一、Dot_ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清抗体的研究（论文文献综述）
张玉杰,刘红祥,刘东,张翔,杜元钊[1]（2021）在《鸭源鸡杆菌平板凝集检测方法的建立与应用》文中研究表明为建立一种方便、快捷的鸭源鸡杆菌血清抗体诊断方法,通过用鸭源鸡杆菌YT-1株制备抗原,然后免疫健康家兔制备阴阳性血清,建立了鸭源鸡杆菌平板凝集检测方法,并进行特异性试验,确定抗原最佳工作浓度,同时用该方法进行临床样品检测。结果显示:鸭源鸡杆菌染色抗原与鸡源阳性血清产生明显凝集,而与鸡源阴性血清以及鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽腺病毒等病原的阳性血清均不凝集;当抗原浓度为5 × 109 CFU/mL时,抗原与血清凝集最佳。结果表明,建立的鸭源鸡杆菌血清抗体平板凝集试验方法具有良好的特异性,可用于开产前后鸡群鸭源鸡杆菌的检测评估及流行病学调查。
施敏捷[2]（2021）在《A型副鸡禽杆菌Hmtp蛋白的原核表达及其对鸡的免疫原性研究》文中研究说明鸡传染性鼻炎（Infectious Coryza,IC）是由副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum,Apg）引起的一种禽呼吸系统传染病。主要导致患病鸡的产蛋率下降、淘汰率增加,对禽养殖特别是蛋鸡养殖造成巨大的经济损失。副鸡禽杆菌有3种血清型,其中血清A型在我国的存在时间最长,传播范围最广。灭活疫苗是目前预防鸡传染性鼻炎的主要方式,但随着病原菌的不断变异,现有疫苗株对流行株的保护力差,免疫失败的情况时有发生。研究表明,副鸡禽杆菌有多种毒力因子,而血凝素蛋白是其中最具潜力的亚单位疫苗抗原。本试验搜集并筛选了血清A型副鸡禽杆菌Hmtp蛋白基因序列,通过原核表达系统进行蛋白表达,纯化重组蛋白并制备成亚单位疫苗,通过免疫SPF鸡评估重组蛋白的免疫效果,为副鸡禽杆菌亚单位疫苗的研究防控提供依据。具体试验结果如下:1.本试验搜集了GenBank中血清A型副鸡禽杆菌的Hmtp基因序列,通过Mega进行序列比对并构建基因进化树。选择F-8株的Hmtp基因作为重组表达基因,对原基因序列进行密码子优化,并委托公司进行合成。通过同源重组的方法构建pET28-Hmtp重组载体,初步表达后表明表达蛋白的可溶性较好。2.通过设置不同的蛋白诱导条件进行表达优化,确定重组蛋白的最佳诱导方案为诱导温度30℃、诱导时间6 h、IPTG浓度为0.5 mmol/L。通过Ni柱对重组Hmtp蛋白进行纯化,通过Western blot检测表明,重组蛋白可以与A型副鸡禽杆菌阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。3.除去蛋白溶液中的盐离子和内毒素,经超滤浓缩后测得最终重组蛋白的浓度为1.41 mg/mL。在免疫SPF鸡后定期采血、收集血清,通过间接ELISA检测表明,重组蛋白能够诱导SPF鸡产生特异性抗体,且高剂量蛋白免疫机体后能产生与现有商品化灭活疫苗相当的抗体效价水平。综上所述,本研究以血清A型副鸡禽杆菌F-8株的Hmtp基因序列作为目的基因,通过原核表达系统成功表达出可溶性较好的重组Hmtp蛋白。Western blot检测和动物试验结果均表明,重组Hmtp蛋白对鸡具有一定的免疫原性,为鸡传染性鼻炎的防治提供了参考。
陈秀芳[3]（2021）在《2019～2020年规模化蛋鸡场副鸡禽杆菌的分离鉴定、致病性研究与耐药性分析》文中提出传染性鼻炎（infectious coryza,IC）是由副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum,Apg）引起的鸡的一种急性上呼吸道疾病,主要临床症状为鼻腔和窦的炎症,表现流涕、面部水肿和结膜炎,可造成育成鸡的生长不良和产蛋鸡产蛋率下降。近年来该病在国内规模化蛋鸡场中发病率呈现明显的上升趋势。本研究在国内部分发生IC的规模化蛋鸡场进行流行病学调查和病原分离鉴定,测定了流行菌株的致病性,通过体外药敏试验了解Apg分离株耐药情况,为防控IC的流行提供参考。1、2019～2020年部分规模化蛋鸡场副鸡禽杆菌的分离鉴定及致病性研究本研究于2019～2020年从江苏、河北及宁夏等地疑似发生IC的规模化蛋鸡场开展流行病学调查,采集临床样品进行Apg菌株分离鉴定和Page法血清分型。结果显示调查的发病鸡群中A、B、C 3种血清型Apg均有流行,在分离鉴定的40个Apg分离株中包括血清A型1 1株、血清B型10株和血清C型19株,表明血清C型已经上升为当前流行株的最优势的血清型,该结果与前期国内调查的结果存在较大差异。结合各发病鸡群的流行病学信息进行综合分析发现,该病主要以春末夏初和秋冬换季时多发,发病鸡群日龄以产蛋期为主,但也有部分鸡群在30～40日龄育雏阶段早期感染和发病,多个鸡群被发现同时存在2种甚至3种血清型菌株的感染。前期已报道外膜蛋白Hmtp210在不同血清型之间存在较大的差异,本研究进一步对40个分离株Hmtp210基因高变区序列进行了克隆、测序和遗传进化分析,结果发现相同血清型菌株之间同源性较近,而不同血清型菌株在进化树上均位于各自独立的进化分支。该结果表明,利用Hmtp210基因高变区序列进行基因分型的结果与Page法血清分型的结果具有良好的对应关系,因此有望作为一种血清学分型的替代方法应用于Apg菌株的快速分型。鉴于当前血清C型已经在调查鸡群中广泛流行,本研究又进一步开展了 C型分离株的致病性试验。研究以2020/JS80株对32日龄的SPF鸡进行人工感染,观察攻毒后鸡群临床症状、病理变化及检测攻毒菌株在体内的复制和分布规律。