和输尿管返流（VUR）将增加患者死亡风险。因此,对于瘫痪的SCI患者,恢复膀胱功能甚至比恢复运动功能更加重要。现代研究SCI后NB缺乏安全有效的治疗方案,电针能阻止或减轻SCI后的继发性的损害,促进脊髓的修复和再生。但是电针刺激治疗脊髓损伤的机理还未完全揭开,刺激强度也不好把握,而且电针不是上下神经元的电生理恢复和传导束的功能性重建,故还不能做到损伤部位的功能性替代,不能完全重建膀胱功能。SCI后NB属中医"癃闭"范畴。现代基础研究证实:济生肾气丸具有良性调节膀胱内压力及调节代谢、神经和免疫的功能,因此我们选用电针刺激骶神经治疗SCI后NB的同时,结合祖国医学的优势,辨证选用中药济生肾气丸治疗SCI后NB,旨在降低膀胱感染保护膀胱及肾功能,促进膀胱功能的重建。本文通过SCI后NB的文献研究、动物实验及临床尿动力学分析三部分探讨了 SCI后NB动物模型的建立及评估、电针结合济生肾气丸济生肾气丸治疗SCI后NB的疗效及初步探讨其改善SCI后NB大鼠膀胱功能的分子机制,为临床治疗SCI后NB提供新的方法和思路。1文献综述从西医和中医两个方面对SCI后NB的流行病学、病理生理、分型、诊断和治疗及中医理论基础、中药治疗、针灸治疗和中医其它疗法等方面的现状进展进行阐述,并总结SCI后NB的中西医治疗上的优缺点。2实验研究2.1实验一目的:建立理想的脊髓损伤后神经源性膀胱动物模型并评估脊髓及膀胱状态。方法:16只SD大鼠分为对照组（假手术）6只,实验组（T9脊髓全横断损伤大鼠模型）10只,记录每日实验组大鼠手法排尿量等情况以评估脊髓损伤后神经源性膀胱恢复情况,术后2周使用尿流动力学方法检测并比较两组大鼠膀胱内压以评估大鼠膀胱状态。结果:术后一周内,大鼠手法辅助排尿量逐渐增加并达到最大。术后一周后,大鼠辅助排尿量逐渐减低并于两周时渐渐稳定。对照组及实验组大鼠在最大膀胱压、膀胱基础压、排尿阈、收缩间隔、膀胱容量、排尿效率的参数值分别为（26.60±4.31）mmH2O、（21.66±2.56）mmH20;（11.66±1.33）mmH20、（14.72±2.65）mmH20;（20.46±0.52）mmH20、（16.99±0.81）mmH20;（1.36±1.58）min、（2.02±0.36）min;（0.82±0.15）ml、（2.20±0.24）ml;（92.67±1.97）%、（25.33±4.46）%。差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:采用T9水平脊髓全横断损伤制作的神经源性膀胱大鼠模型可操作性强,易量化、可重复,在正确积极的术后护理下并发症少、死亡率低。使用术后SCI大鼠手法排尿量的变化判断脊髓恢复情况,并以尿流动力学方法检测大鼠在膀胱连续灌注下的膀胱压力变化来评价其膀胱状态客观可行。2.2实验二目的:探讨电针结合济生肾气丸对于SCI后NB大鼠膀胱功能、肾功能的干预作用及初步探讨对损伤修复的分子机制。方法:SD雌性大鼠50只,随机挑选8只作为A组（假手术组）,其余42只大鼠进行T9脊髓全横断损伤造模,2周后对确定神经源性膀胱成模的存活大鼠39只随机挑选8只作为B组（对照组）,其余31只采用随机数字表法分为:C组（中药组）、D组（电针组）、E组（中药+电针组）分别为11只、10只、10只。A组不予任何干预。B组造模后不予任何干预。C组给予自制济生肾气丸水煎剂灌胃和骶2神经处体表肌肉电针。D组予蒸馏水灌胃和骼2神经电针刺激。E组自制济生肾气丸水煎剂灌胃和骶2神经电针刺激。实验期间观察并记录实验动物的死亡情况;分别在造模前、干预4天后、干预2周后、干预4周后称取实验动物的体重;在处死实验动物后,称取膀胱重量。干预2周后,眼眶取血测定血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白。并取T8-T10脊髓及S2双侧神经根用于Western blot 检测。结果:动物共死亡9只,其中造模过程死亡3只;干预及取标本过程死亡6只,分别是C组3只、D组1只、E组2只。①一般情况:E组的电针结合济生肾气丸的干预方式能够明显改善SCI后大鼠的体重下降的情况,差异具有统计学意义（P<0.05）。干预大鼠与对照组比较,在膀胱重量和最后一次手法排尿量方面差异不具有统计学意义（P>0.05）。②血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白检查:血清肌酐各干预组同对照组比较差异不具有统计学意义（P>0.05）;干预2周后,E组电针结合济生肾气丸的干预方式能够明显降低SCI后大鼠尿素氮水平,与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）;C组、D组、E组大鼠的尿微量白蛋白检测结果较对照组均显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。③膀胱HE染色:C组、D组、E组均能显着改善SCI后NB大鼠的膀胱形态:减轻膀胱壁肌层和黏膜层的水肿、充血及炎性细胞的浸润,降低肌层增生的程度,而其中E组改善情况最明显。④充盈性膀胱内压测定:D组、E组能够显着降低SCI后NB大鼠的膀胱容量,与对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。