一、p38信号途径与胃癌细胞阿霉素耐药相关（论文文献综述）
金永哲[1]（2021）在《Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制》文中研究表明胃癌作为引起人类死亡四大癌症之一,对人类的健康状况及生命安全造成了极大的威胁。由于胃癌前期的症状不明显,导致大多数胃癌患者在被诊断出时已经处于疾病的中期或晚期状态。正是这种情况,给胃癌的临床治疗带来了非常大的困难度和复杂性。目前,外科手术切除、放射疗法、化学疗法、靶向疗法和细胞疗法等治疗方法是临床治疗胃癌的主要医学方法。但是由于手术治疗风险大且具有反复性、放疗会对身体正常的组织细胞造成不可逆的损伤、化学药物可能会再治疗癌症的同时产生严重的副作用、细胞治疗手段虽然相对安全可靠,但其高昂的治疗成本和治疗手段相对不成熟的原因,致使胃癌的临床治疗还存在着众多问题。近年来,改变肿瘤局部微环境治疗各类癌症已然成为科学家研究的热点。肿瘤微环境与人体正常内环境的生理活性有很大不同,肿瘤组织的核心部分往往因其大量的细胞增殖长时间处于低氧或缺氧的环境,因此造成癌细胞中的ROS水平急剧上升。细胞内的ROS具有调节细胞的增殖、代谢等作用,与肿瘤的发生与和治疗密切相关。因此,有效地调控癌细胞内ROS水平诱导癌细胞凋亡,是一种治疗胃癌的新的突破口和研究思路。过氧化物还原酶V（Prx Ⅴ）是一种能够清除细胞内ROS并调节细胞凋亡的抗氧化酶,它能降低过氧化氢、烷基过氧化氢和过氧化亚硝酸盐,清除细胞内ROS,维持细胞内氧化还原平衡,减少由细胞内氧化应激引起的氧化损伤,然后激活相关的下游信号通路来调节细胞凋亡。它是过氧化物酶还原酶家族的成员,广泛分布于细胞质、线粒体和过氧化物酶体中,并在多种癌症中异常表达。因此,在本研究中我们利用大黄素和盐酸阿霉素这两种可以引起细胞内ROS水平升高的药物处理人胃癌AGS细胞系,诱导细胞中ROS水平的增加进一步诱导AGS细胞凋亡。同时,我们使用慢病毒载体在基因水平上改变AGS细胞中Prx Ⅴ蛋白水平将其沉默或过表达。为了探究Prx Ⅴ在由于高水平ROS引起的胃癌细胞凋亡过程中的调控作用以及可能存在的作用原理及其机制。第一部分Peroxiredoxin Ⅴ通过ROS/Bc12信号通路抑制大黄素诱导的胃癌细胞凋亡目的:探讨Prx Ⅴ在大黄素诱导胃癌AGS细胞系的细胞凋亡过程中的调控作用。方法:使用DCFH-DA染色通过流式细胞术检测大黄素处理不同时间的AGS细胞中ROS水平的变化。利用Annexin V-FITC和PI双染通过荧光显微照相和流式细胞术检测处理不同时间的大黄素处理AGS细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹法检测大黄素在不同时间处理的AGS细胞中Prx家族蛋白的表达变化。然后加入NAC,即用ROS清除剂预处理细胞后,进行流式细胞仪检测细胞凋亡,然后用蛋白免疫印迹法检测Prx家族每个成员在细胞中蛋白表达水平的变化。利用慢病毒载体转染AGS细胞系,构建可以稳定遗传的空白载体组（Mock）、Prx Ⅴ沉默组（shPrx Ⅴ）和Prx Ⅴ过量表达组（Prx Ⅴ-his）细胞系,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞转染情况。用流式细胞仪检测大黄素在不同时间和浓度下处理的三种细胞的凋亡变化情况和细胞内ROS的变化。通过蛋白质免疫印迹法检测大黄素处理三种细胞不同时间时细胞凋亡相关蛋白质表达情况。结果:大黄素能够显着降低AGS细胞存活率,同时以时间依赖性和浓度依赖性方式显着提高细胞内活性氧水平诱导胃癌细胞发生凋亡,在此过程中蛋白免疫印迹结果显示Prx Ⅴ的表达具有显着性差异;Prx Ⅴ的过度表达可显着降低大黄素诱导的AGS细胞中ROS的水平。同时,Prx Ⅴ的过表达可以调节促凋亡蛋白Bad和Cleaved-PARP的表达状况,并上调抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平。在加入ROS清除剂后细胞内活性氧水平以及细胞凋亡情况明显下降。结论:1.大黄素可以通过增加细胞中ROS的表达水平来诱导AGS细胞凋亡。2.随着大黄素处理时间的增加,AGS细胞中Prx Ⅴ蛋白的表达水平降低。3.Prx Ⅴ表达含量可以调控大黄素诱导AGS细胞凋亡的程度。第二部分沉默Peroxiredoxin Ⅴ基因提高阿霉素诱导的胃癌细胞线粒体依赖性凋亡目的:探究Prx Ⅴ对阿霉素诱导的AGS胃癌细胞凋亡的可能调控作用及其机制。方法:利用慢病毒载体转染AGS细胞系,构建可以稳定遗传的空白载体组（Mock）和Prx Ⅴ沉默组（shPrx Ⅴ）细胞系,利用蛋白质免疫印迹法检测细胞转染情况。利用MTT法检测不同浓度阿霉素处理对两种细胞的细胞存活率的影响,利用Annexin V-PE染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同时间以及不同浓度的阿霉素处理后两种细胞的细胞凋亡情况,利用DHE染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞内ROS水平的产生情况,利用MitoSOX染色通过流式细胞术和荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞线粒体内ROS水平的产生情况,利用JC-1染色通过荧光显微照相检测不同浓度的阿霉素处理后两种细胞线粒体膜电位变化情况,通过蛋白质免疫印迹法检测处理不同浓度时,细胞凋亡相关蛋白质的表达情况。结果:Prx Ⅴ基因沉默可能通过加重细胞内ROS的积累而显着增加阿霉素诱导的细胞凋亡。我们还发现,阿霉素诱导的线粒体ROS水平和膜通透性改变在shPrx Ⅴ细胞中明显高于Mock细胞,并且这些现象在加入NAC显着逆转。Prx Ⅴ基因沉默也显着上调了剪切的Caspase 9、3和Bax相关的细胞死亡相关蛋白表达水平。结论:1.沉默细胞内Prx Ⅴ表达水平可以增加AGS细胞对阿霉素药物的敏感性。2.沉默细胞内Prx Ⅴ表达水平会导致细胞内及线粒体内的ROS水平蓄积增加。3.预处理NAC可以有效缓解由于阿霉素引起的细胞凋亡。
韩笑[2]（2021）在《盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究》文中研究指明目的:2020年全球癌症数据显示,胃癌的发病率全球第五,死亡率居于全球第四,且面临严重的预后及耐药困扰。盐霉素（SAL）是一种广谱抗菌药物,亦具有抗肿瘤特性,特别是盐霉素与化疗或放疗联合使用的协同效应是一个值得探讨的问题。目前SAL如何影响耐顺铂胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡,以及如何逆转癌细胞放疗抵抗及多重耐药,其机制尚不清楚,盐霉素能否对耐顺铂胃癌细胞产生较好的增敏作用目前未见报道。基于此,本实验将盐霉素（SAL）和顺铂（DDP）作用于人胃粘膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901、耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP,确定盐霉素是否能在体外提高耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP对顺铂化疗的敏感性。同时初步探究盐霉素与顺铂联合作用的分子机制及盐霉素对耐顺铂胃癌细胞的增敏机制,从而为改善顺铂耐药和胃癌的治疗新方案的提出提供理论依据,为临床应用提供新的思路。方法:1.CCK-8法检测SAL对SGC-7901、SGC-7901/DDP细胞活力的影响,筛选SAL与DDP单药及联合应用的最佳浓度。2.CCK-8、Transwell及细胞划痕实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞增殖、侵袭、迁移的影响,CCK-8法同时检测SAL对GES-1细胞增殖的影响。3.流式细胞术检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞周期及凋亡的影响。4.免疫印迹实验及免疫组化实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9、Fas-L、NF-κBp65表达的影响,探究SAL诱导凋亡的可能机制。5.免疫印迹实验检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin与靶基因Axin2和CCND1、EMT标记蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达;免疫荧光检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后β-catenin的核定位;探究SAL作用于SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的化疗增敏机制。结果:1.CCK-8法筛选出SAL-8μM与DDP-3μg/m L作用24 h为最佳作用浓度和时间。2.SAL-8μM作用于GES-1细胞24 h抑制率与对照组（0μM）比较差异无统计学意义（P>0.05）;与对照组比较,SAL与DDP分别处理SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞24 h均能显着降低两种细胞的的增殖、侵袭和迁移能力,并显着增加细胞凋亡率（P<0.01）;其中在SGC-7901细胞中,与SAL组相比,DDP组、双药组均显着降低SGC-7901细胞的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显着增加细胞凋亡率（P<0.05）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显着降低SGC-7901/DDP的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显着增加细胞凋亡率（P<0.05）。3.在SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中,DDP处理组中G0/G1期细胞比例均显着高于对照组和SAL组（P<0.01）;同时,SAL处理组中S期细胞比例均显着高于对照组和DDP组（P<0.01）。4.与对照组比较,SAL和DDP分别处理24 h后,SGC-7901和SGC-7901/DDP两种细胞中Caspase 3、Caspase 9、Bax的表达量均显着上调（P<0.01）且Bcl-2的表达量均显着下调（P<0.01）;且与单药组相比,双药联合组表达量变化量更明显（P<0.01）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显着升高Caspase 3、Caspase 9、Bax表达水平（P<0.01）。5.在SGC-7901细胞中,与对照组比较,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,但是DDP组中Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达更明显,双药联合使用未见明显的协同作用;在SGC-7901/DDP细胞中,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,双药联合使用表现出协同作用。6.在SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞中,与对照组比较,SAL处理组N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1蛋白表达量均降低（P<0.01）,而E-cadherin的表达量增高（P<0.01）,β-catenin的核外移增多;与SAL组相比,SAL与Wnt-C59联合处理组两种胃癌细胞中N-cadherin和Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）及β-catenin、Axin2和CCND1的表达量进一步下调（P<0.01）,E-cadherin的含量进一步上调（P<0.01）,β-catenin的细胞核外移进一步增多。7.与SGC-7901比较,SGC-7901/DDP耐药株SAL处理组、SAL与Wnt-C59联合处理组,N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1表达的下调和E-cadherin的上调及β-catenin的核外移程度均增强。结论:1.SAL-8μM作用24 h对人胃粘膜上皮细胞GES-1细胞的无明显抑制作用,但可以抑制胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP的增殖。2.SAL与DDP均能抑制SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡,SAL可调节并增强DDP对胃癌细胞SGC-7901及顺铂耐药细胞SGC-7901/DDP增殖、侵袭、迁移的抑制作用和诱导凋亡作用,两药联合具有协同作用;与SGC-7901不同,SAL、双药联合均比DDP对SGC-7901/DDP迁移抑制、诱导凋亡作用更强。3.DDP可致胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/DDP周期阻滞于G0/G1期,SAL可阻滞于S期,两药可分别作用于不同周期时间点发挥细胞阻滞作用。4.SAL与DDP通过Fas-L通路,上调凋亡相关因子Caspase 3、Caspase 9、Bax、Fas-L并下调Bcl-2的表达,同时抑制核内NF-κBp65的表达来调节胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP凋亡,且仅在SGC-7901/DDP中,两药具有明显协同作用。5.SAL通过下调Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin及靶蛋白Axin2和CCND1等的表达抑制EMT进程,从而抑制肿瘤细胞的侵袭迁移,增加肿瘤细胞对DDP的敏感性,逆转耐药细胞耐药抵抗。