结果显示:攻毒菌株具有很强的致病性,在攻毒后24 h鸡群即表现明显的精神沉郁;攻毒后第3天为发病高峰,发病率达到100%,发病鸡面部肿胀,鸡群采食量和饮水量显着减少;攻毒后第5天,鸡群临床症状开始逐渐减轻,采食量和饮水量增加,面部肿胀也逐渐消退;攻毒后第7天,鸡群精神状况和食欲基本恢复正常。发病鸡剖检可见鼻腔内大量黄色胶冻样物,气管有出血点,脾脏和法氏囊肿大。病理组织切片可观察到眶下窦巨噬细胞和异嗜性粒细胞浸润,气管纤毛部分脱落,气管黏膜下层大量炎性细胞浸润。qPCR检测结果显示,攻毒菌株主要在鼻腔和气管中定植和复制,但在攻毒后3d至5d攻毒鸡表现明显的菌血症,在血液和多个组织器官（胸腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏）中均可检测到细菌。2、副鸡禽杆菌的耐药性分析本研究选取临床上常用药物包括β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、酰胺醇类、氨基糖胺类、氟喹诺酮类、盐酸林可霉素/硫酸大观霉素和大环内酯类抗生素,进行分离株体外药敏试验。结果表明所有分离株均表现出很强的多重耐药性。（1）所有分离株对复方磺胺间甲氧嘧啶钠均耐药,MIC值最高达256 μg/mL;（2）对四环素类抗生素不同药物的耐药性不同,对土霉素除1株敏感外其它菌株均耐药,将近一半的分离株对强力霉素耐药;（3）分离株对β-内酰胺类抗生素尤其是阿莫西林和头孢噻呋钠敏感性较高。综上所述,本研究通过调查发现:（1）当前规模化蛋鸡场Apg流行情况较为复杂,A、B、C 3种血清型均有流行且两种以上血清型混合感染较为普遍,C型菌株致病力强且已经上升为当前流行的优势血清型;（2）分离菌株多重耐药现象非常普遍,但是对β-内酰胺类抗生素大多敏感,因此β-内酰胺类抗生素可作为临床治疗的首选药物。
王贵波,李建喜,罗超应,谢家声,郑继方,辛蕊华,罗永江,李锦宇,李晓蓉[4]（2020）在《传鼻康口服液对鸡传染性鼻炎人工感染病例的临床治疗试验》文中研究指明为验证传鼻康口服液对鸡传染性鼻炎的治疗效果,将21日龄三黄肉鸡随机分为6组,每组30只,分别为传鼻康口服液高剂量组、中剂量组（推荐剂量）、低剂量组及对照药镇喘散组、感染对照组（感染不给药）、健康对照组。除健康对照组外,对其余各组鸡人工感染副鸡嗜血杆菌。连续给药治疗7 d,停药后观察14 d,试验期21d,分别对其临床疗效、平均增重与病理变化等进行分析,评价其临床疗效。结果表明,传鼻康口服液高剂量组和中剂量组连续用药7 d,对感染发病鸡有明显疗效,能显着降低血清抗体反应阳性率,副鸡嗜血杆菌阳性检出率分别为10%、20%,平均增重分别为（697.9±44.7）g和（697.7±65.6）g。而对照药镇喘散组的副鸡嗜血杆菌抗体阳性检出率为50%,平均增重为（579.3±43.7）g。说明传鼻康口服液对人工感染副鸡嗜血杆菌的试验病例有较好的治疗效果,其作用优于镇喘散。
李倩,蔡俊呈,蔡琳琳,林秋燕,向斌,廖明,徐成刚,任涛,黎敏[5]（2020）在《鸡传染性鼻炎免疫学研究进展》文中认为鸡传染性鼻炎(（Infectious coryza, IC）是由副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum,Apg）引起的一种在肉鸡、产蛋鸡群中常见的急性或亚急性呼吸道传染病。该病呈世界性分布,主要引起鸡生长发育受阻,产蛋率下降[1]。随着分子生物学技术的不断应用,针对副鸡禽杆菌的鉴定、分型技术、免疫保护相关基因和抗原分析等分子水平上的研究也取得了新的进展。本文旨在概述副鸡禽杆菌免疫原性及其疫苗的研究进展,为鸡传染性鼻炎的临床防制提供理论知识和参考。
刘晓露[6]（2020）在《副猪嗜血杆菌重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的建立与应用》文中研究表明猪革拉斯氏病（Glasser’s disease）是由副猪嗜血杆菌（HPS）引起的以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为主要临床特征的一种高致病率和致死率的细菌性传染病。抗生素和疫苗接种是防控该病的常用方法。由于各类抗生素的不合理使用,导致HPS耐药性的产生且日趋严重,因此疫苗接种则成为预防Glasser’s disease和降低死亡率的有效措施。然而,HPS有15种以上的血清型,不同血清型HPS之间缺乏交互免疫力,且具有明显的地方性特征,造成疫苗免疫效果的不确定性。此外,当前生猪生产中疫病种类较多,疫苗接种频繁,导致许多猪场并非采用此种方式以防控HPS感染。所以及时监测和分析是了解疫苗免疫效果及猪群中HPS感染情况的重要手段。转铁结合蛋白（Tbp）是HPS的主要毒力因子之一,包括Tbp A和Tbp B两种多肽结构。本实验室前期研究结果显示Tbp A具有良好的免疫原性和反应原性,可对同源菌以及不同血清型菌株的攻毒提供良好的免疫保护力。本研究系利用HPS重组Tbp A作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法,旨为猪群免疫监测及Glasser’s disease的血清流行病学调查提供一种快速、敏感且特异的技术手段。本研究内容:（1）对HPS血清型4型和13型分别进行重组Tbp A的表达纯化与鉴定,并将其作为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法（代号分别为4型Tbp A-ELISA和13型Tbp A-ELISA）。（2）对两种方法的抗原浓度及包被条件、封闭液种类及封闭时间、血清和酶标二抗的稀释度及作用时间、显色时间等反应条件进行优化。（3）利用优化的方法分别检测30份HPS阴性血清,确定两种方法的临界值。