⑤Western Blot检测相关因子蛋白表达:C组中药治疗以及E组电针结合中药的治疗方式能够提高SCI后NB大鼠脊髓组织中神经生长因子NGF及其受体TrkA表达同时降低神经根组织中神经生长因子NGF及其受体TrkA表达,D组电针的方式能够提高SCI后NB大鼠脊髓组织中TrkA表达同时降低神经根组织中TrkA表达,与对照组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:①电针结合济生肾气丸治疗能够改善SCI后NB大鼠的体重下降情况、肾功能、膀胱组织病理学改变及膀胱容量。②电针结合济生肾气丸的治疗方式能够提高SCI后NB大鼠脊髓组织中神经生长因子NGF及其受体TrkA表达同时降低神经根组织中神经生长因子NGF及其受体TrkA表达,这可能是其改善SCI后NB大鼠膀胱功能的机制之一。3临床分析目的:分析临床不同损伤节段SCI后NB患者的尿动力学检查的特点。方法:收集2014年10月-2016年12月中国康复研究中心北京博爱医院影像尿动力学检查中心检查的门诊或病房病人113例。根据患者损伤情况分为骶上脊髓损伤组和骶髓损伤组,分析比较两组患者尿动力检查指标最大膀胱容量、残余尿量及通过影像尿动力检查观测两组患者逼尿肌无反射、逼尿肌过度活动、顺应性增加、顺应性降低、膀胱感觉异常、膀胱-输尿管返流的情况。结果:两组患者尿动力检查指标最大膀胱容量、残余尿量比较均无明显差异,差异不具有统计学意义（P>0.05）;骶上脊髓损伤患者的逼尿肌无反射、逼尿肌过度活动、膀胱顺应性增加、膀胱顺应性降低、膀胱感觉异常及膀胱-输尿管返流的发生率分别是34.7%、36.8%、9.5%、44.2%、55.8%、63.2%,而骶髓损伤患者的发生率则分别是85.7%、21.4%、21.4%、35.7%、28.6%、71.4%。骶髓损伤患者比骶上脊髓损伤患者的逼尿肌无反射的表现较明显,并且膀胱-输尿管返流的发生率更高,但膀胱感觉异常的发生率明显低于骶上脊髓损伤患者,差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:骶上脊髓损伤患者主要表现为膀胱感觉异常,而骶髓损伤患者主要表现为逼尿肌无反射和膀胱-输尿管返流。
钱东翔[9]（2010）在《SD大鼠脊髓全横断后运动神经元中NT-3和TrkC的表达变化》文中指出背景：脊髓损伤是一严重创伤,常规的治疗效果不佳,使相当一部分病人遗留运动、感觉、膀胱及直肠功能障碍。神经营养因子是神经损伤修复与功能重建的必要物质基础,从内源性神经营养因子3（NT-3）及其受体TrkC表达的相关分子机制及脊髓可塑性入手,探索促进脊髓损伤修复的新策略是当前国际神经科学界研究的重要内容之一。目的：研究成年SD大鼠脊髓全横断后损伤位点头尾侧及其相联系的阳性运动神经元中NT-3及其受体TrkC表达的时相变化,探讨内源性NT-3及TrkC在脊髓损伤修复中的内源性作用机制及其与脊髓可塑性的关系。方法：取健康成年SD大鼠（200-220克）42只,随机分成6组：每组7只,其中一组为假手术对照组,余为脊髓全横断模型组。模型动物分别于手术后1天、3天、7天、14天、28天,取损伤节段上、下各1cm的脊髓4段（大约为T8-T11脊髓节段）和双侧大脑运动皮层、中脑红核节段,共7处组织标本。其中,各组中3只用于免疫组化染色以了解NT-3及TrkC的原位分布,2只用于Western Blot检测NT-3及TrkC的蛋白含量,2只用于RT-PCR检测NT-3及TrkC的基因表达水平。各组大鼠在存活期间均行后肢BBB运动功能评分。用于免疫组化的大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后,4%多聚甲醛经升主动脉灌注后取材,组织后固定、入20%、25%、30%蔗糖溶液梯度脱水沉底后制作20μm连续冰冻切片,以NT-3及TrkC抗体行免疫组化SP三步法DAB染色和荧光染色并作对照。光镜和荧光显微镜下观察免疫阳性反应物的正常原位分布情况,观测并计数假手术和脊髓全横断损伤后,成年SD大鼠脊髓腹角和大脑皮质前运动区NT-3及TrkC阳性神经元的形态学变化、分布及亚细胞定位。用于western blot和RT-PCR检测的大鼠麻醉后,于活体下快速取材,部位同上,冲洗后冰浴下匀浆,将提取的蛋白离心、分装。用于RT-PCR检测的活取组织加入TRIzol作RNA抽提。电泳及免疫印迹检测后,利用凝胶成像系统分析各杂交带的光密度值及灰度值的时空变化。结果采用SPSS13.0统计软件包进行单因素方差分析、LSD检验等统计学处理。结果：1.Western blotting特异性的识别分子量13.6Kda和145Kda处的条带对应NT-3和TrkC的分子量,置换试验、阴性对照试验均为阴性。2.免疫组化技术观察结果：（1）运用免疫组化技术,观察到不同强度的NT-3和TrkC免疫阳性产物广泛分布于大鼠的运动神经元、中间神经元和胶质细胞。（2）通过Western blotting半定量,显示NT-3在大鼠脑干、海马区含量较丰富。3.