一、HBV核心蛋白作为免疫载体的研究进展（论文文献综述）
魏霞飞[1]（2021）在《基于TurboID邻近标记技术筛选和鉴定HBV复制相关因子》文中研究说明目的为更加深入地了解HBV转录调控机制,本研究利用Turbo ID邻近蛋白标记技术,构建一种能有效筛选与HBV核心启动子序列相互作用宿主因子的方法。利用该方法筛选和鉴定出HBV转录相关因子STAU1,进而解析STAU1调控HBV复制的具体机制。方法1.构建筛选系统:利用Golden Gate Cloning方法构建p TRE-PCORE、p3flag-t Ta-FRB和p FKBP12-Turbo ID三种质粒;将以上三种质粒以不同组合形式转染Hep G2细胞,摸索Biotin和Rapamycin作用浓度和作用时间,以优化Turbo ID邻近蛋白标记技术的作用条件;将以上三种质粒共转染Hep G2细胞,分别设置样品组和对照组,结合Turbo ID技术和LC-MS技术分析及鉴定HBV转录相关宿主因子;2.挑选候选基因:以Hep G2 c DNA为模板,采用RT-PCR扩增基因CDS序列,利用Golden Gate Cloning方法将CDS序列克隆至p CH9载体,以此构建表达候选基因的质粒;将构建成功的基因与HBV核心启动子驱动的海肾荧光素酶报告基因质粒共转染,以此评估这些基因对HBV核心启动子活性的影响;然后,将基因与HBV1.3倍体质粒共转染,初步评估这些基因对HBV DNA复制的影响。结合以上两种方式,挑选能显着影响HBV转录及复制的基因STAU1进行下一步研究;3.候选基因STAU1表型验证:分别在Hep G2、Huh7和Hep G2-NTCP细胞系中评价过表达或敲低STAU1后对HBV复制水平的影响,即利用Southern blot技术和Northern blot技术分别检测STAU1对HBV DNA和RNA水平的影响,利用ELISA检测STAU1对细胞上清中HBe Ag和HBs Ag含量的影响;4.STAU1调控HBV转录机制研究:在Hep G2和Huh7细胞中过表达或者敲低STAU1后,通过荧光素酶实验检测其对HBV核心启动子活性的影响。利用Ch IP和EMSA实验分析STAU1与HBV核心启动子相互作用。利用LC-MS质谱分析STAU1互作蛋白,进一步解析STAU1调控HBV转录机制;5.STAU1调控病毒蛋白HBX机制研究:在Hep G2细胞中利用三分段Nano Luc荧光素酶实验和co-IP实验分析STAU1与HBX之间的相互作用;在Hep G2和Huh7细胞中利用Western blot分析过表达/敲低STAU1对HBX蛋白水平的影响;利用蛋白质合成抑制剂CHX处理后,通过Western blot分析过表达/敲低STAU1对HBX蛋白半衰期的影响;利用蛋白酶体抑制剂MG132处理后,通过Western blot分析过表达/敲低STAU1对HBX蛋白水平的影响;利用IP实验分析过表达/敲低STAU1对HBX泛素化水平的影响。结果1.成功构建并优化了基于Turbo ID邻近标记技术的HBV转录相关因子筛选系统;利用该系统共筛选出42种基因;2.从42种基因中成功克隆出19种基因,通过初步筛选,发现STAU1基因能显着影响HBV核心启动子活性和HBV DNA复制水平;3.过表达STAU1可显着上调HBV DNA和HBV RNA水平,同时增加HBe Ag和HBs Ag表达水平;敲低STAU1可显着下调HBV DNA和HBV RNA水平,同时也降低HBe Ag和HBs Ag表达水平;4.过表达STAU1可增加HBV核心启动子活性;敲低STAU1可降低HBV核心启动子活性;Ch IP实验结果显示STAU1可与HBV核心启动子相互作用。但体外EMSA实验显示STAU1不能直接与HBV核心启动子结合。进一步研究发现STAU1通过与TARDBP相互作用被招募到HBV核心启动子附近,同时STAU1通过招募SAGA转录激活复合体激活HBV转录;5.STAU1可与病毒蛋白HBX相互作用。过表达STAU1增加HBX蛋白表达水平;敲低STAU1减少HBX蛋白表达水平。过表达STAU1可增加HBX蛋白的半衰期;敲低STAU1基因可加速HBX蛋白的降解。蛋白酶体抑制剂MG132处理可减少STAU1基因对HBX蛋白表达水平的影响。过表达或者敲低STAU1不影响HBX蛋白质的泛素化水平,因此STAU1对HBX的影响通过泛素非依赖蛋白酶体途径介导。结论本研究通过优化Turbo ID邻近蛋白标记技术,建立了一种新的HBV转录相关因子的筛选系统,利用该系统我们筛选并鉴定出HBV转录相关因子STAU1。STAU1可通过TARDPB与HBV核心启动子间接结合,同时招募SAGA转录共激活复合体激活HBV转录。此外,STAU1可与HBV病毒蛋白HBX相互作用,通过泛素非依赖蛋白酶体降解途径调控HBX蛋白的稳定性,进一步促进HBV复制。
韩聪[2]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中研究指明猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