刘芳[3]（2021）在《盐霉素分别联合莱菔硫烷及奥沙利铂抑制结直肠癌的机制研究》文中研究表明研究背景结直肠癌（colorectal cancer,CRC）在全世界内严重威胁着人类的健康,是诊断率较高、侵袭性较强的常见的消化道肿瘤。根据最新的全球癌症发病率及死亡率的统计,结直肠癌发病率位居第三位,死亡率位居第二位。2020年全世界约有193万人新发、93.5万人死于结直肠癌,约占全部癌症的发生率和死亡率的十分之一。我国在2000-2015年间结直肠癌的发病率和死亡率呈现为上升的趋势。结直肠癌的发病率和死亡率的显着上升,使人们的身体健康受到了非常严重的威胁。尽管早期诊断和治疗有所改善,但大约20%的患者诊断时已经出现转移,以及多达50%的非转移性结直肠癌后期出现转移,而在治疗后的结直肠癌患者中大约有三分之一的出现复发。最新《NCCN指南》推荐结直肠癌的中晚期患者采用以手术为主、化疗为辅的治疗方案,将含有奥沙利铂的FOLFOX（5-氟尿嘧啶、亚叶酸钙及奥沙利铂）和CapeOX或XELOX（奥沙利铂及卡培他滨）列为同等优先选择的化疗方案。奥沙利铂为一线抗结直肠癌的化疗药物,在转移性的结直肠癌治疗中发挥较高的应用优势,但近一半的结直肠癌患者因化疗耐药而致生存率下降,由于化疗耐药性的发展和急性或持续性的神经损伤限制了以奥沙利铂为基础的治疗方案的总体成功。因此寻找新的安全性高的药物治疗方法或提高奥沙利铂等原有化疗药物的化学敏感性,达到增敏癌细胞和获得更高的疗效,同时最大限度地减少不良副作用,对提高结直肠癌治疗的有效率、延长结直肠癌患者的无病生存期以及改善预后是十分必要的。莱菔硫烷（sulforaphane,SFN）是硫代葡萄糖苷水解后产生的一种异硫氰酸盐,在十字花科植物中含量丰富,可降低癌症发生的风险,可以从癌症的发生到进展多个阶段阻滞癌细胞的生长发育,在肿瘤防治中有一定价值。莱菔硫烷是植物中具有防癌和抗癌作用的天然活性物质,具备抗癌、抗增殖、促凋亡、抗转移和抗血管生成的作用,是潜在的肿瘤化学治疗的药物。已经证明了莱菔硫烷通过NF-E2相关因子2（Nrf2）介导对有毒药物引起的氧化损伤具有保护作用。相同的莱菔硫烷浓度在正常细胞中具有保护作用,对肿瘤细胞有抑制作用,这表明其在化学疗法中的应用潜力。我们课题组前期的大量的工作已经证实莱菔硫烷可诱导结直肠癌细胞发生凋亡和抑制结直肠癌的增殖,因此我们建议莱菔硫烷作为一种新型的抗癌药物用于人类结直肠癌患者的治疗。盐霉素（salinomycin,SAL）是从白色链霉菌菌株产生、提取出来的一种高效、广谱、低耐药性、排泄迅速和低残留的单羧酸聚醚抗生素。盐霉素可通过多种机制抑制结直肠癌,能克服多种肿瘤细胞对化疗药物的耐受,可诱导耐顺铂的结肠癌细胞发生凋亡,显着促进吉西他滨耐药的胰腺癌细胞发生凋亡等。对正常细胞影响较小,可杀伤多药耐药的癌细胞及肿瘤干细胞,能降低癌细胞的转移和侵袭。盐霉素目前已被鉴定为强力的化学增敏剂。本研究设计了盐霉素分别联合莱菔硫烷及奥沙利铂联合化学治疗的模型,通过盐霉素、莱菔硫烷与奥沙利铂单独应用对结直肠癌细胞存活率的作用,进一步明确盐霉素与莱菔硫烷或奥沙利铂联合用药的相互作用;通过体外实验研究联合用药后对细胞的生长、细胞的形态、细胞周期、细胞凋亡、细胞的迁移侵袭能力等的影响以及探讨其相关的作用机制,体内实验通过裸鼠皮下成瘤的实验进一步验证。第一部分盐霉素联合莱菔硫烷抑制结直肠癌的机制研究研究目的1.研究盐霉素联合莱菔硫烷对结直肠癌细胞的活性和生物学功能的影响。2.研究盐霉素联合莱菔硫烷抑制结直肠癌细胞的增殖和促进其凋亡的分子机制。3.研究盐霉素联合莱菔硫烷在体内对结直肠癌的抑制效果。研究方法1.检测药物对结直肠癌细胞的活性的影响:梯度浓度的盐霉素或莱菔硫烷作用于Caco-2和CX-1细胞,利用MTT实验来检测各药物浓度在不同时间点的细胞活性。根据结果,共选择12个药物组合,MTT实验检测细胞活性变化,计算两药之间的联合用药指数,选择单药浓度。2.检测盐霉素与莱菔硫烷联合用药对结直肠癌细胞相关的生物学行为的影响:应用EdU实验检测对照组、盐霉素组、莱菔硫烷组及联合组对结直肠癌细胞的增殖能力的影响;应用流式细胞术检测各个处理组对结直肠癌细胞凋亡率的变化;应用Transwell小室法检测各个处理组的迁移和侵袭的能力。3.检测联合用药引起结直肠癌细胞凋亡的机制:应用蛋白质印迹检测各个处理组对通路的及凋亡的相关蛋白表达的影响;应用免疫荧光法检测各个处理组对p-Akt的影响;应用PI3K/Akt通路抑制剂处理后,对盐霉素和莱菔硫烷联用组中细胞凋亡蛋白和细胞活性的影响。4.检测盐霉素和莱菔硫烷联用对裸鼠异种移植瘤的影响:裸鼠皮下移植瘤成功后,进行腹腔注药、测量,绘出肿瘤的生长曲线,进一步验证盐霉素和莱菔硫烷在体内的作用。研究结果1.细胞活性的变化:盐霉素和莱菔硫烷单独处理结直肠癌细胞,对细胞活性的影响呈现出浓度及时间依赖性;12组盐霉素和莱菔硫烷的药物组合表现出协同作用。2.选取盐霉素5 μM和莱菔硫烷10 μM进行下一步实验,结果如下:2.1结直肠癌细胞分为对照组、莱菔硫烷组、盐霉素组和莱菔硫烷与盐霉素组,EdU实验检测显示:莱菔硫烷与盐霉素组细胞的细胞增殖较莱菔硫烷组、盐霉素组和对照组明显降低。2.2流式细胞术检测的结果显示,盐霉素联合莱菔硫烷明显促进了结直肠癌细胞的凋亡;Western Blotting结果显示,盐霉素联合莱菔硫烷可使Bcl-2表达的明显的减少,而p53、Bax和cleaved PARP表达的明显的增多;RT-qPCR结果显示,联合用药使Bcl-2 mRNA明显的减少,BaxmRNA明显的增多,与对照组、莱菔硫烷组和盐霉素组之间的差异均具有统计学的意义。2.3 Transwell显示,联合用药组比对照组和单药组明显地抑制了结直肠癌细胞的迁移的和侵袭的能力。3.检测盐霉素与莱菔硫烷联用对PI3K/Akt的影响3.1与对照组和单药处理组相比,盐霉素与莱菔硫烷明显地抑制了 PI3K及p-Akt的表达。3.2免疫荧光法显示盐霉素和莱菔硫烷组中p-Akt明显减少。3.3预先应用LY294002处理,可使盐霉素与莱菔硫烷组中p-Akt明显减少,cleaved PARP明显增多,且细胞的活性明显的降低。差异均具有统计学意义。4.体内抗肿瘤作用检测:单独给予盐霉素或莱菔硫烷治疗,可以抑制皮下肿瘤的生长,但联合应用两种药物则可以明显阻断肿瘤的生长并减少肿瘤的体积和重量,差异有统计学意义。对照组、莱菔硫烷组、盐霉素组和联用组中,裸鼠的体重没有显着变化,差异没有统计学的意义。研究结论1.盐霉素或莱菔硫烷单独应用对结直肠癌细胞活性的抑制作用呈现出时间的和浓度的依赖性,盐霉素与莱菔硫烷联用协同地抑制结直肠癌的活性。2.盐霉素与莱菔硫烷联合应用显着诱导结直肠癌细胞的凋亡、抑制结直肠癌细胞的增殖及迁移和侵袭。3.盐霉素和莱菔硫烷联合应用促进结直肠癌凋亡和抑制增殖是通过抑制PI3K/Akt通路发挥作用的。4.盐霉素与莱菔硫烷联合应用能显着抑制结直肠癌体内成瘤的能力,且无明显毒性。第二部分盐霉素联合奥沙利铂抑制结直肠癌的机制研究研究目的1.研究盐霉素联合奥沙利铂对结直肠癌的细胞毒性的作用和生物学功能的作用。2.研究盐霉素与奥沙利铂联用抑制结直肠癌的增殖和诱导其凋亡的分子机制。3.研究盐霉素与奥沙利铂联用对体内结直肠癌生长的作用。研究方法1.检测奥沙利铂或盐霉素对结直肠癌的细胞毒性的作用:MTT实验检测各梯度浓度的盐霉素或奥沙利铂分别作用于结直肠癌Caco-2和SW480细胞的存活率。2.盐霉素和奥沙利铂联用对结直肠癌的生物学行为的作用:应用MTT实验检测不同浓度的两种药物联用后的结直肠癌细胞的存活率,选择两种药物联用的单药浓度;应用平板克隆形成的实验,检测对照组、奥沙利铂组、盐霉素组和两药联用组的平板克隆形成的能力;应用流式细胞仪检测进行相应处理后细胞的凋亡和细胞周期的分布。3.利用显微镜观察各组进行相应处理后的结直肠癌的细胞形态变化。4.盐霉素与奥沙利铂联用后引起结直肠癌细胞的活性氧和线粒体膜电位的变化:结直肠癌细胞进行分组的相应处理后,利用DCFH-DA探针和JC-1染色分别进行检测。5.盐霉素与奥沙利铂联用对线粒体途径凋亡的蛋白的影响:应用Western Blotting检测各处理组的表达情况。6.奥沙利铂与盐霉素联用对MAPK通路的作用:将结直肠癌细胞分为对照组、盐霉素和奥沙利铂组及NAC与两药联用组,分别进行相应处理后,检测各处理组的凋亡变化;将结直肠癌细胞分为对照组、单独用药组、两药联用组及NAC与两药联用组,分别进行相应处理后,应用Western Blotting检测MAPK通路的相关的蛋白的表达。7.奥沙利铂和盐霉素联用对裸鼠结直肠癌移植瘤的研究:裸鼠皮下成瘤后,随机分组,腹腔注射相应药物,最终分离瘤体,检测各个处理组中肿瘤组织中的Ki-67和p-ERK的表达。研究结果1.细胞存活率检测:梯度浓度的盐霉素或奥沙利铂作用于结直肠癌细胞,结直肠癌细胞存活率下降,且具有浓度和时间依赖性。MTT检测15组两种药物的组合,均显示两药之间的作用表现为协同。与对照组和单独用药相比,奥沙利铂和盐霉素两药联用后的细胞的存活率显着地降低,这种差异有统计学的意义（P<0.001）,SW480较Caco-2细胞对联合治疗效果更加地明显。2.细胞增殖检测:与对照组和单独用药相比,两药联用的克隆数量明显地减少,细胞增殖显着地减慢（P<0.001）。3.细胞凋亡检测:流式细胞术检测两种细胞系联合用药后的细胞的凋亡较其余各组明显地增多（P<0.001）。4.细胞周期检测:与对照组相比,两药联用组的G0/G1期的细胞明显地增多,G2/M期和S期的细胞减少。说明盐霉素与奥沙利铂联用能够将结直肠癌阻滞在G0/G1 期。5.细胞迁移能力检测:划痕实验的结果显示盐霉素组和奥沙利铂组在24h的划痕的愈合率与对照组的无明显的差异,在48h的划痕的愈合率与对照组的差异具有统计学的意义,两药联用组与对照组和单独用药相比在24和48小时均明显地降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）;Transwell实验结果显示:与对照组和单独用药组相比,两药联用组的结直肠癌细胞迁移入Transwell下室的细胞明显地减少（P<0.001）。6.细胞形态检测:与对照组和单独用药相比,两药联用后的细胞的数量明显地减少,出现皱缩、变圆和脱落等,细胞的体积出现缩小及变形,细胞与细胞之间的连接消失,与周围的其它细胞出现脱离等。7.细胞活性氧检测:盐霉素和奥沙利铂联用组的细胞内的活性氧含量比对照组、两药单药组明显地增多。8.线粒体膜电位检测:盐霉素与奥沙利铂联用组较对照组和单独用药组的细胞内的绿色荧光显着地增多,显示出线粒体膜电位的降低,去极化的比例增大,其差异具有统计学的意义。9.线粒体途径凋亡的相关蛋白的检测:与对照组相比,Bax、cytochrome c、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP在盐霉素组或奥沙利铂单药组表达增加,但两药的联合用药组增加的更为显着（P<0.05）,而Bcl-2减少的更为显着。10.MAPK通路相关检测:提前应用还原剂NAC可以使两药联用引起的细胞凋亡减少（P<0.01）;预先加入NAC处理的联用组较联用组,p-ERK、p-p38和p-JNK表达均降低（P<0.05）。说明细胞内的活性氧大量产生后,可激活MAPK通路。11.体内抗肿瘤作用检测:与对照组和单药组相比较,盐霉素与奥沙利铂联用在体内可更明显地抑制裸鼠移植瘤的体积和重量,对结直肠癌生长的抑制效果最突出;免疫组化实验显示:药物联用组的Ki-67表达的明显减少,而p-ERK表达的明显增多。研究结论1.盐霉素和奥沙利铂联用能显着地增强奥沙利铂对结直肠癌细胞活性的抑制作用,两药之间表现为协同作用。2.盐霉素和奥沙利铂联用显着的抑制结直肠癌的增殖、促进其凋亡、阻滞其细胞周期和抑制迁移能力。3.盐霉素和奥沙利铂联合应用抑制结直肠癌生长是通过抑制结直肠癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡共同来实现的。4.盐霉素与奥沙利铂联用诱导结直肠癌细胞的凋亡和抑制细胞增殖是通过产生大量活性氧而引起的线粒体凋亡途径的激活,并同时引起MAPK通路激活共同来实现的。5.盐霉素和奥沙利铂联用能显着地增强奥沙利铂抗结直肠癌的作用,提高结直肠癌细胞及裸鼠移植瘤对奥沙利铂化疗的敏感性。
王旭[4]（2021）在《GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究》文中进行了进一步梳理研究背景:胃癌（gastric carcinoma）是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一,其起源于胃腔内的粘膜上皮组织。据2021年资料数字统计,去年全球范围内新确诊胃癌的患者高达108万例,占比5.6%,位居第5位,因罹患胃癌而死亡的患者累计有76万例,高居恶性肿瘤死亡排行榜第4位。据2020年中国癌症年报统计,我国胃癌新发病几率和死亡人数均高居第三位。早期胃癌患者因无明显的症状通常被忽略,其具有隐蔽性且无特异性,可时隐时现,也可长期存在,等出现不适症状时就诊已确诊进展期,这也和由我国医学卫生资源的分配不平衡且癌症普查率较低有着密切关系,此时罹患胃癌的患者遗憾地错过了最佳的手术根治时机,临床上针对进展期胃癌患者则采用化学治疗、放射治疗、生物靶向精准治疗等综合治疗。同时由于胃癌对放疗的不敏感,而且放疗产生较多的副作用限制了放疗的使用,内科多线综合化疗已然成为治疗中晚期胃癌的主要手段之一,希望能以此延长患者的生命周期,提高患者的生活质量。对于早期胃癌患者,即使有机会行根治性手术,大约有80%的早期胃癌患者在手术根治治疗后的3年内出现局灶复发或远处脏器侵袭转移,其5年生存率低于30%。而中晚期胃癌的首选治疗方案是内科综合化疗,国内外多项研究表明:肿瘤多药耐药（multi drug resistance,MDR）是造成肿瘤内科化疗无效的关键因素。肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞在一种抗癌药物治疗后所产生的耐药性,后期该肿瘤细胞对其它未曾接触过的、作用机制及分子结构完全不同的其它抗癌药物也同时产生交叉耐药的一种现象。肿瘤多药耐药分为天然耐药和获得性耐药。多因素共同导致的胃癌细胞对抗癌药物产生耐药性是当下治疗中晚期胃癌患者十分突出的问题。因此,如何克服肿瘤细胞的多药耐药,更进一步提高抗癌药物的疗效已然成为目前治疗肿瘤亟待解决的问题,进一步深入的研究胃癌细胞耐药所产生的分子机制、寻求能运用于临床的药物及方法,是研究胃癌治疗的重要契点。随着多种用于临床治疗的手段不断被发明和发展,特别是针对肿瘤治疗的方式也日益丰富,除手术、化疗、放疗外,新型的介入治疗学使肿瘤患者在整个治疗过程中受益。靶动脉灌注化疗是联合穿刺、插管,在X线引导下将导管精准地选择性插入瘤灶的供血靶动脉内,通过DSA对病灶的部位、数量、形态等进行分析、诊断后,将高浓度的抗癌药物通过导管精准地直接灌注于瘤体,而除瘤体外其它组织器官药物浓度低,极大地降低全身副反应。从19世纪80年代开始,有研究者开始尝试使用通过靶动脉精准局部灌注化疗药物以此来治疗食道恶性肿瘤,研究发现通过靶动脉灌注化疗药物的治疗方法能够显着提高抗癌治疗疗效,且副反应明显小于传统化疗。维拉帕米（Verapamil,VER）是一类Ca2+通道阻滞剂,是治疗心脏病的常见药物,同时维拉帕米也是早期发现的可以通过改变细胞内药物浓度从而降低肿瘤耐药性的药物。既往研究认为VER主要是通过抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达及活性来实现抗肿瘤多药耐药的,然而,近来多数研究发现VER还可通过其他非经典途径来增加其抗耐药性。体外实验表明,VER对多数肿瘤细胞具有抗耐药性,且有效作用浓度为6.0～10.0 μmol/L,但静脉用VER的安全浓度为1.0～2.0 μmoL/L,超出此范围则会导致心率下降、血压下降、房室传导阻滞等严重的不良反应,导致VER作为肿瘤耐药逆转剂不能在临床治疗晚期恶性肿瘤中广泛应用。本课题组通过前期犬实验证实,当VER在组织浓度是外周静脉血浓度的50-100倍时,VER能成功逆转肝恶性肿瘤的多药耐药,且实验犬未发生不良的心血管反应。本研究采用靶动脉灌注VER联合静脉应用抗癌药物治疗中晚期胃癌患者,结果表明能显着提高治疗疗效,但仍有近30%的患者治疗效果不理想。因此,寻找VER逆转肿瘤细胞耐药的关键基因,以期增强其疗效成为亟待解决的问题。有学者提出寻找凋亡相关因子,并验证其为肿瘤细胞多药耐药的新靶点。研究表明,抗凋亡基因Bcl-2在肿瘤耐药形成过程中表达量明显增高,导致肿瘤细胞的多药耐药。这些基因相互作用调控细胞的凋亡程序的同时,也在细胞耐药中也有一定影响。葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylcemmide synthase,GCS）是神经酰胺代谢合成葡糖脑苷脂的关键酶,其活性增高可导致肿瘤细胞获得性多药耐药的产生。