假手术组和手术各组均观察到NT-3和TrkC阳性神经元,NT-3定位于胞浆和胞核,胞核染色非常明显,强于胞浆和神经纤维；TrkC主要定位于阳性细胞的胞浆,假手术组极少见于神经树突或神经末梢,未见于大脑运动皮层表达。脊髓损伤后,TrkC的阳性核染明显强化,强染色也见于一些树状分支和轴突,仍未见于大脑中央运动皮层表达。4.脊髓损伤模型大鼠NT-3和TrkC的表达变化：（1）脊髓全横断损伤处上、下节段各组大鼠前角NT-3免疫阳性神经元平均数目比较均有显着差异（P<0.001）；各手术组前角NT-3免疫阳性神经元平均数目均显着低于假手术对照组（P<0.05）；由多重比较结果及图38可以看出,手术1d组较对照组神经元平均数目显着下降,随后呈逐渐上升趋势,一直到术后28d,仍保持较高增长趋势。各组SD大鼠脊髓全横断损伤处上节段前角NT-3免疫阳性神经元与下节段前角NT-3免疫阳性神经元比较均无显着差异（P=0.184-1.000）。（2）脊髓全横断损伤后,1d至7d的TrkC表达在损伤部位（T10、T11）和相邻节段（T9、T12）对比假手术组表现下调,在14d、28d表现为恢复至假手术组水平；TrkC的表达水平头侧明显高于尾侧；损伤节段又明显高于相邻节段。Western blotting半定量检测未能观察到TrkC蛋白在大脑运动皮层表达。（3）脊髓损伤后TrkC的mRNA水平临时变化模式与TrkC蛋白水平变化相似,1d至7d表现对比假手术组有明显的减少,14d恢复至略高于假手术组的水平,对比假手术组在不同时点大脑运动皮层的表达均维持在一个相对低的水平。（4）NT-3和TrkC在脊髓灰质的灰度值测试大致与免疫组化的变化趋势相一致。5.大脑皮质运动区NT-3阳性神经元的变化趋势同脊髓前角运动神经元的变化趋势一致。6.BBB运动功能评分：对照组为21分,1d、3d时呈完全性瘫痪状态（0）,从7d（0.57）起逐步恢复,28d时最高（2.57）。结论：1.通过对抗体的鉴定,证实本实验采用的兔抗NT-3多克隆抗体和鼠抗TrkC单克隆抗体是高度特异性抗体。2.NT-3和TrkC在成年SD大鼠的运动神经元均有表达,而NT-3和TrkC在大鼠中枢神经系统的表达既有重叠又存在差异,提示这一对配体和受体均可能参与了大鼠脑和脊髓神经细胞的生理功能,但在不同区域的它们各自发挥着不同的作用。3.NT-3和TrkC在脊髓全横断损伤后均有表达,其时相变化有一定差异,表明这一对配体和受体的表达与脊髓损伤修复过程有关,但在损伤的不同时段和它们的作用方式可能存在一定差异,这为临床运用NTFs治疗脊髓损伤提供一定的实验依据。
朱燕玲[10]（2009）在《嗅鞘细胞在嗅觉发育和神经再生中的作用及其机制研究》文中研究指明嗅鞘细胞是嗅觉系统特有的神经胶质细胞。它起源于嗅上皮,包绕嗅神经束并支持和引导它们穿越筛板长入嗅球。目前国际上关于嗅鞘细胞本身的生物学特性以及其在发育中的作用了解十分有限。嗅鞘细胞具有促进嗅神经轴突生长、导向以及再生的能力。近年来,嗅鞘细胞移植被认为是治疗脊髓损伤最有前景的方法之一。然而遗憾的是,至今并不完全清楚嗅鞘细胞促进脊髓损伤修复的机制。本研究应用多种实验手段,主要探讨嗅鞘细胞在嗅觉系统发育和脊髓损伤再生中的作用及其机制。研究结果表明:（1）嗅鞘细胞能够通过分泌神经生长因子促进雪旺细胞在星型胶质细胞环境下迁移;（2）嗅鞘细胞通过分泌可溶性的分子吸引RMS神经前体细胞向嗅球迁移,并且这种作用是多种分子综合作用的结果。这些研究将有利于我们深入了解嗅鞘细胞在嗅觉系统发育、嗅觉可塑性以及神经损伤修复中发挥的作用,为神经发育异常、神经系统肿瘤、神经退行性疾病以及中枢神经损伤的治疗提供了重要的理论依据。
二、大鼠脊髓损伤后NGF及其受体TrkA在运动神经元及神经胶质细胞表达的变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠脊髓损伤后NGF及其受体TrkA在运动神经元及神经胶质细胞表达的变化（论文提纲范文）
（1）IncRNA-Malat1及相关转录因子参与调控背根节卫星胶质细胞转分化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 神经生长因子在神经系统转分化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）利用RNA-Seq技术探究三法三穴对坐骨神经损伤大鼠的修复机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 坐骨神经损伤的研究进展 |
| 1 坐骨神经损伤的概述 |
| 2 坐骨神经损伤的病理变化及表现 |
| 3 坐骨神经损伤的修复与再生 |
| 4 神经传导通路 |
| 5 坐骨神经损伤的临床治疗研究 |
| 6 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 推拿治疗坐骨神经损伤的研究概况 |
| 1 推拿可以促进损伤神经的修复与再生 |
| 2 推拿促进周围神经损伤恢复的行为学研究 |
| 3 推拿促进周围神经损伤恢复的形态学研究 |
| 4 推拿促进周围神经损伤恢复的机制研究 |
| 5 三法三穴干预SNI大鼠的取穴依据 |
| 6 思考和展望 |
| 参考文献 |
| 综述三 RNA-Seq技术在周围神经损伤中的应用概况 |