刘悦[3]（2020）在《宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是严重的公共卫生健康问题,是导致肝硬化及原发性肝细胞癌的主要原因。世界范围内有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒,我国形势尤其严峻,有超过8000万成年人为HBV携带者,控制HBV感染的要求十分迫切。目前抗HBV的药物主要为干扰素类药物及核苷酸类似物,虽能取得一定疗效,但由于其治愈率仍旧较低,以及各种副作用（如骨髓抑制、神经精神症状加重等）和耐药性的产生,使得大多数患者需要接受无限期的治疗。因此,进一步研究HBV感染与人体相互作用机制,寻找新的治疗靶点,具有重要的临床意义和价值。乙型肝炎病毒是一种具有包膜的嗜肝性病毒,是最小的通过逆转录进行复制的部分双链环状DNA病毒,基因组长度约3.2kb。在HBV病毒感染细胞过程中,其疏松的环状DNA（rc DNA）进入细胞核修复成高度稳定的共价闭合环状DNA（ccc DNA）,之后以ccc DNA为模板转录出各种HBV病毒的RNA,包括前基因组RNA（pg RNA）。HBV的包膜蛋白包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）、小蛋白（SHBs）三种形式,在HBV的生活周期中起到重要的作用。病毒与宿主间复杂的相互作用关系,提示我们深入地研究病毒与宿主之间相互作用机制,通过机制揭示,可以为开发针对HBV的创新型药物提供更多的新的药物作用靶点。在对人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）的研究中,人们发现了人体内一系列能够拮抗HIV的宿主蛋白,称为宿主限制性因子。作为科学家们竞相研究的前沿热点科学问题,宿主限制性因子主要包括APOBEC3家族,TRIM5α,BST-2,SAMHD1,Mx2,GBP5等。宿主限制性因子能够干扰包括病毒脱衣壳、核酸进入、基因组复制、病毒粒子释放及融合等在内的病毒复制各个阶段,并且其抗病毒能力往往具有广谱性。2015年,科学家发现了一种新的限制性因子—丝氨酸整合因子5（serine incorporator 5,SERINC5）对HIV病毒感染的抑制作用。证明了HIV辅助蛋白Nef缺失的情况下,分布在细胞膜上的SERINC5会在HIV子代病毒释放过程中整合入病毒粒子包膜,使其在进入下一个靶细胞时受阻,从而降低HIV的感染性,抑制HIV病毒的复制。而Nef则通过将SERINC5限制在核周的囊泡阻止其包装入子代病毒包膜,帮助病毒逃避SERINC5的限制。鉴于宿主限制性因子抗病毒的广谱性,结合SERINC5是通过影响HIV包膜蛋白的组成结构从而降低HIV感染性的机制,那么SERINC5对其它具有包膜的病毒粒子是否具有类似影响?本研究将SERINC5应用于同样具有包膜的HBV,探讨SERINC5对HBV复制的调控作用,得出了以下实验结果及结论:1.SERINC5能够抑制HBV的分泌;本研究在Hep G2细胞中转染HBV感染性克隆质粒,同时呈剂量梯度分别共转SERINC5、SERINC3和SERINC1质粒,用ELISA方法检测上清中HBV表面抗原（HBs Ag）的含量。与对照组相比,SERINC5组细胞上清中HBV HBs Ag明显减少,而SERINC3组及SERINC1组无此现象。同时,本研究用免疫共沉淀的方法提纯上清中HBV完整病毒粒子,并使用实时定量PCR检测病毒粒子DNA水平,发现SERINC5组上清中HBV完整病毒粒子明显减少。那么,SERINC5是在HBV复制的哪一个阶段发挥了抑制作用呢?本研究使用Southern blot及Northern blot技术分别检测发现细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA的含量均未受到影响。这说明,SERINC5抑制了HBV完整病毒粒子及表面抗原的分泌。本研究同时使用RNA干扰技术,在Hep G2细胞中下调SERINC5的表达,发现上清中HBs Ag及HBV完整病毒粒子的含量均有所增加,而细胞内HBV核心颗粒DNA及整体RNA含量均无变化。在Hep G2.2.15细胞中过表达SERINC5,得到与Hep G2细胞中相同的结果。本研究同时建立了感染体系,在Hep G2-NTCP细胞中过表达SERINC5,并用Hep AD38产生的HBV病毒进行感染,同样得到SERINC5抑制HBs Ag及HBV完整病毒粒子分泌的结果。以上结果说明,SERINC5能够抑制HBV的分泌。2.SERINC5影响HBV包膜蛋白包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）、小蛋白（SHBs）的糖基化修饰;为了探究SERINC5抑制HBV分泌的机制,本研究考察了SERINC5对HBV各种功能蛋白的影响。发现SERINC5能够影响HBV包膜蛋白包括LHBs、MHBs、SHBs的糖基化修饰,使其糖基化形式减少,而非糖基化形式增加。3.SERINC5通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,达到抑制HBV病毒粒子分泌的作用本研究设计了HBV包膜蛋白糖基化位点突变体,发现SERINC5对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似,同时也与衣霉素对LHBs,MHBs和SHBs糖基化的抑制作用相似。根据前人研究已经指出的包膜蛋白去糖基化严重损害HBV病毒粒子的分泌,本研究又使用p HBV1.3-ENV-质粒,野生型LHBs质粒及LHBs N146A糖基位点突变质粒,设计病毒合成包装分泌实验,考察SERINC5对HBV分泌的影响。确定SERINC5是通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌这一观点。