（4）利用优化的方法分别对猪链球菌（SS）、猪大肠杆菌（E.coli）、猪丹毒杆菌（ER）、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）、猪圆环病毒2型（PCV 2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）阳性血清进行检测,评估两种方法的特异性。（5）将HPS标准阳性血清按1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400进行倍比稀释,利用优化的方法分别与商品化检测HPS抗体的ELISA试剂盒同时进行检测,评估两种方法的敏感性。（6）分别用同一批次和三个不同批次表达纯化的HPS重组Tbp A进行包被,利用优化的方法分别对4份HPS阳性血清和1份HPS阴性血清样品进行批内及批间试验,计算变异系数,评估两种方法的重复性。（7）应用优化的两种方法分别对安徽某规模化猪场60份经HPS疫苗接种的猪血清样品进行免疫抗体检测,并与分别以HPS血清型4型和13型全菌体为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法、商品化检测HPS抗体ELISA试剂盒以及Western-blot作平行比较,考察两种方法的可靠性。（8）利用筛选出的方法对源自安徽10个地市10个规模化猪场总计600份未经HPS疫苗接种的猪血清样品进行感染抗体检测,验证该方法的应用性。结果显示:（1）经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,HPS两种血清型的重组Tbp A均成功获得表达和纯化。（2）4型Tbp A-ELISA和13型Tbp A-ELISA的优化反应条件是:最适抗原浓度分别是5μg/m L、7μg/m L,均为4℃过夜包被;均采用5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;最佳血清稀释度分别是1:1600、1:3200,孵育时间分别为37℃45min、37℃60 min;最佳酶标二抗稀释度分别是1:5000、1:10000,作用时间分别为37℃30 min、37℃60 min;显色时间分别为37℃5 min、37℃10 min。（3）优化的两种方法阳性临界值分别为0.215和0.292,阴性临界值分别为0.188和0.242。（4）优化的两种方法均不与SS、E.coli、ER、APP、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV阳性血清产生交叉反应,特异性强。（5）优化的4型Tbp A-ELISA敏感性与商品化检测HPS抗体ELISA试剂盒相同,而13型Tbp A-ELISA敏感性则略低于试剂盒。（6）优化的两种方法批内及批间试验变异系数均小于10%,重复性良好。（7）4型Tbp A-ELISA检测HPS免疫抗体阳性率为80%,与平行比较方法的总符合率分别为90%、88.33%、86.67%和90%,一致性较高;13型Tbp A-ELISA检测HPS免疫抗体阳性率为76.67%,与平行比较方法的总符合率分别为80%、90%、83.33%、86.67%。（8）600份血清样品共检出阳性样品117份,HPS感染抗体总阳性率为19.5%。结果表明:（1）本研究分别以HPS血清型4型和13型的重组Tbp A作抗原,成功建立了特异性强、敏感性高、重复性好的检测HPS抗体的间接ELISA方法（代号分别为4型Tbp A-ELISA和13型Tbp A-ELISA）。（2）应用两种方法对进行和未进行HPS疫苗免疫的猪血清样品进行检测,确证4型Tbp A-ELISA更适于临床HPS抗体检测和流行病学调查。
梁娟[7]（2020）在《猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用》文中认为巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌分别是引起猪巴氏杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎、猪传染性胸膜肺炎和格拉瑟氏病的主要病原,也是当前养猪业常见的五种呼吸系统疾病病原菌。这五种病原菌均可引起猪的呼吸道疾病,且引起的临床症状和病理变化通过肉眼观察有时难以区分。有时还存在这几种病原菌混合感染的情况,更给疾病的诊断造成困难。为了有效鉴定这些病原菌,本课题拟建立一种同时鉴定这五种病原的PCR诊断方法。1.猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的单重PCR检测方法。方法:针对巴氏杆菌plpE基因、猪链球菌gdh基因、猪肺炎支原体mhp677基因、胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ基因和副猪嗜血杆菌vanY基因序列各设计1对引物,确定每种病原单重PCR的退火温度和敏感性,验证引物的特异性。结果:确定五种病原单重PCR扩增的退火温度范围为54℃-60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。plpE基因的最低检出限为0.01 ng/μL,gdh基因的最低检出限为0.1 ng/μL,mhp677基因的最检出限为0.1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为0.1 ng/μL,vanY基因的最低检出限为1 ng/μL。结论:建立了五种病原各自的单重PCR检测方法,为五重PCR检测方法的建立奠定了基础。2.猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的五重PCR检测方法。方法:将确定的5种病原菌单重PCR检测方法的引物和模板混合,确定五重PCR反应的退火温度和和敏感性,验证引物的特异性。