| 1 RNA-Seq技术的原理 |
| 2 测序数据质控 |
| 3 数据标准化 |
| 4 基因集分析 |
| 5 技术优势 |
| 6 RNA-Seq技术与周围神经损伤 |
| 7 思考和展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 探究三法三穴对SNI大鼠感觉和运动功能的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模方法 |
| 2.2 干预方法 |
| 2.3 行为学观察 |
| 2.4 组织样本制备及电镜观察 |
| 2.5 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠一般状况 |
| 3.2 SFI结果 |
| 3.3 斜板试验结果 |
| 3.4 累积疼痛评结果 |
| 3.5 电镜观察大鼠神经损伤点超微结构变化 |
| 3.6 电镜观察大鼠脊髓腹角神经元超微结构的变化 |
| 3.7 电镜观察大鼠腓肠肌超微结构的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 利用RNA-Seq技术探究三法三穴对SNI大鼠的基因表达影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模方法 |
| 2.2 干预方法 |
| 2.3 RNA提取 |
| 2.4 测序步骤 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经损伤点测序结果 |
| 3.2 DRG测序结果 |
| 3.3 脊髓背角测序结果 |
| 3.4 脊髓腹角测序结果 |
| 3.5 腓肠肌测序结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 三法三穴对神经损伤点的基因调控机制 |
| 4.2 三法三穴对DRG的基因调控机制 |
| 4.3 三法三穴对脊髓背角的基因调控机制 |
| 4.4 三法三穴对脊髓腹角的基因调控机制 |
| 4.5 三法三穴对腓肠肌的基因调控机制 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 探究三法三穴对SNI大鼠DRG神经元的调控机制 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 造模方法 |
| 2.2 干预方法 |
| 2.3 RNA提取过程 |
| 2.4 Real Time-PCR反应步骤 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（3）三法三穴对坐骨神经损伤大鼠痛觉和脊髓背角CX3CL1/CX3CR1及CCL2的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 按摩推拿手法对周围神经损伤疾病的临床治疗与机理研究 |
| 1. 按摩推拿手法对神经损伤的疗效 |
| 2. 按摩推拿对神经损伤的机理研究 |
| 3. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 周围神经损伤功能障碍的恢复相关综述 |
| 1.1 神经胶质细胞 |
| 1.2 神经元凋亡 |
| 1.3 相关蛋白与受体 |
| 1.4 离子通道 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 与疼痛相关趋化因子CCL2和CX3CL1及其受体研究进展 |
| 1. CCL2及受体 |
| 2. CX3CL1及其受体 |
| 3. CCL2、CX3CL1及受体与小胶质细胞 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验一 三法三穴对SNI大鼠痛觉相关行为学的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 实验二 三法三穴对SNI大鼠脊髓背角CX3CL1/CX3CR1和CCL2的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 实验三 三法三穴对SNI大鼠脊髓背角小胶质细胞的形态影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 免疫荧光观察 |
| 3. 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（4）HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 引言 中文摘要 英文摘要 英汉缩略语名称对照 第一部分 |
| HUC-MSCs联合hNSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 前言 一、 |
| 材料与方法 二、结果 三、讨论 四、结论 附图 参考文献 第二部分 |