4.SERINC5与LHBs共定位在细胞的高尔基体;蛋白质糖基化修饰过程中,翻译后的蛋白质首先在内质网腔内或内质网膜被连接上糖链,随后被运送到高尔基体中,经过一系列糖基转移酶及糖苷酶继续添加糖链并对合成的糖链进行剪切等进一步修饰,最后成为成熟的糖蛋白。为了进一步探究SERINC5影响HBV包膜蛋白糖基化修饰的机制,本研究选用了免疫荧光共定位技术,分析SERINC5与LHBs在Hep G2细胞中的亚细胞定位。发现当LHBs单独存在时,其在细胞质中均匀分布,但在SERINC5存在的情况下,LHBs则与SERINC5完全定位在高尔基体中而不是内质网。并且免疫共沉淀技术证实SERINC5能够分别与LHBs、MHBs、SHBs结合。因此,本研究分析认为SERINC5影响了HBV包膜蛋白在细胞中的定位,从而影响其糖基化修饰。5.对SERINC5抑制HBV功能区进行鉴定。SERINC5属于膜蛋白,据推测具有10个跨膜螺旋结构。本研究设计了不同的SERINC5截短体、磷酸化突变体及糖基化突变体,目的是鉴定SERINC5抑制HBV分泌的功能区。实验发现SERINC5的第四至第六穿膜结构域对于其抑制HBV的功能是不可或缺的。对预测的SERINC5两处磷酸化位点S34、T333分别进行突变后,其抑制HBV的功能有轻度的减低。但由于SERINC5分别缺失34和333的两个截短体（145-461和1-311）仍保留完整的抗HBV活性,说明这两个点突变并不是通过影响磷酸化修饰来影响SERINC5抗HBV活性。另外两个SERINC5保守的糖基化位点N133和N294与其对HBV的抑制作用无关。综上所述,本研究运用病毒学、分子生物学及细胞生物学手段,证明了SERINC5对HBV分泌的抑制作用,并揭示了SERINC5通过与HBV包膜蛋白结合,改变其亚细胞定位,使其重新分布在高尔基体,从而影响HBV包膜蛋白糖基化修饰,抑制HBV病毒分泌的这一机制。SERINC5是一种潜在的抗HBV内在因子,对SERINC5的深入研究可能为我们提供一条抗HBV的新途径,并对研究其他病毒起到启示作用。
周建卫[4]（2020）在《猪圆环病毒的入核机制研究》文中研究指明猪圆环病毒（PCV）是猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原,是目前发现能在哺乳动物体内复制的最小DNA病毒,主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）。已有的研究分析了 PCV2的吸附、入侵、基因组的复制和转录调控等过程,但其胞内运输和入核机制尚不明确,病毒能否成功将遗传物质（环状DNA）运输至细胞核周并最终入核决定它能否进行有效复制。病毒与宿主间的相互作用是机体致病机理和免疫防御之间的一场旷日持久的拉锯战,其最终结局或是激活宿主的免疫防御系统以消灭病毒,抑或是劫持宿主的免疫防御机制以促进病毒的传播。因此,全面系统地了解宿主和病毒蛋白之间的相互作用以及病毒如何通过与宿主间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）劫持宿主细胞的生物学过程,可为探究病毒的复制与致病机制和开发新的抗病毒药物提供有效的信息和线索。本研究首先发现PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性,有利于PCV2病毒粒子的核靶向运输过程,且通过与HDAC6蛋白相互作用抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能,并最终促进圆环病毒的复制过程。其次从免疫共沉淀串联质谱方法入手,发现核仁磷蛋白NPM1能与PCV2Cap蛋白相互作用,且证明PCV2病毒以完整衣壳蛋白的形式经微管运输至细胞核周时,Cap蛋白能促使NPM1蛋白发生核穿梭,导致其由核仁易位至核质和胞质处,并通过与Cap蛋白直接结合介导病毒粒子的入核,从而促进猪圆环病毒的复制。最后,NPM1蛋白还能通过与PCV3 Cap蛋白NLS结合促进PCV3 Cap蛋白的核仁定位,NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用。1、PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程本实验室前期结果表明在PCV2病毒感染早期衣壳蛋白能通过募集胞浆动力蛋白的IC1亚基进行核靶向运输过程。为了分析其他宿主蛋白是否能通过影响微管的功能发挥参与调控PCV2的胞内运输过程以及PCV2能否调节微管蛋白的乙酰化修饰从而影响微管稳定性,我们通过PCV2感染和Cap蛋白表达处理PK-15细胞并分析乙酰化α-tubulin的表达水平,结果发现α-tubulin的乙酰化修饰水平大大提高;而通过HDAC6去乙酰化酶特异性抑制剂-Tubacin药物处理PK-15细胞后可以增强α-tubulin的乙酰化修饰水平并能促进PCV2的复制过程,该结果暗示了 PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性的功能。另外,我们还发现PCV2 Cap蛋白能与HDAC6蛋白共定位和直接相互作用,且Cap蛋白的N端区域（42-100aa）介导与HDAC6蛋白全长相互作用。PCV2 Cap蛋白能在体外和细胞内抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性。