结果:五重PCR反应的退火温度为60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。在五重反应PCR体系中,plpE基因的最低检出限为1 ng/μL,gdh基因的最低检出限为10 ng/μL,mhp677基因的最低检出限为1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为10 ng/μL,vanY基因的最低检出限为10ng/μL。结论:建立了猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法。3.猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的应用目的:验证所建立的五重PCR方法是否可用于临床检测。方法:采集病变猪肺组织,提取基因组后用已经建立的方法检测五种巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌。结果:对采集的224份临床样本的检测结果表明,在65份样品中检测到上述五种病原中的至少一种,其中50份样品为单纯感染,15份为混合感染。结论:本研究所建立的猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法可用于猪呼吸系统病原菌巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的检测及病原流行病学调查。
张曼,韩飞[8]（2017）在《A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用》文中研究说明原核表达A型副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A）的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a（+）中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD450≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD450值的变异系数分别1.5%3.7%和6.5%8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。
薛营[9]（2017）在《鼻气管鸟杆菌分离鉴定与OMA87蛋白单克隆抗体制备》文中研究指明1.肉鸡感染鼻气管鸟杆菌的分离与鉴定从江苏省某白羽肉鸡场出现呼吸道症状的鸡群中分离获得3株病原菌,在绵羊血琼脂上划线,37℃,5%的CO2培养箱中培养48 h后可见灰白色、表面隆起、边缘整齐、圆形有丁酸样气味的菌落,而在麦康凯琼脂上不生长。经革兰氏染色后,在显微镜下可观察到粉红色、短小杆菌（长0.6～1.5μm,宽0.2～0.6μm）,单个或呈短丝状排列呈多形性。经负染通过电镜观察未发现有荚膜、鞭毛、菌毛等细菌的特殊结构。用API20NE生化反应试剂盒检测其结果显示,硝酸盐反应、吲哚试验为阴性,葡萄糖、氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶均为阳性。根据GenBank已发表的鼻气管鸟杆菌（Omithobacterium rhinotracheale,ORT）16SrRNA基因序列进行多重比对后设计出一对特异引物,经PCR扩增出 379bp条带。经测序后其基因序列与GenBank已发表的ORT基因序列进行比较结果显示,同源性均在99.4%以上,表明该扩增片段为鼻气管鸟杆菌的特异片段。2.鼻气管鸟杆菌OMA87蛋白原核表达及抗原性鉴定通过参考 GenBank 中 ORT-DSM 15997 株基因序列（GenBank:CP003283.1）,设计了覆盖全部ORTOMA87编码区（第32322至第34886位碱基）的特异性引物,使用PCR方法将其扩增并插入pMD 18-T Vector中进行克隆。测序正确后,用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ对重组质粒进行双酶切,并分别将目的片段连接入原核表达载体pGEX-6p-1,提取质粒pGEX-6p-1-OMA87,将质粒转化进大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。分析发现,融合蛋白GST-OMA87（121KD）在上清和沉淀中均有表达。将上清中的蛋白纯化、浓缩后,用ORT阳性SPF鸡血清作为一抗,兔抗鸡IgG作为二抗进行Western-blot验证,结果显示融合蛋白GST-OMA87可与SPF鸡ORT阳性血清发生反应,具有较好的抗原性,说明此融合蛋白可用作制备针对ORT单克隆抗体。3.鼻气管鸟杆菌OMA87蛋白的单克隆抗体制备利用研究二所得纯化的重组蛋白GST-OMA87作为免疫原,按照常规程序免疫6～8周龄Balb/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过间接ELISA筛选阳性细胞株,最终获得两株稳定分泌抗重组蛋白OMA87的单克隆抗体细胞株:ORT-OMA87-2C4和ORT-OMA87-5G9;抗体亚类鉴定2C4抗体重链IgG2a,5G9抗体重链为IgG1,轻链均为Kappa型;其腹水抗体效价分别为1:32000、1:64000。经间接ELISA特异性检测结果显示2C4、5G9均能与ORT包被抗原呈阳性反应,且与包被其它几种抗原之间无交叉反应。利用单抗检测分离鉴定的ORT阳性菌株,为进一步建立特异性强、敏感度高、简便快捷的检测方法奠定了基础。