本团队前期研究表明VER能够逆转部分晚期恶性肿瘤细胞的多药耐药。本研究通过筛选出有效预测VER逆转化疗耐药能力的个体差异的分子标志物,将为TACE+VER联合使用提供临床疗效预测手段和理论依据,对于完善VER个体化治疗有着重要意义。本课题组前期研究通过实时荧光定量PCR及Western blotting实验表明化疗联合VER通过抑制Bcl-2表达及活性从而促进恶性肿瘤细胞的凋亡、增强细胞对化疗敏感性,但其中的具体作用机制有待进一步深入研究,旨在寻找与VER逆转恶性肿瘤细胞耐药的关键基因,为靶动脉灌注VER治疗胃恶性肿瘤提供理论依据。第一章胃癌细胞hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究目的:探讨在胃癌细胞株中,hMDR1/P-gp水平与VER抗耐药能力差异的相关性。方法:1.实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测hMDR1/P-gp在3株胃癌细胞株（差分化人胃癌细胞株AGS、低分化人胃癌细胞株BGC-823和中分化人胃癌细胞株SGC-7901）中表达水平;2.CCK-8法分别检测不同胃癌细胞株对抗癌药物（5-Fu、ADM、DDP）的敏感性;3.CCK-8法分别检测胃癌细胞株对VER联合上述3种抗癌药物的药物敏感性;4.VER逆转胃癌化疗耐药能力的判断。结果:1.hMDR1/P-gp在基因和蛋白层面的表达水平在不同分化程度的胃癌细胞株中的表达水平差异明显,与SGC-7901相比,AGS中的表达量最高;2.BGC-823和AGS对顺铂耐药性大于SGC-7901;SGC-7901和AGS对阿霉素耐药性显着大于BGC-823,SGC-7901和AGS对5-氟尿嘧啶耐药性大于BGC-823;3.用固定浓度的VER（4.91μg/mL）联合抗癌药物分别处理胃癌细胞,均不同程度降低了胃癌细胞对3种抗癌药物的IC50值,提示VER提高了抗癌药物的敏感性;4.在SGC-7901细胞中,VER逆转ADM化疗耐药能力最强（Relative IC50=6.77）,与BGC-823细胞相比有显着性差异（Relative IC50=1.66）。结论:hMDR1/P-gp水平与VER逆转胃癌细胞对ADM化疗耐药能力之间无相关一致性。第二章胃癌耐药细胞株的构建并验证其耐药效率目的:建立人胃癌SGC-7901/5-Fu耐药细胞株。方法:应用间歇作用体外诱导法构建胃癌耐5-Fu细胞株SGC-7901/5-Fu,反复短期暴露并逐步增加5-Fu的浓度,每月做相关检测,CCK-8法对药物的敏感性进行检测,并在耐药细胞株成功构建后第3天、第15天、后每间隔15天对其稳定性进行检测。结果:经历6个月建成人胃癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株SGC-7901/5-Fu,并与ADM抗癌药存在交叉耐药。结论:SGC-7901/5-Fu细胞株具有耐药性,且耐药性稳定。第三章介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异性基因的筛选、验证及机制研究目的:筛选出介导VER逆转胃癌细胞化疗耐药能力的差异基因并验证,初步探讨其作用机制。方法:1.通过生物信息学分析及文献资料筛选出可能的差异基因;2.实时荧光定量PCR/Western blot法检测候选基因/蛋白在胃癌细胞中的表达;3.GCS基因表达沉默或过表达后,CCK-8法检测VER逆转胃癌耐药细胞对ADM化疗耐药能力的变化;4.GCS基因表达沉默及过表达后,Annexin V-PI双染法检测VER促胃癌细胞凋亡能力的变化。结果:1.我们筛选出8个候选基因,分别为hMDR1、LRP、GST-π、GCS、TOPO Ⅱ、PrPc、MGr1-Ag、CIAPIN1;2.实时荧光定量PCR验证表明经过VER处理后,LRP、GCS、TOPOⅡ的表达存在差异,其中GCS差异最为明显（p<0.01）;3.western blot验证经VER处理后GCS蛋白表达存在差异,结合实时荧光定量PCR结果,本研究着重从GCS出发,初步探讨其参与调控VER逆转耐药的可能机制;4.在SGC-7901和SGC-7901/5-Fu、SGC-7901/ADM细胞株中,过表达GCS基因（pEGFP-GCS）,VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力明显减弱,表达沉默GCS基因（siR-GCS）,VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力明显增强;5.过表达GCS基因（pEGFP-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡能力明显减弱,表达沉默GCS基因（siR-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡能力较前增强;6.western blot法检测沉默GCS基因（siR-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡蛋白Bcl-2及ERK表达量明显减弱。结论:GCS介导了 VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力差异,VER可能通过改变GCS基因表达水平,可明显改变其逆转ADM化疗耐药及促进细胞凋亡能力。第四章 临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌组织样本中的表达目的:临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌两组极端病例（治疗明显好转组/治疗疾病进展组）组织样本中的表达。方法:1.选取2014.1-2017.12入住我院就诊中晚期胃癌患者11例,均经胃镜技术提取病变标本,病理证实为胃癌,每位患者每月介入1次共介入2-4次,评估患者治疗疗效,分为两组:维拉帕米抗耐药治疗有效组（治疗明显好转病例,CR）7例,维拉帕米抗耐药治疗无效组（治疗疾病进展病例,PD）5例;2.免疫组化法检测P-gp、GCS蛋白在两组胃恶性肿瘤组织样本中的表达。结果:1.P-gp蛋白主要表达于癌细胞胞浆/胞膜中,有效组的P-gp蛋白平均光密度值与无效组比较无明显差异;2.GCS蛋白主要表达于癌细胞胞核/胞浆中,在癌组织中,有效组的GCS平均光密度值明显低于无效组（p<0.01）。结论:1.维拉帕米抗耐药治疗有效组P-gp蛋白表达水平与无效组比较无明显差异;2.维拉帕米抗耐药治疗有效组GCS蛋白表达水平明显低于抗耐药治疗无效组。
吴喆[5]（2021）在《扶正解毒方调控肿瘤相关成纤维细胞cGAS/Wnt16b/β-catenin轴介导癌细胞干性化逆转耐药的研究》文中研究说明研究背景:胃癌（gastric cancer,GC）是我国最常见的恶性肿瘤之一,大部分患者在就诊时已处于进展期,因此化疗是基础的治疗手段。肿瘤复发转移是胃癌患者的主要死因之一,而耐药是关键原因。研究表明化疗药物在杀伤癌细胞的同时不可能避免的影响了肿瘤微环境（TME）中的其他细胞,如肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAFs）,加速了耐药的形成。当化疗药物损伤DNA后会造成CAFs衰老,产生的衰老相关分泌表型（SASP）是CAFs引起耐药的重要机制。环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cGAS）是细胞质中重要的DNA感受器,在识别胞质中内源性DNA后通过下游信号转到激活核转录因子κB（NF-κB）促进多种因子表达,其中包括Wnt16b。Wnt16b是Wnt/β-catenin通路的配体之一,在化疗后的CAFs中高表达,通过激活癌细胞内β-catenin促进癌细胞干性化,而肿瘤干细胞（CSCs）是引起耐药的关键。因此调控cGAS/Wnt16b//β-catenin轴对于提高化疗效果具有积极的意义。扶正解毒方是中国中医科学院广安门医院肿瘤科治疗肿瘤复发转移的有效方。前期研究表明该方能够提高化疗对荷瘤小鼠模的治疗效果,机制与调节TME中另一主要细胞群体肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）亚群比例,抑制血管生成,改善肿瘤免疫抑制有关。本实验将进一步研究该方提高化疗效果的机制是否与调控CAFs功能有关。研究目的:通过构建化疗诱导后DNA损伤的CAFs模型,及CAFs/癌细胞荷瘤小鼠模型,从体内、外观察CAFs的促耐药作用及探索扶正解毒方的能够通过调控cGAS/Wnt16b//β-catenin 轴改善耐药。研究方法:基础实验研究分为三个部分:一、建立并评价DNA损伤的CAFs模型;二、观察扶正解毒方对cGAS/Wnt16b//β-catenin轴介导胃癌耐药的影响;三、构建5-FU耐药的荷瘤小鼠模型,观察扶正解毒方的干预作用,探索相关机制。1.建立并评价DNA损伤的CAFs模型①以MRC-5为CAFs,以5-FU为诱导药物,通过CCK8法筛选合适的干预条件。②通过免疫荧光法检测DNA损伤MRC-5（dMRC-5）中DNA损伤标志物γH2AX的表达情况。③通过Annexin V/PI双染法检测dMRC-5细胞凋亡情况。④通过qRT-PCR法检测dMRC5中cGAS基因表达情况。2.观察扶正解毒方对cGAS/Wnt16b//β-catenin轴介导胃癌耐药的影响①制备扶正解毒方含药血清,20只SD大鼠分为对照组和扶正解毒组,分别与纯水及扶正解毒方溶液（0.33g/ml）灌胃,连续5次后取腹主动脉血。②Western-blot法检测MRC-5及不同干预后dMRC-5中cGAS表达。③免疫荧光法检测MRC-5及不同干预后dMRC-5中Wnt16b表达。④收集MRC-5及不同干预后dMRC-5的条件培养基（CM）,培养胃癌细胞系MKN45细胞,CCK8检测IC50。⑤Western-blot检测各组别CM培养后MKN45中β-catenin表达。3.构建5-FU耐药的荷瘤小鼠模型及扶正解毒方抗肿瘤作用研究。①以非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠为载体,分别接种MKN45及MKN45/dMRC-5,其中单独荷瘤小鼠设立对照组及5-FU组,混合荷瘤小鼠设立对照组、5-FU组、扶正解毒组及扶正解毒+5-FU组。②比较单独荷瘤小鼠和混合荷瘤小鼠对照组瘤重,单独荷瘤小鼠和混合荷瘤小鼠5-FU治疗效果及抑瘤率评价模型构建情况。③比较混合荷瘤小鼠各组平均瘤重及抑瘤率,评估扶正解毒方的抗肿瘤作用。④免疫组化法检测各组小鼠肿瘤组织中CD44表达。⑤Western-blot法检测各组小鼠肿瘤组织中β-catenin表达。研究结果:1.5-FU 0.8mM诱导72h后MRC-5中γH2AX阳性细胞比率大于90%,活细胞比率大于65%,cGAS表达显着高于对照组,完成了 dMRC-5的构建。2.与MRC-5相比,dMRC-5中cGAS表达明显增加（P<0.0001）,干预后dMRC-5中cGAS含量依次为对照组>BS组>FS组>G150组>空白组。3.与MRC-5相比,dMRC-5中Wnt16b表达明显增加（P<0.001）。干预后各组dMRC-5中Wnt16b含量依次为对照组>BS组>G150组>FS组>空白组。4.MKN45经MRC-5 CM及各组dMRC-5 CM培养后IC50呈不同程度的上升,依次为:对照组>BS组>正常组>G150组>FS组>空白组。5.与空白组相比,MRC-5 CM各组及dMRC-5 CM培养后MKN45细胞中β-catenin表达显着增加（P<0.0001）,依次为对照组>BS组>G150组>FS组>正常组>空白组。6.混合荷瘤小鼠对照组平均瘤重大于单独荷瘤小鼠,混合荷瘤小鼠5-FU组抑瘤率低于单独荷瘤小鼠5-FU,完成5-FU耐药荷瘤小鼠模型构建。7.混合荷瘤小鼠各组平均瘤重依次为:对照组>5-FU组>扶正解毒组>扶正解毒+5-FU组。扶正解毒+5-FU组平均瘤重低于对照组（P<0.01）。8.混合荷瘤小鼠各组抑瘤率依次为:扶正解毒+5-FU组>扶正解毒组>5-FU组>对照组。9.混合荷瘤小鼠及单独荷瘤小鼠5-FU组肿瘤组织CD44表达均高于各自的对照组（P<0.01）。混合荷瘤小鼠组内CD44表达依次为:5-FU组>扶正解毒组>扶正解毒+5-FU组>对照组。10.单独荷瘤小鼠5-FU组β-catenin含量高于对照组（P<0.01）。混合荷瘤小鼠组内β-catenin含量依次为:5-FU组>对照组>扶正解毒+5-FU组>扶正解毒组。研究结论:1.5-FU处理后MRC-5中cGAS及Wnt16b过表达,抑制cGAS后Wnt16b表达减少。2.扶正解毒方能够抑制dMRC-5介导的癌细胞干性化从而改善耐药,机制与调控 cGAS/Wnt16b//β-catenin 轴有关。3.dMRC-5在体内可促进肿瘤生长及耐药,扶正解毒方提高化疗效果的机制可能与抑制β-catenin表达,减少癌细胞干性化有关。
程修强[6]（2020）在《DUSP14在胃癌中的临床意义及通过EMT促进侵袭转移的机制研究》文中认为背景胃癌是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤,2018年全球新增病例超过100万例,其中以我国发病率最高,目前也是全球癌症死亡的第二大原因。双特异性磷酸酶（Dualspecificity Phosphatase,DUSPs）是一组与人类疾病相关的异质性酶,属于I类基于半胱氨酸的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）基因超家族。DUSP家族被报道广泛参与乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等多种肿瘤的发生发展、耐药等生物学过程。但目前为止,DUSP14与胃癌之间的关系尚未明确。目的本研究拟首先了解DUSP14在胃癌和癌旁组织中的m RNA和蛋白表达情况,从而进一步根据其免疫组化的表达水平,了解DUSP14的表达与患者临床病理信息和预后的关联性。其次,我们从细胞层面探讨DUSP14在胃癌细胞系中的表达水平及其对胃癌侵袭和转移能力的影响。再次,我们通过上皮间质转化相关标记物的检测,了解DUSP14在胃癌侵袭转移中可能涉及到的机制。以期了解DUSP14在胃癌发生发展中的作用。方法1.通过GEPIA在线数据库分析DUSP14在TCGA胃癌数据库中胃癌和癌旁组织的m RNA表达水平;使用含有75例术前诊断为胃癌的新鲜肿瘤标本和癌旁标本制作的组织芯片了解DUSP14在胃癌和癌旁组织的表达和细胞定位情况。2.通过Kaplan–Meier Plotter在线数据库对DUSP14在TCGA胃癌数据库中的预后价值进行评估。通过组织芯片的免疫组化染色评分进一步评估DUSP14与胃癌临床病理参数和预后的关系。3.通过Western Blot了解DUSP14在人类正常胃粘膜细胞系GES-1和胃癌细胞系MKN45,MGC803,AGS,HGC27中的表达水平。构建敲减DUSP14的胃癌细胞系MKN45和MGC803。而后通过划痕实验和Transwell实验,以了解DUSP14对胃癌细胞的侵袭和转移能力的影响。4.通过对shDUSP14和shNC检测了E钙黏蛋白、N钙黏蛋白的表达水平,以明确DUSP14对胃癌侵袭转移能力的影响是否与激活EMT通路有关。结果1.通过GEPIA在线数据库分析了胃癌的TCGA数据,结果表明DUSP14在408例胃癌中m RNA表达水平显着高于211例癌旁组织。在75例胃癌和癌旁组织的组织芯片中,有53例高表达,22例低表达。DUSP14在胃癌细胞中主要定位于细胞的胞核和胞浆,在胃癌癌旁组织中表达较少。2.通过Kaplan-Meier Plotter分析了胃癌的TCGA数据,结果表明DUSP14在448例胃癌患者中高表达,预后明显差于428例低表达胃癌患者,P=0.00028,差异有统计学意义。DUSP14高表达组患者的肿瘤分化低、淋巴结N2和N3分期、TNM分期III期和IV期的构成比均显着高于低表达组,差异有统计学意义。而与两组患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位和T分期无显着统计学差异。DUSP14高表达患者的总生存时间明显低于低表达患者（Log Rank=10.60,P<0.05）。单因素分析结果表明肿瘤低分化和未分化、TNM分期III期和IV期以及DUSP14高表达的患者预后较差,多因素分析结果表明DUSP14的高表达是胃癌患者预后差的独立危险因素。3.DUSP14在人类正常胃粘膜细胞系GES-1的表达水平显着低于MKN45,MGC803,AGS,HGC27胃癌细胞系。细胞划痕实验结果表明DUSP14显着促进了胃癌细胞的迁移能力。Transwell实验结果表明DUSP14也显着促进了胃癌细胞的侵袭能力。4.与空白对照组相比,在敲减DUSP14的胃癌细胞系中E钙黏蛋白表达水平明显增高,N-钙黏蛋白表达水平显着下降。表明DUSP14对胃癌侵袭转移能力可能与激活EMT通路有关。结论1.DUSP14在胃癌组织中高表达,且其高表达与肿瘤低分化和未分化、淋巴结N2和N3分期、TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期显着相关。2.DUSP14促进了胃癌的肿瘤进程,与患者不良总生存时间呈正相关,多因素分析显示DUSP14的高表达是胃癌患者预后差的独立危险因素。3.DUSP14通过EMT途径促进了胃癌侵袭和转移的表型,促进了肿瘤的生物学进程。