HDAC6蛋白能通过诱导α-tubulin发生去乙酰化修饰抑制PCV2病毒的复制从而发挥抗病毒作用,反过来PCV2也能通过Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能。综上所述,PCV2 Cap蛋白能通过与HDAC6相互作用抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性,维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并最终促进猪圆环病毒2型的复制过程。2、PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱PCV2 Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白,可以作为研究圆环病毒与宿主蛋白间相互作用的模型,以便更好地了解病毒的复制周期。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,在PCV2感染PK-15细胞中鉴定到222个与Cap蛋白潜在互作的宿主蛋白,并绘制出一张蛋白质-蛋白质相互作用网络图。GO注释和KEGG通路分析结果表明,与PCV2 Cap蛋白互作的宿主蛋白可能参与了蛋白质结合、DNA转录和复制、物质和能量代谢、先天性免疫应答、MAPK信号通路和剪接体信号通路激活等不同的生物学过程。Co-IP和 GST pull-down 实验证明 PCV2Cap 蛋白能与 hnRNPC、NPM1、DDX21、IC1等蛋白直接相互作用。PCV2Cap蛋白互作宿主蛋白可能会形成新的转录/复制复合体（replication-transcriptioncomplex,RTC）,在 PCV2 的复制和致病过程中起着极其重要的调控作用。3、NPM1蛋白调控PCV2病毒入核的机制研究病毒粒子的入核是PCV2复制的必要条件。然而,核仁穿梭蛋白在PCV2入核过程中的作用机制仍不清楚。本研究首次在PCV2Cap蛋白中鉴定到一个先前未知的、新的核仁定位信号（NoLS）,并发现PCV2能利用宿主的NPM1蛋白促进病毒的复制。激光共聚焦显微镜结果显示,在PCV2感染过程中,NPM1蛋白能从核仁易位至核质和胞质处。Co-IP和GST pull-down实验结果表明,PCV2 Cap蛋白能与NPM1蛋白直接相互作用。互作功能域的精细定位结果显示,PCV2 Cap蛋白NLS-A（1MTYPRRRYRRRRHRPRSHLG20）的精氨酸富集区（ARM）与NPM1-OligoD结构域的Ser48是介导二者相互作用的关键性氨基酸位点。病毒拯救结果表明,PCV2 Cap蛋白NLS-A中ARM的9个精氨酸（Arg）都突变为丙氨酸（Ala）将导致病毒的复制能力降低。NPM1蛋白的敲降和Ser48突变为Glu48都能抑制PCV2的复制。此外,激光共聚焦显微镜结果表明PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM是核仁定位信号（NoLS）。综上所述,PCV2Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,能够通过与NPM1蛋白直接结合促进PCV2病毒的入核。4、NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究NPM1蛋白对非组装的PCV3 Cap蛋白入核的作用机制尚不清楚。本研究首次鉴定到PCV3Cap蛋白新的核仁定位信号（NoLS）,它能利用NPM1蛋白促进自身的核仁定位。激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3Cap蛋白能与NPM1共定位于核仁。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,PCV3 Cap蛋白能与NPM1蛋白相互作用。互作结构域的精细定位结果表明,来自陆地的、水生的和禽类的（包括猪、金丝雀、犬、水貂、蜻蜓、鸽、鸭、蝙蝠、鹅和鹦鹉）圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用,表明该互作在进化上极为保守;另外,NPM1-OligoD结构域中Ser48是介导与PCV3 Cap蛋白相互作用的关键性氨基酸位点。NPM1蛋白敲降后将抑制PCV3 Cap蛋白的核仁定位。此外,激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3 Cap蛋白的NLS是核仁定位信号（NoLS）,且NPM1蛋白中Ser48的电荷性质决定与PCV3 Cap蛋白的相互作用。综上所述,PCV3 Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,NPM1蛋白中Ser48的电荷性质对其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用至关重要。上述数据旨在阐明猪圆环病毒复制过程中借助HDAC6和NPM1蛋白实现胞内运输和入核的策略以及“核穿梭”机制,有助于进一步解析猪圆环病毒复制的分子机制以及鉴定潜在的抗病毒药物靶点。