马树芳,赵小勇,程志伟[10]（2017）在《副猪嗜血杆菌实验室诊断方法研究进展》文中研究说明副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的呼吸道传染病,主要感染断奶前后仔猪,引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,已严重影响养猪业的发展,因此早期诊断有助于防控该病。本文对副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法及其研究现状进行了综述。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起猪的以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病。该病在全世界均有发生,通常见于5-8周龄的猪,发病率一般在10%-15%,严重时
二、Dot_ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Dot_ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清抗体的研究（论文提纲范文）
（2）A型副鸡禽杆菌Hmtp蛋白的原核表达及其对鸡的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 副鸡禽杆菌研究进展 |
| 1.1 副鸡禽杆菌的病原学 |
| 1.1.1 生物学特性 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状和病理变化 |
| 1.1.4 诊断与治疗 |
| 1.2 副鸡禽杆菌相关毒力因子 |
| 1.2.1 荚膜多糖 |
| 1.2.2 脂多糖 |
| 1.2.3 细菌致死性扩张毒素 |
| 1.2.4 RTX毒素 |
| 1.2.5 菌毛蛋白 |
| 1.2.6 外膜蛋白 |
| 1.2.7 红细胞凝集素 |
| 1.3 副鸡禽杆菌疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 菌影疫苗 |
| 1.3.3 亚单位疫苗 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 A型副鸡禽杆菌Hmtp基因的原核表达 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验试剂的配制方法 |
| 2.2.2 保护性抗原基因筛选和优化 |
| 2.2.3 构建Hmtp原核表达载体 |
| 2.2.4 重组Hmtp蛋白的表达及性状分析 |
| 2.2.5 重组蛋白的诱导条件优化 |
| 2.2.6 重组蛋白纯化与鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 保护性抗原基因的筛选 |
| 2.3.2 构建Hmtp原核表达载体 |
| 2.3.3 重组Hmtp蛋白的表达 |
| 2.3.4 重组蛋白的诱导条件优化 |
| 2.3.5 重组Hmtp蛋白的纯化与鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Hmtp表达蛋白的免疫原性分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 实验动物及相关材料 |
| 3.1.2 主要的试剂和试剂盒 |
| 3.1.3 主要试验仪器和耗材 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验试剂配制 |
| 3.2.2 制备免疫原 |
| 3.2.3 免疫方案 |
| 3.2.4 抗体效价检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 目的蛋白浓度测定 |
| 3.3.2 抗体效价检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）2019～2020年规模化蛋鸡场副鸡禽杆菌的分离鉴定、致病性研究与耐药性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 流行病学 |
| 1.1 Apg血清分型 |
| 1.2 国外Apg感染的流行现状 |
| 1.3 国内Apg感染的流行现状 |
| 2 诊断 |
| 2.1 临床诊断 |
| 2.2 病原分离与鉴定 |
| 2.3 血清学诊断 |
| 2.4 分子生物学诊断 |
| 3 综合防控 |
| 3.1 药物防治 |
| 3.1.1 国外菌株耐药现状 |
| 3.1.2 国内菌株耐药现状 |
| 3.2 疫苗预防 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第一章 2019～2020年部分规模化蛋鸡场副鸡禽杆菌的分离鉴定及致病性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 试剂及培养基的配制 |
| 2.2 菌株的分离及鉴定 |
| 2.2.1 菌株的分离、纯化 |
| 2.2.2 PCR鉴定 |
| 2.3 分离株Hmtp210基因高变区扩增及序列分析 |
| 2.3.1 Hmtp210基因高变区引物设计 |
| 2.3.2 Hmtp210基因高变区PCR扩增 |
| 2.3.3 Hmtp210基因高变区遗传进化分析 |
| 2.4 C型副鸡禽杆菌的致病性实验 |
| 2.4.1 实验分组及攻毒 |
| 2.4.2 攻毒后临床症状和病理变化 |
| 2.4.3 攻毒后组织载菌量测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 菌株的分离及鉴定 |