| HNSCs移植联合电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究 前言 一、材料与方法 二、结果 三、讨论 四、结论 附图 参考文献 文献综述 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文 学位论文评阅及答辩情况表 英文论文一 英文论文二 |
（5）Gal-3在大鼠急性脊髓损伤炎症反应中的作用及调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Gal-3 在大鼠急性脊髓损伤模型中的表达及作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 Gal-3 促进大鼠急性脊髓损伤炎症反应的可能机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 技术路线图 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 Gal-3 通过ROS/TXNIP/NLRP3 通路促进脊髓损伤后神经炎症反应 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计方法 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）转录因子KLF7对脊髓损伤后脊髓下行固有束可塑性作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 AAV-KLF7转染对脊髓和DRG神经元的作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 脊髓神经元的培养 |
| 2.2.2 病毒载体的制备 |
| 2.2.3 在体外培养AAV-KLF7转染的脊髓神经元 |
| 2.2.4 体外动态观察轴突生长 |
| 2.2.5 DRG神经元分离培养与腺相关病毒转染 |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 免疫印迹实验(Western blot)检测 |
| 2.2.8 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)实验检测 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 体外实验AAV-KLF7有效转染的脊髓神经元 |
| 3.1.1 AAV有效转染脊髓神经元 |
| 3.1.2 AAV-KLF7有效转染脊髓神经元 |
| 3.2 AAV-KLF7显着上调脊髓神经元细胞中KLF7、NGF、TrkA的表达 |
| 3.3 AAV-KLF7在体外实时促进脊髓神经元神经突起 |
| 3.4 AAV-KLF7在体外促进DRG神经元轴突生长 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 AAV-KLF7调控SCI损伤后DPSN轴突可塑性的作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物模型 |
| 2.2.2 甲酚紫伊红染色 |
| 2.2.3 Luxol Fast Blue染色 |
| 2.2.4 免疫荧光染色 |
| 2.2.5 电子显微镜 |
| 2.2.6 BDA顺行示踪 |
| 2.2.7 CTB逆行示踪 |
| 2.2.8 荧光金(FG)神经元逆行标记 |
| 2.2.9 Western Blot检测 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 脊髓损伤后KLF7表达的动态改变 |
| 3.2 AAV-KLF7增加KLF7及其靶基因表达,降低SCI后P0缺失 |
| 3.3 KLF7保护脊髓损伤后的髓鞘 |
| 3.4 FG逆行标记检测AAV-KLF7有效转染T7-9节段DPSN |
| 3.5 KLF7促进SCI后损伤灶DPSN轴突可塑性 |
| 3.6 KLF7促进DPSN轴突与脊髓腰段运动神经元突触形成 |
| 3.7 KLF7促进SCI后损伤灶周围轴突髓鞘形成 |
| 3.8 AAV-KLF7转染SCI小鼠KLF7在少突胶质前体细胞的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 KLF7促进SCI后运动功能重建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 胫骨前肌(TA)湿重测定与运动终板染色 |
| 2.2.2 电生理方法检测 |
| 2.2.3 Basso Mouse Scale(BMS)检测 |
| 2.2.4 Grid walking检测 |
| 2.2.5 Hargreaves检测 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 KLF7对胫骨前肌(TA)萎缩及运动终板密度的影响 |
| 3.2 BMS实验结果 |
| 3.3 Grid walking检测结果 |
| 3.4 电生理实验结果 |