郑晓文[5]（2020）在《乙肝核心抗原双抗体夹心酶联免疫方法的建立》文中指出研究背景:HBV感染是全球主要公共卫生问题之一,目前仍有2.57亿慢性感染者。HBV感染很难被根治,但部分患者可实现功能性治愈。一方面,HBV感染者抗病毒治疗后,病毒复制可得到完全抑制,其中部分NAs经治患者再次接受IFN-α治疗后,HBsAg水平降低甚至检测不到,达到功能性治愈标准。另一方面,在儿童慢乙肝患者中,干扰素抗病毒治疗后不仅获得较高HBsAg转阴率,并且在年龄越小的患者中更易产生HBsAb。在HBV功能性治愈可实现的历史背景下,如何评价HBV功能性治愈变得尤为重要。目前临床中所用的HBV DNA和乙肝五项检测技术不能满足对功能性治愈的有效评判,其中抗病毒治疗患者的HBV DNA即使在检测不到的状态下,停药后病毒会反弹,说明HBV DNA不能用于判断HBV功能性治愈。HBeAg阴性患者的特殊情况是,在HBV患者中存在前核心突变,即使有HBV病毒也不表达HBeAg。另外,HBV DNA可以整合到宿主基因组中,可以持续表达HBsAg。即使已经实现功能性治愈,但HBsAg仍会表达,也不能作为HBV功能性治愈的标准。近年来,HBV pgRNA与HBcrAg用于监测肝内ccc DNA的数量和转录活性,预测停药后复发风险。HBcrAg包括HBcAg、HBeAg以及P22蛋白,其中HBeAg在血清浓度远高于HBcAg。因此HBcrAg不能在HBeAg阳性和阴性患者之间进行有效比较。HBcAg是病毒核壳蛋白,由pgRNA直接翻译得到,其表达不受抗病毒治疗药物直接影响。血清中HBcAg定量检测可在HBeAg阳性和阴性患者发挥评估作用,预测抗病毒治疗患者的治疗应答与停药后复发风险,有潜力作为一项HBV功能性治愈评价指标,因此开发HBcAg双抗体夹心ELISA法有重要临床意义。为获得高亲和力的抗体,我们选择制备兔源单克隆抗体,在原核表达了HBcAg,免疫新西兰兔得到了4株单克隆抗体。为了更好特异性识别HBcAg,我们合成HBcAg-C末端特异性多肽作为免疫原,免疫BALB/c小鼠得到了5株单克隆抗体,对所获抗体用ELISA与Western blot进行分析。随后利用生物素标记技术进一步提高单克隆抗体识别能力。选择特异性强的单克隆抗体进行配对组合初步建立HBcAg双抗体夹心ELISA法。研究目的1.筛选识别HBcAg的兔源单克隆细胞株;2.制备针对HBcAg-C末端特异序列的鼠源单克隆抗体;3.初步开发检测HBcAg双抗体夹心ELISA方法。研究方法在原核表达系统（BL21（DE3））菌表达HBc Ag重组蛋白,经镍柱亲和层析与source Q柱两步纯化得到HBcAg重组蛋白。以HBcAg重组蛋白作为免疫原,免疫4只新西兰兔,第3次免疫1周后,通过耳静脉采血,用间接ELISA方法检测兔抗血清效价。选免疫效价较高的实验兔,取脾细胞与240E-W2骨髓瘤细胞进行细胞融合,单细胞铺板。培养15天后收集细胞培养上清。对获得稳定阳性单克隆细胞株利用ELISA和Western blot分析结果。设计HBcAg-C末端特异性多肽序列并合成,以多肽作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,第3次免疫1周后,通过尾静脉采血,用间接ELISA方法检测鼠抗血清效价,选免疫效价较高的小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,单细胞铺板。培养10天后,收集细胞上清。对获得稳定阳性单克隆细胞株利用ELISA分析结果。采用小鼠体内诱生法获得腹水并纯化得到抗体。研究结果1.重组HBcAg蛋白表达在BL21（DE3）菌表达HBcAg,诱导表达产物在21KDa出现清晰条带,说明重组蛋白HBcAg表达成功,纯化后经SDS-PAGE,使用His-tag抗体western blot证明纯化得到重组HBcAg。2.兔抗血清效价采取免疫前实验兔血清（作为阴性对照）与免疫后血清,以1:1000开始稀释,2倍梯度稀释免疫后兔抗血清,通过ELISA方法分析结果可得4只免疫新西兰兔效价均可达1:512000,其中4号免疫兔效价最高。3.细胞融合筛选结果选择高效价免疫兔脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,收集细胞上清,通过间接ELSIA法进行检测,第一轮初步筛选450块96孔板,结果显示有90株OD 450nm值≥0.5,后经再次确认筛选,获得了7株稳定阳性克隆细胞株。4.HBcAg兔单克隆细胞株特异性鉴定以0.4μg/ml重组HBcAg（rHBcAg）为包被抗原,检测上述所得7株抗HBcAg单克隆抗体,稀释至4000倍OD450nm值均>0.5,说明7株抗体均可有效识别rHBcAg;其中#1、#3单克隆抗体稀释至16000倍OD450nm值仍>0.5,且阴性对照OD450nm值<0.1,说明这两株与rHBcAg结合活性更强。随后,Western blot分析结果显示,以真核细胞表达的HBcAg为抗原,#5、#6、#7、#8单克隆抗体在21 KDa位置检测到条带;以重组HBcAg蛋白为检测抗原,#1、#3、#5、#7单克隆抗体可在21 KDa位置检测到清晰条带。5.抗体序列比对分析将获得7株兔源单克隆细胞株经测序分析,结果显示其中4株单克隆细胞株重链V区序列一致。6.抗HBcAg-C端鼠源单克隆抗体间接ELISA检测合成HBcAg-C端特异性多肽免疫小鼠,制备了5株单克隆抗体。以0.3μg/ml HBcAg-C端多肽-1为包被抗原,2号鼠单抗在稀释16000倍（0.625μg/ml）条件下,OD450nm值为0.179,说明2号鼠单抗可有效识别HBcAg-C端多肽-1。以0.3μg/ml HBcAg-C端多肽-2为包被抗原,5号鼠单抗稀释至相同倍数OD450nm值为0.292,说明5号鼠单抗可有效识别HBcAg-C端多肽-2。