| 3.1.1 临床诊断及细菌分离 |
| 3.1.2 PCR鉴定及血清分型 |
| 3.2 分离株Hmtp210基因高变区扩增及序列分析 |
| 3.2.1 Hmtp210基因高变区序列扩增 |
| 3.2.2 Hmtp210基因高变区序列遗传进化分析 |
| 3.3 C型副鸡禽杆菌的致病性实验 |
| 3.3.1 临床症状和病变 |
| 3.3.2 病理变化 |
| 3.3.3攻毒后各组织器官载菌量 |
| 4 讨论 |
| 第二章 副鸡禽杆菌耐药性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 参考菌株 |
| 2.2 Apg菌株的准备 |
| 2.3 抗生素的准备 |
| 2.4 抗生素最小抑菌浓度的测定 |
| 2.5 抗生素药敏结果判定 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）传鼻康口服液对鸡传染性鼻炎人工感染病例的临床治疗试验（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 试验药物 |
| 1.1.2 对照药物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 病原 |
| 1.1.5 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 增菌培养和活菌计数 |
| 1.2.2 攻毒剂量的筛选 |
| 1.2.3 动物分组 |
| 1.2.4 鸡传染性鼻炎人工感染试验 |
| 1.2.5 给药剂量及方法 |
| 1.2.6 人工发病成功标准 |
| 1.2.7疗效评价指标 |
| 1.2.8 病死鸡剖检 |
| 1.2.9 血清抗原检测 |
| 1.2.1 0 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鸡传染性鼻炎人工感染试验的试验鸡临床症状 |
| 2.2 病理变化 |
| 2.3 副鸡嗜血杆菌抗原检测结果 |
| 2.4 传鼻康口服液对鸡传染性鼻炎的治疗效果 |
| 2.4.1 病死率 |
| 2.4.2 治愈率 |
| 2.4.3 平均增重 |
| 3 讨论 |
| 3.1 传鼻康口服液治疗鸡传染性鼻炎的中兽医学辨证 |
| 3.2 鼻传康的主治、功效 |
| 3.3 受试药物对人工感染副鸡嗜血杆菌病例的治疗效果 |
| 4 结论 |
（5）鸡传染性鼻炎免疫学研究进展（论文提纲范文）
| 1 鸡传染性鼻炎及国内流行特点 |
| 2 副鸡禽杆菌的鉴定及血清型分型 |
| 3 副鸡禽杆菌的免疫调节 |
| 4 副鸡禽杆菌保护性抗原及免疫学特性 |
| 5 鸡传染性鼻炎发病机理及疫苗免疫研究 |
| 6 总结 |
（6）副猪嗜血杆菌重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略语列表 |
| 文献综述 |
| 1 HPS的病原特征 |
| 2 Glasser's disease的流行病学 |
| 3 Glasser's disease的临床症状与病理变化 |
| 4 Glasser's disease的诊断与防治 |
| 5 结语 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验菌株、质粒及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 HPS重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 2.2.1.1 抗原的制备 |
| 2.2.1.2 间接ELISA抗体检测方法的操作步骤 |
| 2.2.1.3 最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 2.2.1.4 最佳抗原包被条件的确定 |
| 2.2.1.5 最佳封闭液及封闭时间的确定 |
| 2.2.1.6 最佳血清作用时间的确定 |
| 2.2.1.7 最佳酶标二抗浓度及作用时间的确定 |
| 2.2.1.8 最佳显色时间的确定 |
| 2.2.1.9 临界值的确定 |
| 2.2.1.10 特异性试验 |
| 2.2.1.11 敏感性试验 |
| 2.2.1.12 重复性试验 |
| 2.2.2 HPS重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的应用 |
| 2.2.2.1 进行HPS疫苗接种猪血清样品的免疫抗体检测 |
| 2.2.2.2 未进行HPS疫苗接种猪血清样品的感染抗体检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HPS重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1.1 HPS血清型4、13型重组TbpA的表达、纯化及反应原性分析 |
| 3.1.2 最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 3.1.3 最佳抗原包被条件的确定 |
| 3.1.4 最佳封闭液种类及封闭时间的确定 |
| 3.1.5 最佳血清作用时间的确定 |
| 3.1.6 最佳酶标二抗稀释度及作用时间的确定 |
| 3.1.7 最佳显色时间的确定 |
| 3.1.8 临界值的确定 |
| 3.1.9 特异性试验 |
| 3.1.10 敏感性试验 |
| 3.1.11 重复性试验 |
| 3.2 HPS重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的应用 |