夏红[7]（2020）在《DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制》文中研究说明二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）是大蒜中烯丙基硫化物的一种疏水性的有效药用成分,对多种肿瘤有明显的抑制作用,是一种很有开发潜力的抗肿瘤候选药物。人类DJ-1基因,又名RS/PARK7/CAP1,是PARK7基因编码的属于肽酶C56的蛋白质家族的一个成员。参与转录调控、氧化应激反应、线粒体调节、炎症以及糖基化损伤等许多生物学过程,在多种肿瘤中高表达,调控肿瘤进展、临床侵袭性、分化、癌细胞形态和药物敏感性,在癌症中扮演着关键角色。我们前期在鉴定二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）诱导白血病HL-60细胞分化的差异蛋白质中,发现DJ-1蛋白明显下调。本研究在DADS抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭的基础上,进一步探讨DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性,证实DJ-1是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一,为临床胃癌分子靶向治疗提供理论依据。第一部分:DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义目的:探讨DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及相应的临床病理意义。方法:采用免疫组织化学方法分别检测组织芯片中胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织中DJ-1、PTEN与p-AKT的表达。结果:DJ-1和p-Akt在胃癌组织中均呈高表达,与正常胃黏膜与癌旁组织相比,差异具有显着性意义（P<0.05）。并且,在癌旁组织表达明显高于正常胃黏膜（P<0.05）。在淋巴结转移组表达明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显低于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。但在高分化、中分化、低分化胃腺癌中表达无显着性差异（P>0.05）。PTEN在正常胃粘膜组织中表达明显高于癌旁组织与胃癌组织（P<0.05）,在癌旁组织表达显着高于胃癌组织（P<0.05）。在淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显高于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。而在高分化、中分化、低分化胃腺癌的表达具有显着差异（P<0.05）。三种蛋白在不同年龄和性别间表达无显着性差异（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析表明,DJ-1高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈负相关（P<0.05）。而PTEN高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈正相关（P<0.05）。小结:1.DJ-1与p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌分化、淋巴结转移和TNM分期有关。3.DJ-1在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈负相关;PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈正相关。第二部分:DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭目的:探讨DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞系增殖、EMT和侵袭的影响。方法:建立DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系,分别采用CCK-8、划痕实验、侵袭实验、q RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等分析DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞增殖、EMT和侵袭的作用。结果:Western blot检测发现,经DADS 30mg/l处理24h后的各组胃癌细胞,和对照组相比,DJ-1的表达显着降低,其中,以SGC7901细胞差异最明显,以此选定SGC7901为后续试验的研究对象。进一步通过q RT-PCR与Western blot证实成功构建DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系。CCK8检测发现,处理前,DJ-1高表达组24h、48h、72h与96h的增殖活性分别为0.579±0.082、0.886±0.153、1.138±0.124与1.344±0.194,较Vector组0.436±0.045、0.557±0.059、0.667±0.057与0.715±0.075呈时间依赖性增加（P<0.05）,表明高表达DJ-1可显着提高SGC7901细胞的增殖能力。而用DADS30mg/L处理24h、28h、72h与96h后,DJ-1高表达组的增殖活性分别为0.560±0.031、0.873±0.017、0.910±0.014与0.936±0.019,较DADS处理前显着降低（P<0.05）,表明DADS可部分抑制DJ-1的表达从而抑制SGC 7901细胞的增殖能力。划痕实验表明,DJ-1高表达能增强SGC-7901细胞的迁移能力。而用30 mg/l DADS处理48h后,DJ-1高表达组和空载体组细胞迁移能力均减弱,表明DADS能减弱DJ-1高表达对SGC7901细胞迁移的影响。Transwell侵袭实验发现,未加DADS组,DJ-1高表达组和空载体组穿过Matrigel基质胶的细胞数分别为179.7±6.0,251.3±4.0（P<0.05）,表明DJ-1高表达可明显促进S G C 7 9 01细胞的侵袭,而DADS 30mg/l处理24h后穿过基质胶的细胞数分别为87.3±7.1,130.0±8.5（P<0.05）,与未处理组相比明显减少。表明DADS能拮抗DJ-1高表达对SGC7901细胞侵袭能力的影响。Western blot证实,与空载体组相比,DJ-1高表达组中DJ-1和p-AKT蛋白表达显着增高,而PTEN表达显着降低,AKT表达无明显差异,EMT相关蛋白E-cadherin、TIMP3显着降低,Vimentin、Snail和MMP-9的表达则显着升高,提示DJ-1可通过抑制PTEN表达促进Akt的活化,进而启动EMT进程。而经DADS30mg/l处理24h后,DJ-1高表达组和空载体组的DJ-1表达明显下调,PTEN表达显着升高,p-Akt显着降低,而Akt水平无明显改变,EMT相关蛋白E-cadherin和TIMP3显着升高,Vimentin、Snail和MMP-9表达显着降低。证实DADS下调DJ-1可调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT。进一步的免疫荧光试验发现,与空载体组相比,DJ-1、Vimentin、TIMP3、MMP-9蛋白在DJ-1高表达组的荧光强度显着增强,表明DJ-1高表达促进EMT相关蛋白Vimentin、TIMP3、MMP-9的表达,而PTEN、E-cadherin在DJ-1高表达组的荧光强度显着减弱,表明DJ-1高表达可抑制PTEN、E-cadherin这两种蛋白的表达;而经DADS 30mg/l处理24h后,与未处理组相比较,各组DJ-1、Vimentin、MMP-9、TIMP3蛋白的细胞染色减弱,而PTEN、E-cadherin蛋白染色增加,表明DADS通过抑制DJ-1的表达从而影响PTEN及EMT相关蛋白表达的变化。小结:DADS可通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路从而抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。第三部分DADS下调DJ-1抑制SGC7901细胞对5-Fu的抗药性目的:探讨DADS下调DJ-1对SGC7901细胞增殖、凋亡与5-Fu敏感性的作用。方法:MTT分析与流式细胞术分别检测DADS在5-Fu不同浓度的情况下,对SGC7901细胞增殖与凋亡能力的影响。q RT-PCR、Western blot与免疫荧光分别检测DADS对各组SGC7901细胞中Bcl-2、XIAP、Caspase-3、MDR-1、P-gp表达水平的变化。结果:在不同浓度5-Fu处理24h后,DADS 30mg/l处理后的各组细胞其增殖抑制率分别较处理前明显提高（P<0.05）。但SGC7901/DJ-1细胞增殖抑制程度没有SGC7901与SGC7901/VCR细胞明显。表明DADS可抑制SGC7901与SGC7901/VCR细胞增殖能力和提高对5-Fu的敏感性。流式细胞术检测显示SGC7901/DJ-1细胞凋亡水平分别低于SGC7901与SGC7901/VCR（P<0.05）,SG C7901凋亡率高于SGC7901/VCR（P<0.05）。DADS处理后,各组凋亡水平分别较对照组凋亡水平均明显升高（P<0.05）。q RT-PCR与Western blot显示,SGC7901/DJ-1细胞MDR-1、P-gp、Bcl-2、XIAP较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显提高（P<0.05）,Caspase-3明显抑制（P<0.05）,DADS处理后,SGC7901、SGC7901/VCR和SGC 7901/DJ-1细胞中MDR-1、P-gp、Bc l-2及XIA P明显降低（P<0.05）。Caspase-3明显上调（P<0.05）。免疫荧光显示,在对照组中,SGC7901/DJ-1细胞P-gp、Bcl-2、XIAP的荧光强度较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显增强,而Caspase-3荧光强度则显着减弱;DADS处理后,三组细胞中P-gp、Bcl-2及XIAP蛋白与相对应的未处理组相比细胞染色降低,而Caspase-3染色增强。结果与q RT-PCR、Western Blot结果一致。小结:DADS下调DJ-1可促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。结论:1.DJ-1、PTEN、p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.DADS通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。3.DADS下调DJ-1促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。4.DJ-1可能是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一。