以10μg/ml rHBcAg为包被抗原,0.625μg/ml 2号鼠单抗为一抗,OD450nm值为0.236,说明2号鼠单抗与rHBcAg有良好识别活性。7.评价生物素标记抗HBcAg-C端鼠源单克隆抗体识别效果为提高检测灵敏度,对2号鼠单抗进行生物素标记,以10μg/ml rHBcAg为包被抗原,50μg/ml生物素标记的2号鼠单抗作为一抗,OD450nm值接近2.0,说明生物素标记2号鼠单抗与rHBcAg有较强的结合活性。8.检测HBcAg的双抗体夹心ELISA法初步摸索尝试包被不同株兔多抗/兔单抗,与二抗生物素标记2号鼠单抗进行组合,建立双抗体夹心ELISA法检测rHBcAg。以兔多抗为包被抗体,浓度从1:100梯度稀释至1:2500,检测不同浓度rHBcAg,2μg/ml生物素标记2号鼠单抗作为识别抗体,结果显示,检测3.2 ng/ml rHBcAg,OD450nm值在0.2～0.5,阴性对照值均<0.15,说明此组合可有效识别rHBcAg。结论1.在大肠杆菌表达系统中,成功表达并纯化得到全长HBcAg重组蛋白。2.免疫新西兰兔,兔抗HBcAg血清效价均达到很高水平,表明免疫策略是成功的。随后利用杂交瘤技术获得了4株兔抗rHBcAg单克隆抗体,均对rHBcAg有良好识别活性。3.免疫小鼠,利用杂交瘤技术获得了5株鼠抗HBcAg特异性C端单克隆抗体,2号鼠单抗对HBcAg-C端多肽-1和rHBcAg有良好识别活性,5号鼠单抗对HBcAg-C端多肽-2有良好识别活性。随后利用生物素标记的2号鼠单抗也对rHBcAg具有较好的结合活性。研究目的表达并纯化兔源单克隆抗体,用于建立检测HBcAg的双抗体夹心ELISA方法。研究方法通过常规酶切连接方式将所得4株单克隆抗体DNA克隆连接至pcDNA3.0载体上,构建真核表达质粒。在293T细胞中转染重组表达质粒,收集细胞培养上清并利用protein A进行抗体纯化,用ELISA法确证抗体,并选择其中两株兔源单克隆抗体进行生物素标记以提高检测的灵敏度。将所得兔源单克隆抗体与鼠源单克隆抗体进行配对组合,建立检测HBc Ag的双抗体夹心ELISA方法。研究结果1.经酶切琼脂糖凝胶电泳与测序确证,成功构建4株单克隆抗体的表达质粒。将重链表达质粒与轻链表达质粒共同转染至293T细胞,转染后收集细胞上清利用protein A纯化经考马斯亮蓝染色分析显示4株重组抗体均可成功表达。2.以2μg/ml#1和#5兔单抗混合液为包被抗体,10μg/ml生物素标记2号鼠单抗为识别抗体,在检测不同rHBcAg浓度条件下OD450nm值均<0.4,阴性对照OD450nm值为0.20～0.25。相同包被情况下,0.5μg/ml生物素标记#3和#7兔单抗混合液为二抗,检测40 ng/ml rHBcAg OD450nm值为0.13,阴性对照OD450nm值<0.05,说明此组合可检测到rHBcAg最低浓度为40 ng/ml。结论1.成功构建可大量表达兔单抗的真核表达系统,得到的兔单抗均与rHBcAg有很强结合活性。2.初步建立了一种基于兔单克隆抗体检测HBcAg的双抗体夹心ELISA法,检测rHBcAg达到ng数量级别。
丁文斌[6]（2020）在《乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究》文中研究表明乙型肝炎病毒前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）作为乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的反转录模板以及HBV聚合酶蛋白（polymerase,Pol）和核心抗原（HBV core antigen,HBc Ag）的翻译模板,在HBV的生命周期中发挥了重要作用[1-3]。近年来相关研究发现慢性乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的外周循环血中可以稳定的检测到HBV RNA,且血清HBV RNA主要以pg RNA的形式存在于CHB的外周循环中;在长期服用核苷类似物（Nucleoside analogs,NAs）抗病毒治疗,血清HBV DNA水平在临床上为阴性（即未检出）的CHB患者中,其血清pg RNA表达水平不但与肝内pg RNA水平呈正相关关系,还可以反映出CHB患者肝脏的炎症和纤维化程度[4,5]。此外,还有许多研究提出血清pg RNA可以作为一种潜在的生物学标志物,用于评价NAs抗病毒治疗效果,检测NAs治疗中的病毒突变以及指导NAs治疗的安全停药[6-10]。然而,pg RNA在HBV相关肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生及进展过程中发挥了何种作用尚不明确。此外,相关研究报道α干扰素2a（Interferon-α-2a,IFN-α-2a）可以抑制pg RNA的转录,且在HBV相关HCC行根治性手术的患者中,术后IFN-α-2a辅助治疗能够降低他们HCC的复发率并提高总体生存率,但具体作用机制仍不明确[11-13]。在本研究中,我们首先探索了pg RNA在HBV相关HCC发生和进展中的作用及机制。其次,我们探索了干扰IFN-α-2a除了直接抗肿瘤作用外,能否通过抑制pg RNA发挥预防HBV相关HCC发生和进展的作用。本研究分为以下两个部分。