| 3.2.1 进行HPS疫苗接种猪血清样品的免疫抗体检测 |
| 3.2.2 未进行HPS疫苗免疫猪血清样品的感染抗体检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪链球菌研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 毒力因子 |
| 1.3 巴氏杆菌研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 毒力因子 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌研究进展 |
| 1.4.1 病原学 |
| 1.4.2 流行病学 |
| 1.4.3 毒力因子 |
| 1.5 猪肺炎支原体研究进展 |
| 1.5.1 病原学 |
| 1.5.2 流行病学 |
| 1.5.3 毒力因子 |
| 1.6 实验室检测技术 |
| 1.6.1 血清学方法 |
| 1.6.2 分子生物学方法 |
| 1.6.3 多重PCR检测方法 |
| 1.6.4 实时荧光定量PCR检测方法 |
| 1.6.5 微滴数字PCR定量检测方法 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 相关试剂的配制 |
| 3.1.4 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 菌株培养 |
| 3.2.2 细菌、病毒基因组的提取 |
| 3.2.3 反转录 |
| 3.2.4 核酸浓度的测定 |
| 3.2.5 引物设计与合成 |
| 3.2.6 单重PCR退火温度的确定 |
| 3.2.7 单重PCR反应的特异性检验 |
| 3.2.8 单重PCR引物敏感性检验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 单重PCR退火温度的确定 |
| 3.3.2 单重PCR反应中引物特异性检验 |
| 3.3.3 单重PCR反应的敏感性检验 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌种、毒株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 相关试剂的配制 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 五重PCR退火温度确定 |
| 4.2.2 五重PCR引物特异性检验 |
| 4.2.3 五重PCR反应敏感性检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 五重PCR反应退火温度的确定 |
| 4.3.2 五重PCR反应特异性检验 |
| 4.3.3 五重PCR敏感性检验 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 相关试剂的配制 |
| 5.1.4 主要仪器与设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 样品采集 |
| 5.2.2 基因组的提取 |
| 5.2.3 临床样品中猪呼吸系统病原菌的五重PCR检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种、质粒、实验动物、血清 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 HA基因的扩增和表达载体的构建 |
| 1.2.2 HA蛋白的原核表达 |
| 1.2.3 HA蛋白的纯化、复性 |
| 1.2.4 重组蛋白的Western blot分析 |
| 1.2.5 间接ELISA检测方法的建立与初步应用 |
| 1.2.5. 1 间接ELISA方法步骤 |
| 1.2.5. 2 抗原、血清和酶标二抗最佳稀释浓度的确定 |
| 1.2.5. 3 作用时间的优化 |
| 1.2.5. 4 阴/阳性标准临界值的确定 |
| 1.2.5. 5 特异性试验 |
| 1.2.5. 6 敏感性试验 |
| 1.2.5. 7 重复性试验 |
| 1.2.5. 8 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增和重组质粒双酶切鉴定结果 |
| 2.2 重组蛋白原核表达和纯化 |
| 2.4 重组蛋白的Western blot分析 |
| 2.5 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.5.1 抗原包被量及血清和酶标二抗最佳稀释度的确定 |
| 2.5.2作用时间的优化 |
| 2.5.3 阴/阳性标准临界值的确定 |
| 2.5.4 特异性试验 |
| 2.5.5 敏感性试验 |
| 2.5.6 重复性试验 |
| 2.5.7临床样品检测 |
| 3 讨论 |
（9）鼻气管鸟杆菌分离鉴定与OMA87蛋白单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1. 病原学特点 |
| 1.1 分类和血清分型 |
| 1.2 分离培养及染色特性 |
| 1.3 生化特性 |
| 1.4 致病性 |
| 1.5 对药物的敏感性 |
| 2. 流行病学特点 |
| 3. 临床症状 |
| 4. 病理变化 |
| 5. 诊断 |
| 5.1 细菌的分离培养、纯化及鉴定 |
| 5.2 血清学诊断 |
| 5.3 分子生物学诊断 |
| 6 防治措施 |
| 6.1 综合预防 |
| 6.2 药物防治 |
| 6.3 免疫防治 |