刘熙[8]（2020）在《冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究》文中认为[目 的]恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,目前化疗仍是恶性肿瘤临床治疗的主要方法之一。肿瘤多药耐药（Multidrug resistance,MDR）的产生是导致化疗失败,影响肿瘤患者临床预后的主要因素。因此,探寻新型作用机制、作用靶点的抗MDR药物是改变肿瘤治疗现状的重要途径,具有重要的临床意义。本课题组基于冬凌草甲素的抗肿瘤活性及其构效关系,构建了一系列以构象限制、取代基变换以及环特性变换等为特点的新型冬凌草甲素衍生物,并在前期研究中证实了其抗肿瘤作用,但该系列化合物是否具有抗肿瘤多药耐药的作用尚不清楚。本研究以耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADR细胞和耐顺铂人卵巢癌A2780/CP细胞为模型,体内、外实验考察抗肿瘤活性较高的冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌和卵巢癌细胞耐药细胞的抑制作用,并探讨其作用机制。[方 法]1.采用MTT实验、克隆形成实验检测冬凌草甲素衍生物YD0514,CYD0618和CYD0686对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞的增殖抑制作用。2.采用细胞划痕实验、Transwell实验考察CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞迁移及侵袭能力的影响。3.采用流式细胞技术检测CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞凋亡的影响。4.构建MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞裸鼠移植瘤模型,考察CYD0618在体内对移植瘤的生长抑制作用。5.采用siRNA干扰技术敲低MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞STAT3的表达,检测干扰STAT3对细胞耐药性的影响。6.转染 STAT3 过表达载体（pcDNA-STAT3）或 IL-6 刺激 MCF-7 和 A2780细胞高表达STAT3,检测过表达STAT3对细胞耐药性的影响。7.采用Western Blot及免疫组织化学方法检测CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞STAT3及其下游信号分子表达的影响。8.采用免疫荧光技术检测CYD0618对STAT3表达及核定位的影响。9.采用分子对接法模拟分析CYD0618和STAT3相互作用的结构域。10.采用免疫共沉淀法和细胞热转变实验（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）检测 CYD0618 和 STAT3 的结合。[结 果]1.MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞呈现多药耐药特性,且具有更强的迁移及侵袭能力。2.冬凌草甲素衍生物 YD0514、CYD0686、CYD0618 对 MCF-7/ADR 及A2780/CP耐药细胞均有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性,其中CYD0618的抑制作用最强。3.划痕实验,Transwell实验结果发现CYD0618能够抑制MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的迁移及侵袭。4.流式细胞分析结果示CYD0618能够显着促进MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的凋亡。5.体内实验结果显示CYD0618显着抑制MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞裸鼠移植瘤的生长,且无明显的毒副作用。6.分别在MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞中干扰STAT3,在MCF-7、A2780细胞中过表达STAT3,药物敏感实验结果显示STAT3与乳腺癌及卵巢癌细胞的耐药性密切相关。7.Western Blot结果显示CYD0618能显着抑制STAT3的表达及磷酸化,以及STAT3下游增殖、凋亡及侵袭转移相关分子的表达。免疫组化分析证实CYD0618 能抑制移植瘤 STAT3、p-STAT3、Cyclin D1 的表达,并促进 Cleaved Caspase-3的表达。免疫荧光结果示CYD0618能够抑制STAT3入核。8.分子对接结果示CYD0618能够靶向结合STAT3的SH2结构域,引起构象变化,从而抑制Tyr705残基处STAT3的磷酸化。免疫共沉淀及CETSA结果显示CYD0618能够直接结合STAT3。[结 论]STAT3的激活与乳腺癌和卵巢癌细胞的耐药性密切相关,提示药物靶向调控STAT3的活性与功能可能是一种合理、有效的抗肿瘤多药耐药的策略。冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌及卵巢癌耐药细胞均具有显着的体内、体外抑制作用。CYD0618通过直接靶向结合并抑制STAT3,进而抑制MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的增殖、侵袭和转移,促进耐药细胞的凋亡。本研究结果表明冬凌草甲素衍生物CYD0618是一种有效的STAT3抑制剂,具备开发为抗肿瘤新药的潜力。
徐东[9]（2020）在《具有促成骨及抗肿瘤多功能型仿生羟基磷灰石负载姜黄素纳米前药复合材料的研究》文中指出手术导致的骨缺损和残余癌细胞可能引起的复发及转移成为骨肿瘤临床治疗面临的双重挑战,因此兼具良好的肿瘤治疗和促进骨组织再生的多功能生物材料的开发成为本领域的研究热点。目前基于物理热消融等手段开发的新型多功能材料的治疗靶向性能有限,且本身限于局部治疗,以至于未能有效地解决骨肿瘤的治疗难题。本研究旨在基于仿生合成的不同分级结构的HA微纳米颗粒,在深入揭示其与细胞相互作用机制的基础上,通过整合性能优化的新型姜黄素纳米前药,构建出既能促进骨组织再生修复,又能靶向局部残余的骨肉瘤细胞并释放出抗癌纳米药物的多功能微纳米复合材料,为解决骨肿瘤术后治疗难题提供有效解决方案。主要研究内容和研究结果如下:（1）微纳米尺度的羟基磷灰石（HA）颗粒因良好的生物相容性、能获得可控的结构和较高的比表面积,已被广泛用作药物载体。此外,HA还具有极佳的骨诱导性和骨传导性,这为兼具抗癌和骨修复多功能材料的设计提供了良好的选择。本研究通过新型的仿生合成技术开发了多种不同分级结构的HA微纳米颗粒,详细表征了其形貌特征和化学组分、颗粒尺寸及表面电位、结晶特性及钙离子释放、多孔结构和蛋白质吸附等理化性能,深入研究了不同的分级结构对细胞内吞和成骨分化性能的影响。结果表明,HA颗粒的多级孔结构能促进血清黏附蛋白的富集,与其分级结构的生物效应协同介导细胞的内吞作用,颗粒的摄取效率呈现分级结构和浓度的双重依赖性。同时,利用PCR、RNA-seq和Western blot等技术深入揭示了不同分级结构的HA颗粒通过在细胞界面促进黏附和细胞内钙调-ERK信号级联（Ras/c AMP/Rap1/MAPK信号通路）的双重机制促进干细胞的成骨分化。这些研究结果对优化骨组织修复材料的设计具有指导意义。（2）姜黄素对健康细胞的毒性较低,且具有抗炎、抗氧化和抗菌等诸多生物活性,并能选择性地杀死骨肉瘤细胞,具有很大的潜力发展成为一种新的骨肿瘤治疗药物。本研究基于分子构效关系,设计合成了姜黄素的硼基衍生物、酯酶控释型纳米颗粒和p H响应型纳米颗粒等多种新型前药。详细表征了合成分子的光谱性质、稳定性、水溶性和活性氧的产生及纳米颗粒的形貌特征、颗粒尺寸和表面电位等理化性质。此外,深入研究了各种新型前药的细胞摄取、抗癌活性及阻滞细胞周期和促进细胞凋亡的机制。结果表明,新型衍生物的设计有效改善了姜黄素分子在生理环境下不稳定、难溶于水及生物利用度低的应用难题,并筛选出了综合性能优异的前药分子。（3）基于兼具促成骨、高药载和选择靶向等多性能的分级结构HA微纳米颗粒,整合优选的姜黄素纳米前药,构建了多功能型分级结构HA颗粒/姜黄素前药微纳米复合材料。详细表征了复合材料的形貌特征和化学组分、药物装载及药物分布、颗粒尺寸及表面电位等理化性能,并深入研究了其体外细胞摄取、细胞靶向、抗癌活性及抑癌机制。细胞实验表明,复合微纳米颗粒可以选择性靶向作用于骨肉瘤细胞,并通过显着促进细胞凋亡和阻滞细胞于G2/M期抑制癌细胞的增殖活性。体内抗肿瘤实验表明,复合材料无明显毒副作用,可以通过抑制骨肉瘤细胞的增殖活性和肿瘤组织的血管化来抑制肿瘤的生长。此外,复合微纳米颗粒在体内通过抑制MMP2和STAT3的表达从而抑制骨肉瘤细胞的侵袭转移活性。这些研究为新型控释纳米药物和多功能靶向材料的研发开辟了新途径,为骨肿瘤临床治疗面临的多重挑战提供了新的解决方案,同时为新型骨组织修复及抗肿瘤材料的作用机制研究提供了理论基础。
刘彦楠[10]（2019）在《人参皂苷Rg5的制备及其抗胃癌和乳腺癌活性研究》文中提出癌症（如胃癌、乳腺癌等）是一种恶性肿瘤,近年来发病率持续攀升,给人体健康和生活质量造成极大的危害,也给医疗事业和国家经济带来了很大的负担。化疗是一种常用的治疗癌症的方案,但化疗药物一般具有价格昂贵和副作用大等缺点,而且长期使用化疗药物会使机体产生耐药性,严重阻碍了癌症治疗的进程。因此,寻找安全有效、来源广泛、副作用小的抗癌药物对于治疗胃癌和乳腺癌具有十分重要的意义。本课题从人参粉末中提取人参总皂苷并经过转化和提纯得到稀有人参皂苷Rg5,分别在体外和体内探究人参皂苷Rg5对胃癌和乳腺癌的作用效果和分子机制,从而为人参皂苷Rg5临床治疗胃癌或乳腺癌提供研究基础。本论文的主要研究内容如下:（1）人参皂苷Rg5的制备通过择优选择甲醇提取和D101-大孔吸附树脂梯度洗脱从人参粉末中分离和提纯人参总皂苷,其含量为93%。采用纤维素酶转化法结合柠檬酸水解法将粗纯后的人参总皂苷转化为稀有人参皂苷,并通过单因素分析和响应面分析实验优化Rg5的转化工艺,得到纤维素酶转化法最佳工艺条件为酶浓度40 mg/m L,p H 5.5,温度45℃,转化时间30 h;柠檬酸水解法最佳工艺条件为酸浓度1.50 mol/L,温度100℃,制备时间6 h,在此条件下Rg5得率为27.02%。通过制备液相色谱分离纯化其中的Rg5,再通过分析液相色谱分析检测,最终得到Rg5单体的纯度为98.9%。（2）人参皂苷Rg5的抗胃癌活性研究为了研究胃癌细胞凋亡的机制,本文通过MTT实验、流式细胞术实验、AO/EB双染法、JC-10法和蛋白免疫印迹实验等验证了Rg5可抑制胃癌细胞生长,并诱导其周期阻滞于G2/M期,还可以由线粒体和死亡受体两种途径来诱导胃癌细胞的凋亡。透射电镜和蛋白免疫印迹实验表明Rg5可以诱导胃癌细胞发生自噬。同时,Rg5诱导的胃癌细胞的凋亡和自噬过程相互促进。本文进一步研究了Rg5作用于胃癌细胞的周期、凋亡和自噬的上游信号通路的影响,发现Rg5可以诱导胃癌细胞生成ROS并激活MAPK通路（P38、JNK、ERK）,导致其发生凋亡、自噬和细胞周期阻滞。最后通过构建胃癌荷瘤裸鼠模型,发现Rg5在体内具有显着的抗肿瘤活性,且副作用小。肿瘤组织中蛋白免疫印迹和免疫组化实验结果表明Rg5可以调控胃癌体内凋亡、自噬和MAPK通路蛋白的表达,与体外细胞实验结果一致。这些结果说明Rg5可以通过多种抗癌分子机制达到抗胃癌的效果,有望成为一种新型抗胃癌药物,为临床应用提供重要参考。（3）人参皂苷Rg5的抗乳腺癌活性研究本文通过一系列体外细胞实验、染色实验和蛋白免疫印迹实验验证了Rg5可以显着抑制乳腺癌细胞的生长和迁移,并诱导其周期阻滞、细胞凋亡和细胞自噬。为了进一步探讨Rg5对乳腺癌作用的上游信号通路,本文研究了Rg5在体内和体外抗乳腺癌的分子机制,通过免疫组化和蛋白免疫印迹实验测定了PI3K蛋白、AKT蛋白、m TOR蛋白和Bad蛋白及其磷酸化的表达水平,发现Rg5可以通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制乳腺癌的增殖,并调控乳腺癌凋亡和自噬相关蛋白的表达。根据乳腺癌荷瘤裸鼠模型,本文制备的Rg5也可显着抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生长,与乳腺癌一线化疗药物多西他赛疗效相当,且Rg5具有副作用小的优势,有望成为新一代抗乳腺癌药物。综上所述,本研究从天然人参粉末中经提取、转化、分离和纯化等过程制备出高纯度的人参皂苷Rg5,并研究了其对胃癌和乳腺癌的体内外抗肿瘤功效。通过体内外实验研究表明Rg5可以通过激活ROS介导的MAPK信号通路诱导胃癌细胞发生周期阻滞、细胞凋亡和细胞自噬,从而有效地抑制胃癌的生长;同时通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导乳腺癌发生细胞凋亡和细胞自噬,从而抑制乳腺癌细胞增殖。另外,在胃癌和乳腺癌异种移植模型中,人参皂苷Rg5抑瘤效果显着、副作用小,这为人参皂苷Rg5在临床上治疗胃癌和乳腺癌提供了有效的理论依据和重要的研究基础。
二、p38信号途径与胃癌细胞阿霉素耐药相关（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p38信号途径与胃癌细胞阿霉素耐药相关（论文提纲范文）
（1）Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词汇 |
| 前言 |
| 第一部分 Peroxiredoxin Ⅴ通过ROS/Bcl2信号通路抑制大黄素诱导的胃癌细胞凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料与实验仪器 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏、换液 |
| 1.2.1.2 细胞传代 |
| 1.2.1.3 细胞冻存 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.2.2 AGS胃癌细胞侵染 |
| 1.2.2.3 AGS胃癌转染细胞的筛选 |
| 1.2.3 细胞内ROS检测 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 蛋白质免疫印迹法 |
| 2.结果 |
| 2.1 大黄素对胃癌细胞内活性氧水平的影响 |
| 2.2 大黄素诱导AGS胃癌细胞凋亡,降低Prx Ⅴ表达水平 |
| 2.2.1 荧光显微镜检测结果 |
| 2.2.2 流式细胞仪检测结果 |
| 2.2.3 Emodin对 AGS细胞内Prxs家族某些蛋白表达水平的影响 |
| 2.3 大黄素诱导的AGS细胞凋亡与细胞内ROS相关 |
| 2.3.1 抑制活性氧后细胞内凋亡水平 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测细胞内ROS水平 |
| 2.4 过表达Prx Ⅴ可减少大黄素诱导的AGS细胞凋亡 |
| 2.4.1 慢病毒载体构建Prx Ⅴ敲降、过表达以及空白载体AGS细胞系 |
| 2.4.2 不同浓度大黄素对AGS细胞的影响 |
| 2.4.3 大黄素时间段处理AGS细胞 |
| 2.5 过表达Prx Ⅴ可显着调节大黄素处理AGS细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 2.5.1 蛋白免疫印迹法检测Mock/shPrx Ⅴ/Prx Ⅴ-his的AGS细胞中Bad、cleaved-PARP和Bcl2的表达水平 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 沉默Peroxiredoxin Ⅴ基因提高阿霉素诱导的胃癌细胞线粒体依赖性凋亡 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验材料与实验仪器 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.1.1 细胞复苏 |
| 1.2.1.2 细胞换液 |
| 1.2.1.3 细胞传代 |
| 1.2.1.4 细胞冻存 |
| 1.2.2 细胞转染 |
| 1.2.2.1 慢病毒构建 |
| 1.2.2.2 慢病毒侵染 |
| 1.2.2.3 转染细胞的筛选 |
| 1.2.3 细胞内ROS检测 |
| 1.2.3.1 DHE荧光探针检测细胞内活性氧的变化 |
| 1.2.3.2 MitoSOX荧光探针检测细胞线粒体内活性氧的变化 |
| 1.2.4 细胞凋亡检测 |
| 1.2.5 细胞线粒体膜电位检测 |
| 1.2.6 蛋白质免疫印迹法 |
| 1.2.6.1 回收AGS细胞蛋白质样品 |
| 1.2.6.2 检测蛋白质浓度 |
| 1.2.6.3 进行凝胶电泳分离蛋白 |
| 1.2.6.4 脱脂乳进行封闭及一抗,二抗封闭 |