本研究的第一部分中,我们首先从本中心临床样本库中选取了136例术前服用NAs药物抗病毒治疗至少48周,血清HBV DNA阴性的慢乙肝肝癌患者,对其术前的血清,术中切除的肝癌及癌旁组织中pg RNA的表达量进行检测。结果显示癌旁组织中pg RNA的表达高于癌组织,且血清pg RNA表达与癌旁组织pg RNA表达呈正相关关系（r=0.63,p<0.001）。接下来我们根据患者血清pg RNA的表达水平,使用中位数法把患者分为血清pg RNA高表达组和血清pg RNA低表达组,然后对其基本临床病理学信息进行分析和比较。结果显示血清pg RNA高表达不但与更低的肿瘤分化程度（p=0.014）,更严重的肝脏炎症程度（p=0.006）,纤维化程度（p=0.013）及肝硬化（p=0.040）相关,而且还与HBV e抗原（HBV e antigen,HBe Ag）阳性（p=0.004）和HBV表面抗原（HBV surface antigen,HBs Ag）滴度（p=0.007）密切相关。此外,血清pg RNA高表达在患者的总生存期（Overall survival,OS）更短（p=0.0166）,肝癌的累计复发率（Cumulative recurrence rate,CRR）更高（p=0.0157）。多因素分析表明血清pg RNA高表达是肝癌患者手术后死亡（OS:95%CI=1.197-3.356,p=0.008）和肝癌复发的独立危险因素（CRR:95%CI=1.167-3.058,p=0.010）。对临床数据的分析提示pg RNA可能在HCC发生和进展中发挥了重要作用。接下来我们通过体内体外等功能实验进一步探索pg RNA在肝癌发生和进展中的作用。我们使用pg RNA特异性短发卡RNA（sh-RNA）成功构建了稳定干扰pg RNA的Hep G2.2.15肝癌细胞系。同时,我们使用pg RNA全长过表达质粒成功在肝癌细胞Hep G2.2.15和Huh7中过表达了pg RNA并挑取了稳定过表达单克隆。Cell Counting Kit-8（CCK-8）,克隆形成,Ed U,细胞流式,成球及体内和体外绝对稀释等实验表明敲低pg RNA的表达能够抑制细胞的增殖能力,克隆形成能力,抑制肝癌细胞的抗细胞凋亡能力,同时抑制肝癌细胞的干细胞特性（简称干性）和成瘤能力;而在肝癌细胞中过表达pg RNA后,肝癌细胞的增殖能力,克隆形成能力,抗凋亡能力,干性及成瘤能力进一步增强。体内外功能实验结果进一步证明了pg RNA与HCC的发生及进展密切相关。在探索pg RNA促进HBV相关HCC发生和进展的机制研究过程中,通过RNA pull-down实验[14],银染实验和蛋白质谱分析,我们发现pg RNA可与一个经典的促癌分子胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白3（Insulin-like growth factor 2 m RNA binding protein 3,IGF2BP3）直接结合并相互调节。接下来,我们又通过RNA pull-down和蛋白免疫印迹（Western blot）,RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和RNA原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）共聚焦等实验进一步验证了pg RNA与IGF2BP3的直接相互结合作用,且两者结合后pg RNA的稳定性得到增强。接下来,通过一系列的实验和生物信息学预测分析,我们发现pg RNA通过海绵样吸附mi RNA-let-7e-5p,在转录后修饰水平上调IGF2BP3的表达。此外,通过细胞功能的加减法实验,我们发现过表达pg RNA对肝癌增殖能力和干性的促进作用可以被进一步干扰IGF2BP3所阻断。总之,我们的研究发现在CHB患者体内,pg RNA与IGF2BP3之间存在相互调节作用。一方面,pg RNA与IGF2BP3直接结合,且两者结合后pg RNA的稳定性会升高;另一方面,pg RNA可通过海绵样吸附作用,隔离IGF2BP3抑制性的mi R-let-7e-5p,增加IGF2BP3 m RNA的稳定性,从而在转录后修饰水平上调IGF2BP3蛋白的表达。综上所述,我们第一部分部分的研究发现pg RNA-IGF2BP3信号轴在HBV相关HCC发生和进展过程中发挥了重要作用。本研究的第二部分中,我们探索IFN-α-2a能否通过抑制HBV-pg RNA,进而抑制HBV相关HCC的发生和进展。我们使用IFN-α-2a处理Hep G2.2.15肝癌细胞不同的时间段后,对pg RNA和IGF2BP3的表达变化进行检测。结果显示,当我们使用IFN-α-2a处理细胞0-24 h时,pg RNA和IGF2BP3 m RNA的表达从处理4 h后开始明显下降,但IGF2BP3蛋白水平未明显变化。接下来,我们使用IFN-α-2a处理细胞更长的时间（0-7天）,结果显示pg RNA和IGF2BP3的m RNA的表达水平从处理4 h起开始明显下降,IGF2BP3蛋白水平从处理24 h后开始明显下降。此外,当我们用IFN-α-2a处理不表达pg RNA但遗传背景与Hep G2.2.15相同的Hep G2细胞相同时间后,IGF2BP3无论在m RNA还是蛋白水平均未发生明显变化。这些结果提示IFN-α-2a无法直接下调IGF2BP3的表达,而是通过抑制pg RNA进而下调IGF2BP3的表达,发挥抑制HCC进展的作用。接下来,我们通过体内体外细胞功能加减法实验进一步验证IFN-α-2a是否通过抑制pg RNA发挥抑制HCC发生和复发的作用。