| 参考文献 |
| 研究一 肉鸡感染鼻气管鸟杆菌的分离鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 培养基和主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 细菌分离培养 |
| 2.2 革兰氏染色镜检 |
| 2.3 透射电镜观察 |
| 2.4 生化试验 |
| 2.5 细菌DNA模板的制备 |
| 2.6 分子生物学鉴定 |
| 2.7 动物回归试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 细菌的分离培养 |
| 3.2 革兰氏染色镜检 |
| 3.3 透射电镜观察 |
| 3.4 生化试验 |
| 3.5 分子生物学鉴定 |
| 3.6 动物回归试验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 气鼻管鸟疫杆菌OMA87蛋白原核表达及抗原性鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株、质粒和阳性血清 |
| 1.2 工具酶及试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 PCR模板制备 |
| 2.3 OMA87基因的PCR扩增 |
| 2.4 OMA87基因的克隆和筛选 |
| 2.5 OMA87基因原核表达载体的构建 |
| 2.6 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.7 重组蛋白的纯化与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 OMA87基因的PCR扩增 |
| 3.2 原核表达载体鉴定 |
| 3.3 重组菌pGEX-OMA87诱导表达的SDS-PAGE分析 |
| 3.4 重组蛋白的纯化及抗原性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 鼻气管鸟杆菌OMA87蛋白的单克隆抗体制备 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株和蛋白 |
| 1.2 细胞和实验动物 |
| 1.3 细胞培养基及主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 饲养细胞的制备 |
| 2.3 骨髓瘤细胞SP2/O的制备 |
| 2.4 脾淋巴细胞的制备 |
| 2.5 细胞融合 |
| 2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞亚克隆 |
| 2.8 腹水的制备及效价的测定 |
| 2.9 单克隆抗体纯化 |
| 2.10 单克隆抗体的鉴定与检测 |
| 2.11 McAb的初步应用 |
| 3. 结果 |
| 3.1 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.2 腹水效价的测定 |
| 3.3 单克隆抗体纯化 |
| 3.4 单克隆抗体的鉴定与检测 |
| 3.5 McAb的初步应用 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文目录 |
（10）副猪嗜血杆菌实验室诊断方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 细菌分离与鉴定 |
| 2 血清学方法 |
| 3 分子生物学方法 |
| 3.1 普通PCR法 |
| 3.2 实时荧光定量PCR方法 |
| 3.3 环介导等温扩增检测技术 |
| 4 小结 |
四、Dot_ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清抗体的研究（论文参考文献）
- [1]鸭源鸡杆菌平板凝集检测方法的建立与应用[J]. 张玉杰,刘红祥,刘东,张翔,杜元钊. 中国动物检疫, 2021(10)
- [2]A型副鸡禽杆菌Hmtp蛋白的原核表达及其对鸡的免疫原性研究[D]. 施敏捷. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [3]2019～2020年规模化蛋鸡场副鸡禽杆菌的分离鉴定、致病性研究与耐药性分析[D]. 陈秀芳. 扬州大学, 2021
- [4]传鼻康口服液对鸡传染性鼻炎人工感染病例的临床治疗试验[J]. 王贵波,李建喜,罗超应,谢家声,郑继方,辛蕊华,罗永江,李锦宇,李晓蓉. 中兽医医药杂志, 2020(06)
- [5]鸡传染性鼻炎免疫学研究进展[J]. 李倩,蔡俊呈,蔡琳琳,林秋燕,向斌,廖明,徐成刚,任涛,黎敏. 养禽与禽病防治, 2020(08)
- [6]副猪嗜血杆菌重组TbpA间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[D]. 刘晓露. 安徽农业大学, 2020(03)
- [7]猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用[D]. 梁娟. 西南大学, 2020(01)
- [8]A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用[J]. 张曼,韩飞. 动物医学进展, 2017(12)
- [9]鼻气管鸟杆菌分离鉴定与OMA87蛋白单克隆抗体制备[D]. 薛营. 扬州大学, 2017(01)
- [10]副猪嗜血杆菌实验室诊断方法研究进展[J]. 马树芳,赵小勇,程志伟. 山东畜牧兽医, 2017(05)