| 1.2.6.5 Western blot成像仪进行照相 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素对AGS细胞的细胞毒性作用 |
| 2.1.1 蛋白质免疫印迹法检测结果 |
| 2.1.2 MTT检测结果 |
| 2.2 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞凋亡及活性氧蓄积 |
| 2.2.1 荧光显微镜、流式细胞术分析结果 |
| 2.2.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.3 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞线粒体膜通透性、线粒体依赖性凋亡及活性氧 |
| 2.3.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.3.2 荧光染色检测结果 |
| 2.4 沉默Prx Ⅴ增加了阿霉素诱导的AGS细胞线粒体膜通透性、线粒体依赖性凋亡及活性氧 |
| 2.4.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.5 活性氧是Prx Ⅴ发挥作用的主要靶点之一 |
| 2.5.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.5.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.6 活性氧是Prx Ⅴ发挥作用的主要靶点之一 |
| 2.6.1 流式细胞术分析结果 |
| 2.6.2 荧光显微镜分析结果 |
| 2.7 活性氧清除剂有效抑制因沉默Prx Ⅴ引发的细胞凋亡 |
| 2.7.1 蛋白质免疫印迹法分析结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录攻读学位期间发表的论文 |
（2）盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文对照缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 主要溶液的配制 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 细胞来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 SGC-7901、GES-1 细胞培养 |
| 2.2 人胃癌顺铂耐药株SGC-7901/DDP细胞培养 |
| 2.3 细胞的冻存 |
| 2.4 CCK-8 实验 |
| 2.5 细胞周期实验 |
| 2.6 细胞凋亡实验 |
| 2.7 细胞侵袭实验 |
| 2.8 细胞划痕实验 |
| 2.9 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.10 免疫组化实验 |
| 2.11 免疫荧光实验 |
| 2.12 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 1.SGC-7901/DDP耐药株的耐药鉴定 |
| 2.CCK-8 法进行SAL作用浓度及时间点筛选 |
| 3.SAL及 DDP对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响 |
| 4.流式细胞术检测SAL及 DDP对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 5.流式细胞术检测SAL及 DDP对胃癌细胞周期的影响 |
| 6.SAL及 DDP诱导胃癌细胞凋亡的机制研究 |
| 7. SAL 对胃癌细胞 Wnt/ β-catenin 通路效应物及 EMT 标记物表达的影响 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1.结论 |
| 2.创新点 |
| 3 后续研究工作及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 盐霉素的生物作用综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（3）盐霉素分别联合莱菔硫烷及奥沙利铂抑制结直肠癌的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 盐霉素联合莱菔硫烷抑制结直肠癌的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 盐霉素联合奥沙利铂抑制结直肠癌的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 盐霉素在结直肠癌治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English paper 1 |
| English paper 2 |
（4）GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中文论文 |
| 英文缩略词表（Abbreviation) |
| 前言 |
| 第一部分 胃癌细胞hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.4.1 试剂耗材 |
| 2.1.4.2 药物 |
| 2.1.5 主要试剂配制方法 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 检测方法 |
| 2.2.2.1 RNA提取与RT-PCR |
| 2.2.2.2 实时荧光定量PCR |
| 2.2.2.3 CCK-8法检测胃癌细胞VER逆转抗癌药物耐药能力效率指数(IC_(50)值) |
| 2.2.2.4 Western印迹分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 维拉帕米对3种胃癌细胞系(SGC-7901、BGC-823和AGS)3种化疗药物(5-Fu、ADM、DDP)逆转耐药能力判定 |
| 4.2 胃癌细胞株中hMDR1/P-gp基因对相对表达水平 |
| 4.3 hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力相关性 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第二部分 构建胃癌耐药细胞株并验证其耐药效率 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要仪器与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.3.1 试剂耗材 |
| 2.1.3.2 药物 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 建立胃癌5-Fu耐药细胞株SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.2 耐药细胞株SGC-7901/5-Fu稳定性测定 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 CCK-8法检测胃癌细胞VER逆转抗癌药物耐药能力效率指数(IC_(50)值) |
| 2.2.6 Western印迹分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-Fu稳定性检测药物 |
| 4.2 胃癌耐药细胞株SGC-7901/ADM耐药性检测 |
| 4.3 胃癌耐药细胞株对3种抗癌药物(5-Fu、ADM、DDP)药物敏感性检测 |
| 4.4 胃癌耐药细胞株hMDR1/P-gp的相对表达水平 |
| 4.5 维拉帕米对胃癌耐药细胞株对3种抗癌药物(5-Fu、ADM、DDP)逆转耐药能力判定 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第三部分 介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选、确证及机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.4.1 试剂耗材 |
| 2.1.4.2 药物 |
| 2.1.4.3 主要抗体 |
| 2.1.4.4 菌株与质粒 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 质粒抽提 |
| 2.2.3 质粒DNA转染 |
| 2.2.4 siRNA转染 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western印迹分析 |
| 2.2.7 Annexin V-FTC/PI双染细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 胃癌耐药差异基因的筛选 |
| 4.2 实时荧光定量PCR法检测候选基因在胃癌细胞中的表达 |
| 4.3 Western blot法检测候选蛋白在胃癌细胞中的表达 |
| 4.4 胃癌SGC-7901细胞和SGC-7901/5-Fu细胞GCS基因表达沉默和过表达验证 |
| 4.5 改变GCS基因表达水平,VER逆转ADM化疗耐药能力变化 |
| 4.6 改变GCS基因表达水平,对VER干预后的胃癌细胞凋亡水平影响 |
| 4.7 改变GCS基因表达水平,凋亡信号通路蛋白Bcl-2变化 |
| 4.8 改变GCS基因表达水平,凋亡信号通路蛋白ERK变化 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第四部分 临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌病例组织样本中的表达 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 胃癌组织标本 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 临床资料分类 |
| 2.3.1 纳入标准 |
| 2.3.2 排除标准 |
| 2.3.3 剔除标准 |
| 2.4 VER联合TACE治疗方式 |
| 2.5 疗效评价 |
| 2.5.1 肿瘤病灶的变化 |
| 2.5.2 临床收益判断 |
| 2.6 免疫组化 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 肿瘤原发病灶治疗疗效评价 |
| 4.2 生存期评价 |
| 4.3 免疫组化法检测P-gp蛋白在胃癌临床标本中的表达情况 |
| 4.4 免疫组化法检测GCS蛋白在胃癌临床标本中的表达情况 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 图表索引 |
| 综述 肿瘤多药耐药机制的研究现状及进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表(含待发表)学术论文 |
| 附英文论文 |
| ABSTRACT |
| Abbreviation List (Abbreviation) |
| PREFACE |
| Chapter 1. The correlation between the expression level of P-gp and the reversal ofVER's resistance to chemotherapy in gastric carcinoma cells |
| 1.Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 material |
| 2.1.1 cell line |
| 2.1.2 primer |
| 2.1.3 Main instruments and consumables |
| 2.1.4 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.4.1 Reagent consumables |
| 2.1.4.2 Medicine |
| 2.1.5 Preparation method of main reagents |
| 2.2. Method |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Test Method |
| 2.2.2.1 RNA extraction and RT-PCR |
| 2.2.2.2 Real time fluorescent quantitative PCR |
| 2.2.2.3 CCK-8 method was used to detect the efficiency index (IC50 value) of VER reversing chemotherapy drug resistance of gastric cancer cells |
| 2.2.2.4 Western blot analysis |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 The ability of verapamil to reverse drug resistance of SGC-7901, BGC-823 and AGS cells to 5-FU, ADM and DDP |
| 4.2 Relative expression level of hMDR1/P-gp gene in gastric cancer cell lines |
| 4.3 Relationship between hMDR1/P-gp expression and VER+ADM resistance(Relative IC_(50)) |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter2 Construct gastric cancer drug-resistant cell line and verify its drug-resistant efficiency |
| 1.Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Material |
| 2.1.1 cell line |
| 2.1.2 Main instruments and consumables |
| 2.1.3 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.3.1 Reagent consumables |
| 2.1.3.2 Medicine |
| 2.2. Method |
| 2.2.1 Establishment of gastric cancer 5-Fu resistant cell line SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.2 Stability of drug resistant cell line SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.3 Cell culture |