| 3.5 Hargreaves实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 脊髓固有神经元可塑性调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）电针对兔面神经损伤后面神经核团中神经生长因子及其受体表达的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 致谢 |
| 神经生长因子及其受体在神经系统的中的研究进展(综述) |
| 参考文献 |
（8）电针结合济生肾气丸治疗脊髓损伤后神经源性膀胱的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 脊髓损伤后神经源性膀胱的研究进展 |
| 1 流行病学 |
| 2 病理生理学 |
| 3 SCI后NB的分型 |
| 4 诊断 |
| 5 治疗 |
| 6 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 脊髓损伤后神经源性膀胱的中医治疗进展 |
| 1 SCI后NB的中医理论基础 |
| 2 中药治疗 |
| 3 针灸治疗 |
| 4 其他治疗方法 |
| 5 小结及展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 大鼠脊髓全横断损伤后神经源性膀胱模型的建立及评估 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 实验二 电针结合济生肾气丸对脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠泌尿系统的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍的临床尿动力学分析 |
| 1 资料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在的不足与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（9）SD大鼠脊髓全横断后运动神经元中NT-3和TrkC的表达变化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 研究意义及目的 |
| 一、研究意义 |
| 二、研究目的 |
| 第三章 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 第四章 结果 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 中英文缩略词表 |
| 在读期间参与编写的文章和专着 |
| 致谢 |
（10）嗅鞘细胞在嗅觉发育和神经再生中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 详细摘要 |
| 中英文缩写 |
| 第一部分：嗅鞘细胞对雪旺细胞迁移的影响及其机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：嗅鞘细胞对脑室管膜下区神经前体细胞迁移的影响及其机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验结果总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
四、大鼠脊髓损伤后NGF及其受体TrkA在运动神经元及神经胶质细胞表达的变化（论文参考文献）
- [1]IncRNA-Malat1及相关转录因子参与调控背根节卫星胶质细胞转分化的作用及机制研究[D]. 刘矿嫔. 昆明医科大学, 2020
- [2]利用RNA-Seq技术探究三法三穴对坐骨神经损伤大鼠的修复机制[D]. 吕桃桃. 北京中医药大学, 2020(04)
- [3]三法三穴对坐骨神经损伤大鼠痛觉和脊髓背角CX3CL1/CX3CR1及CCL2的影响[D]. 莫岩君. 北京中医药大学, 2020(04)
- [4]HUC-MSCs、hNSCs、电刺激治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 孙磊. 山东大学, 2019(02)
- [5]Gal-3在大鼠急性脊髓损伤炎症反应中的作用及调控机制研究[D]. 任周梁. 新疆医科大学, 2019(07)
- [6]转录因子KLF7对脊髓损伤后脊髓下行固有束可塑性作用及机制研究[D]. 李文媛. 中国医科大学, 2019
- [7]电针对兔面神经损伤后面神经核团中神经生长因子及其受体表达的影响研究[D]. 龚立琼. 西南医科大学, 2018(01)
- [8]电针结合济生肾气丸治疗脊髓损伤后神经源性膀胱的研究[D]. 元小红. 北京中医药大学, 2017(08)
- [9]SD大鼠脊髓全横断后运动神经元中NT-3和TrkC的表达变化[D]. 钱东翔. 南方医科大学, 2010(12)
- [10]嗅鞘细胞在嗅觉发育和神经再生中的作用及其机制研究[D]. 朱燕玲. 第二军医大学, 2009(10)