| 2.2.4 Real time fluorescent quantitative PCR |
| 2.2.5 CCK-8 method was used to detect the efficiency index (IC_(50) value) of verapamil reversing chemotherapy drug resistance |
| 2.2.6 Western blot |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Stability of drug resistant gastric cancer cell line SGC-7901/5-Fu |
| 4.2 Detection of drug resistance in gastric cancer cell line SGC-7901/ADM |
| 4.3 Detection of drug sensitivity of gastric cancer cell lines to three chemotherapeutic drugs (5-FIJ, ADM, DDP) |
| 4.4 Relative expression level of drug resistant gastric cancer cell line hMDR1/P-gp |
| 4.5 The ability of verapamil to reverse drug resistance of gastric cancer cell lines SGC-7901/5-Fu and SGC-7901/ADM to three chemotherapeutic drugs (5-FU,ADM and DDP) |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter3 Screening,confirmation and mechanism study of differential genes mediated by VER in the reversal of chemotherapy resistance of gastric carcinoma cells |
| 1 .Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Material |
| 2.1.1 Cell line |
| 2.1.2 Primer |
| 2.1.3 Main instruments and consumables |
| 2.1.4 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.4.1 Reagent consumables |
| 2.1.4.2 Medicine |
| 2.1.4.3 Major antibodies |
| 2.1.4.4 Strains and plasmids |
| 2.2 Method |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Plasmid Extraction |
| 2.2.3 plasmid DNA transfection |
| 2.2.4 siRNA transfection |
| 2.2.5 qRT-PCR |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 Detection of apoptosis by annexin V-FITC / PI double staining |
| 2.2.8 Screening of differentially expressed genes mediated by verapamil in reversing cell chemo resistance gastric cancer |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Screening of drug resistance genes in gastric cancer |
| 4.2 Detection of candidate gene expression in GC ceils by qRT-PCR |
| 4.3 Western blot was used to detect the expression of candidate proteins in gastric cancer cells |
| 4.4 Verification of GCS gene silencing and overexpression in SGC-7901 cells and SGC-7901/5-Fu cells |
| 4.5 Change the expression level of GCS gene and the change in the ability of VER to reverse ADM chemotherapy resistance |
| 4.6 Changing the expression level of GCS gene affected the apoptosis level of gastric cancer cells after VER intervention |
| 4.7 Change the expression of GCS gene and Bcl-2 |
| 4.8 Change the expression of GCS gene and pERK |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter4 Clinical study on the expression of P-gp and GCS in tissue samples of gastric cancer cases |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Tissue samples of gastric cancer |
| 2.2 Main reagents |
| 2.3 classification of clinical data |
| 2.3.1 Inclusion criteria |
| 2.3.2 Exclusion criteria |
| 2.3.3 Exclusion criteria |
| 2.4 VER Combined TACE treatment |
| 2.5 Efficacy evaluation |
| 2.5.1 Changes of tumor focus |
| 2.5.2 Clinical benefit judgment |
| 2.5.2.1 Survival evaluation |
| 2.6 Immunohistochemical |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Evaluation of therapeutic effect of primary tumor |
| 4.2 The PFS and OS |
| 4.3 The expression of P-gp protein in clinical specimens of gastric cancer was detected by immunohistochemistry |
| 4.4 The expression of GCs protein in clinical specimens of gastric cancer was detected by immunohistochemistry |
| 5. Discussion |
| 6. Conclusion |
| Discussion and Outlook |
| Reference |
| Attached The Chart Index |
| REVIEW Research status and progress of multi drug resistance mechanism incancer |
| Reference |
| Acknowledgement |
| Academic papers published (including to be published)during academic degree |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）扶正解毒方调控肿瘤相关成纤维细胞cGAS/Wnt16b/β-catenin轴介导癌细胞干性化逆转耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 综述一 CAFs与化疗耐药的关系研究进展 |
| 1 CAFs的来源 |
| 2 CAFs的鉴定 |
| 3 CAFs与肿瘤耐药 |
| 参考文献 |
| 综述二 cGAS-STING通路在肿瘤发展中的作用及临床应用进展 |
| 1 cGAS-STING的抑瘤作用 |
| 2 cGAS-STING通路的促瘤作用 |
| 3 cGAS-STING通路与肿瘤转移 |
| 4 cGAS-STING通路与TME中其他细胞 |
| 5 cGAS-STING通路的临床应用 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医药逆转耐药研究进展 |
| 1 耐药发生的病机 |
| 2 中医药逆转耐药的研究 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一部分 化疗诱导的DNA损伤CAFs模型构建及评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第二部 分扶正解毒方对cGAS /Wnt-16b/β-catenin轴介导的胃癌细胞干性化逆转耐药的干预作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5. 讨论 |
| 第三部分 5-FU耐药荷瘤小鼠模型构建及扶正解毒抗肿瘤作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究结论 |
| 创新之处 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中医药科技查新报告书 |
（6）DUSP14在胃癌中的临床意义及通过EMT促进侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胃癌生物标志物的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略语索引 |
| 第一部分 DJ-1、PTEN、p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病例资料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组化染色 |
| 2.2.2 结果判定 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DJ-1 蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.1.1 DJ-1 蛋白在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.1.2 DJ-1 表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 3.1.3 DJ-1 表达与胃癌预后的关系 |
| 3.2 PTEN蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.2.1 PTEN在在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.2.2 PTEN表达与临床胃癌病理指标的关系 |
| 3.2.3 PTEN表达与胃癌预后的关系 |
| 3.3 p-Akt蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.3.1 p-Akt在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.3.2 p-Akt表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DADS下调DJ-1 负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌SGC-7901 细胞EMT与侵袭 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验质粒、载体、细胞株、菌株及慢病毒系统 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 关键试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 DJ-1 过表达慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 2.2.3 慢病毒转染SGC-7901 细胞以及稳定转染细胞株的筛选 |
| 2.2.4 q RT-PCR(荧光定量PCR) |
| 2.2.5 Western blot检测 |
| 2.2.6 CCK8 增殖实验 |
| 2.2.7 划痕愈合实验 |
| 2.2.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS对各胃癌细胞系DJ-1 表达的影响 |
| 3.2 慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 3.3 DJ-1 高表达稳定细胞系的构建 |
| 3.4 qPCR检测DADS处理和转染细胞DJ-1 的表达水平 |
| 3.5 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞增殖能力的影响 |
| 3.6 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞迁移能力的影响 |
| 3.7 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞侵袭能力的影响 |
| 3.8 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞DJ-1/PTEN/AKt信号通路的影响 |
| 3.8.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞PTENm RNA表达的影响 |
| 3.8.2 DADS 与DJ-1高表达对SGC7901细胞PTEN/AKt信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.9 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌SGC7901 细胞EMT相关分子的影响 |
| 3.9.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子m RNA的影响 |
| 3.9.2 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子蛋白表达的影响 |
| 3.10 细胞免疫荧光检测DJ-1、PTEN及 EMT相关蛋白的定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DADS下调DJ-1 抑制人胃癌SGC7901 细胞对5-Fu的抗药性 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂的配置 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 qRT‐PCR(荧光定量 PCR) |
| 2.2.3 Western Blot检测 |
| 2.2.4 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS与 DJ-1 高表达对各种SGC7901 细胞增殖的影响 |
| 3.2 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞SGC7901 凋亡的影响 |
| 3.3 DADS与 DJ-1 高表达对各组细胞凋亡相关分子表达的影响 |
| 3.3.1 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Bcl‐2 表达的影响 |
| 3.3.2 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 XIAP 表达的影响 |
| 3.3.3 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Caspase‐3 表达的影响 |
| 3.4 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞抗药性的影响 |
| 3.5 免疫荧光检测P-gp、Bcl-2、XIAP及 Caspase-3 定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 全部结论 |
| 综述 Role of DJ-1 in cancer: Recent advance |
| References |
| 攻读博士期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
（8）冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 冬凌草甲素衍生物对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌及卵巢癌耐药细胞的抑制作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618抑制STAT3信号克服乳腺癌及卵巢癌细胞耐药 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618靶向结合STAT3 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 冬凌草甲素及其衍生物的抗肿瘤作用及机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）具有促成骨及抗肿瘤多功能型仿生羟基磷灰石负载姜黄素纳米前药复合材料的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 骨肿瘤的临床治疗现状 |
| 1.1.1 骨肿瘤的临床治疗策略 |
| 1.1.2 骨肿瘤的临床治疗难点 |
| 1.2 骨组织修复材料 |
| 1.2.1 生物活性骨修复材料 |
| 1.2.2 传统羟基磷灰石生物陶瓷 |
| 1.2.3 微纳结构HA的仿生合成 |
| 1.2.4 HA表面分级结构的成骨效应 |
| 1.2.5 HA颗粒结构对细胞内吞的介导作用 |
| 1.2.6 HA作为药物载体的应用 |
| 1.3 姜黄素及其衍生物的抗肿瘤效应 |
| 1.3.1 姜黄素的临床应用瓶颈 |
| 1.3.2 姜黄素的分子构效关系 |
| 1.3.3 姜黄素的抗癌机制 |
| 1.3.4 新型姜黄素衍生物 |
| 1.3.5 姜黄素在抗骨肿瘤中的应用 |
| 1.4 多功能骨肿瘤治疗材料 |
| 1.4.1 无负载药物的多功能骨肿瘤治疗材料 |
| 1.4.2 整合药物的多功能骨肿瘤治疗材料 |
| 1.5 本研究的目的、意义及主要内容 |
| 第二章 可调控分级结构HA颗粒的仿生合成及其促进干细胞内吞和成骨分化的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 化学试剂与设备 |
| 2.2.2 分级结构HA微纳米颗粒的制备 |
| 2.2.3 分级结构HA颗粒的理化性能表征 |
| 2.2.4 分级结构HA颗粒与细胞相互作用 |
| 2.2.5 不同分级结构HA颗粒诱导干细胞成骨分化 |
| 2.2.6 分级结构HA颗粒的促成骨机制分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 分级结构HA颗粒的制备及形貌演变 |
| 2.3.2 分级结构HA颗粒的理化性质 |
| 2.3.3 分级结构HA颗粒与细胞相互作用 |
| 2.3.4 不同分级结构HA颗粒诱导干细胞的成骨分化 |
| 2.3.5 分级结构HA颗粒促成骨机制分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 新型姜黄素前药的合成及其抗骨肿瘤活性和机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料合成与测试方法 |
| 3.2.1 化学试剂与设备 |
| 3.2.2 新型姜黄素前药的合成 |
| 3.2.3 新型姜黄素前药的理化性质表征 |
| 3.2.4 新型姜黄素前药的抗癌活性和细胞摄取 |
| 3.2.5 新型姜黄素前药的抑癌机制分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 新型姜黄素前药的合成及理化性质研究 |
| 3.3.2 新型姜黄素前药的抗癌活性及细胞摄取 |
| 3.3.3 新型姜黄素前药的抑癌机制分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 多功能型仿生HA颗粒/姜黄素前药复合材料的合成及其抗骨肿瘤活性和机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 化学试剂与设备 |
| 4.2.2 复合微纳米颗粒的制备 |
| 4.2.3 复合微纳米颗粒的理化性能表征 |
| 4.2.4 复合微纳米颗粒的体外抗癌活性及细胞靶向 |
| 4.2.5 复合微纳米颗粒的体外抑癌机制分析 |
| 4.2.6 复合微纳米颗粒的体内抗肿瘤活性及生物安全性评价 |
| 4.2.7 复合微纳米颗粒的体内抗肿瘤机制分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 复合微纳米颗粒的优化合成 |
| 4.3.2 复合微纳米颗粒的理化性质 |
| 4.3.3 复合材料的体外抑癌活性及细胞靶向 |
| 4.3.4 复合微纳米颗粒的体外抑癌机制分析 |
| 4.3.5 复合微纳米颗粒的体内抗肿瘤活性及生物安全性 |
| 4.3.6 复合微纳米颗粒的体内抗肿瘤机制 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 论文创新性 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（10）人参皂苷Rg5的制备及其抗胃癌和乳腺癌活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人参皂苷 |
| 1.1.1 人参皂苷的分类 |
| 1.1.2 人参皂苷的制备方法 |
| 1.1.3 人参皂苷的药理学活性 |
| 1.1.4人参皂苷Rg5 |
| 1.2 胃癌的研究进展 |
| 1.2.1 胃癌概述 |
| 1.2.2 胃癌的治疗现状 |
| 1.2.3 天然植物提取物的抗胃癌研究 |
| 1.3 乳腺癌的研究进展 |
| 1.3.1 乳腺癌概述 |
| 1.3.2 乳腺癌的治疗现状 |
| 1.3.3 天然植物提取物的抗乳腺癌研究 |
| 1.4 研究目的和创新点 |
| 第二章 人参皂苷Rg5的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 人参总皂苷的提取 |
| 2.3.2 人参总皂苷的纯化 |
| 2.3.3 人参总皂苷的转化 |
| 2.3.4 人参皂苷的分离纯化 |
| 2.3.5 人参皂苷Rg5的分离纯化 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 人参总皂苷的提取和纯化结果分析 |
| 2.4.2 人参总皂苷的转化结果分析 |
| 2.4.3 人参皂苷的分离纯化结果分析 |
| 2.4.4 人参皂苷Rg5的分离纯化结果分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 人参皂苷Rg5的抗胃癌活性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验准备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MTT毒性实验 |
| 3.3.2 细胞克隆形成实验 |
| 3.3.3 细胞周期和细胞凋亡检测实验 |
| 3.3.4 细胞线粒体膜电位测定实验 |
| 3.3.5 AO/EB染色实验 |
| 3.3.6 DCFH-DA染色实验 |
| 3.3.7 siRNA转染实验 |
| 3.3.8 荷瘤裸鼠模型建立及给药 |
| 3.3.9 透射电镜检测实验 |
| 3.3.10 蛋白免疫印迹检测实验 |
| 3.3.11 H&E染色实验 |
| 3.3.12 免疫组化实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 人参皂苷Rg5对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4.2 人参皂苷Rg5对胃癌细胞周期分布的影响 |
| 3.4.3 人参皂苷Rg5对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 3.4.4 人参皂苷Rg5对胃癌细胞自噬的影响 |
| 3.4.5 人参皂苷Rg5诱导的细胞凋亡和细胞自噬相互促进 |
| 3.4.6 人参皂苷Rg5 对胃癌细胞ROS介导的MAPK信号通路的影响 |
| 3.4.7 人参皂苷Rg5对胃癌荷瘤裸鼠体重和主要脏器的组织学影响 |
| 3.4.8 人参皂苷Rg5对胃癌荷瘤裸鼠的瘤重和肿瘤体积的影响 |
| 3.4.9 人参皂苷Rg5对胃癌荷瘤裸鼠的肿瘤组织形态学的影响 |
| 3.4.10 肿瘤组织中蛋白表达水平的检测分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg5的抗乳腺癌活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验准备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MTT毒性实验 |
| 4.3.2 细胞克隆形成实验 |
| 4.3.3 细胞周期和细胞凋亡检测实验 |
| 4.3.4 AO/EB染色实验 |
| 4.3.5 细胞迁移实验 |
| 4.3.6 荷瘤裸鼠模型建立及给药 |
| 4.3.7 透射电镜检测实验 |
| 4.3.8 蛋白印迹检测实验 |
| 4.3.9 免疫组化实验 |
| 4.3.10 荷瘤裸鼠外周血血象检测实验 |
| 4.3.11 荷瘤裸鼠血清中生化指标含量检测实验 |
| 4.3.12 实时定量荧光PCR实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人参皂苷Rg5对乳腺癌细胞的增殖的抑制作用 |
| 4.4.2 人参皂苷Rg5对乳腺癌细胞周期分布的影响 |
| 4.4.3 人参皂苷Rg5对乳腺癌细胞凋亡的影响 |
| 4.4.4 人参皂苷Rg5对乳腺癌细胞自噬的影响 |
| 4.4.5 人参皂苷Rg5 对乳腺癌细胞PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 4.4.6 人参皂苷Rg5对乳腺癌细胞迁移的影响 |
| 4.4.7 人参皂苷Rg5对乳腺癌荷瘤裸鼠的瘤重和肿瘤体积的影响 |
| 4.4.8 人参皂苷Rg5对乳腺癌荷瘤裸鼠体重、主要脏器和免疫功能的的影响 |
| 4.4.9 人参皂苷Rg5对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织形态学的影响 |
| 4.4.10 人参皂苷Rg5对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织凋亡的影响 |
| 4.4.11 人参皂苷Rg5对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织自噬的影响 |
| 4.4.12 人参皂苷Rg5 对乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、p38信号途径与胃癌细胞阿霉素耐药相关（论文参考文献）
- [1]Prx Ⅴ在抗肿瘤药物诱导的胃癌细胞凋亡过程中对氧化应激反应的调控作用及机制[D]. 金永哲. 延边大学, 2021(02)
- [2]盐霉素对耐顺铂人胃癌细胞增敏作用及其机制研究[D]. 韩笑. 延安大学, 2021(09)
- [3]盐霉素分别联合莱菔硫烷及奥沙利铂抑制结直肠癌的机制研究[D]. 刘芳. 山东大学, 2021(12)
- [4]GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究[D]. 王旭. 山东大学, 2021(10)
- [5]扶正解毒方调控肿瘤相关成纤维细胞cGAS/Wnt16b/β-catenin轴介导癌细胞干性化逆转耐药的研究[D]. 吴喆. 中国中医科学院, 2021(02)
- [6]DUSP14在胃癌中的临床意义及通过EMT促进侵袭转移的机制研究[D]. 程修强. 新乡医学院, 2020(06)
- [7]DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制[D]. 夏红. 南华大学, 2020
- [8]冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究[D]. 刘熙. 昆明医科大学, 2020(02)
- [9]具有促成骨及抗肿瘤多功能型仿生羟基磷灰石负载姜黄素纳米前药复合材料的研究[D]. 徐东. 华南理工大学, 2020
- [10]人参皂苷Rg5的制备及其抗胃癌和乳腺癌活性研究[D]. 刘彦楠. 西北大学, 2019(05)