首先,我们使用IFN-α-2a和等体积生理盐水分别处理pg RNA过表达单克隆和对应的阴性对照单克隆细胞。结果显示pg RNA的过表达可以在一定程度上逆转IFN-α-2a对肝癌细胞增殖能力和干性的抑制作用。接下来,我们使用pg RNA过表达单克隆和对应阴性对照单克隆细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型,并使用IFN-α-2a或等体积生理盐水分别处理相应的裸鼠。结果显示过表达pg RNA后可以部分逆转IFN-α-2a对皮下荷瘤生长的抑制作用。综上,这些结果提示IFN-α-2a除了直接抗肿瘤生长作用外,在HBV相关HCC中还可以通过阻断pg RNA-IGF2BP3轴从而抑制肝癌细胞的增殖能力和干性,最终发挥抑制HCC进展的作用。相关研究已发现IFN-α-2a可以抑制pg RNA的转录[15]。此外,最近的研究也发现在HBV pg RNA的5’和3’末端茎环结构上存在N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,且m6A修饰程度增强后,HBV的所有转录本（包括pg RNA）的稳定性及相应的翻译产物会被下调[16]。因此,我们接下来探索IFN-α-2a处理对pg RNA稳定性及其m6A修饰的影响。通过放线菌素D（Actinomycin D）转录抑制实验并进一步计算pg RNA半衰期,我们发现经IFN-α-2a处理48 h后,pg RNA的稳定性明显下调。接下来我们通过基因特异性m6A q PCR,进一步验证IFN-α-2a处理对pg RNA的m6A修饰的影响。结果显示,IFN-α-2a处理能够明显增加pg RNA的m6A修饰水平。同时我们也检测了经IFN-α-2a处理后,m6A修饰过程中三个重要蛋白甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）,甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）以及脂肪和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的表达变化[17]。结果显示,经IFN-α-2a处理的Hep G2.2.15细胞中METTL3和METTL14的表达明显升高,而FTO的表达明显下降。提示IFN-α-2a可能通过上调肝癌细胞中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达同时下调去甲基酶FTO的表达,进而增加pg RNA的m6A修饰水平。综上所述,我们该部分的研究发现IFN-α-2a除了直接的抗肿瘤作用外,在HBV相关HCC中还可以通过增加HBV-pg RNA的m6A修饰水平,促进pg RNA的降解,从而抑制pg RNA-IGF2BP3信号轴,发挥预防HCC发展的作用。
魏杰[7]（2020）在《Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究》文中研究说明目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种小病毒基因组的部分双链DNA病毒,HBV导致的慢性乙肝仍然是一个全球公共卫生问题,即使得益于乙肝疫苗和抗病毒药物的临床应用,目前全世界仍超过2亿人患有慢性乙肝,乙肝的长期发展又会导致肝硬化和肝癌的发生,对人类的身体健康造成严重威胁。Id1蛋白是分化抑制因子（Id1-4）中的一员,属于bHLH转录因子家族,由于Id1缺少了与DNA结合的碱性（basic）区,导致Id1蛋白通过与其他bHLH转录因子结合形成异源二聚体从而抑制了bHLH转录因子对下游靶基因的调控。Id1的功能主要与促进细胞增殖和抑制分化相关,许多参与调控细胞增殖的基因,同样参与HBV的表达调控,此外如E2F4转录因子也属于H（helix）超家族,已被报道与Id2存在相互作用,而该因子在HBV的复制调控中的作用还未见报道。因此本文重点研究了宿主因子Id1及相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录过程中的调控作用及其分子机制,其研究结果进一步丰富宿主因子对HBV的调控网络,并有助于基于该机制研发新的抗病毒药物。方法:1,在临床样本中,运用qRT-PCR和western blot实验分析HBV相关的肝细胞肝癌中癌旁与肿瘤的HBV pgRNA的转录水平以及Id1和HBV核心蛋白的表达水平。2,在细胞水平和动物水平,同样应用western blot实验比较HBV复制阳性和HBV复制阴性的细胞以及HBV转基因小鼠和非转基因小鼠中Id1的表达水平。3,进一步应用western blot分析HBV四种蛋白（HBc/p/s/x）对Id1的影响以及研究HBV在HepG2-NTCP感染模型中对Id1的作用。4,运用Id1Ad感染HBV复制的细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1）实现Id1蛋白的过表达,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化;应用qPCR检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA和pgRNA的变化。5,运用pCDNA3.1-Id1转染HBV感染HepG2-NTCP模型,应用qPCR检测其中HBV DNA的变化。6,应用靶向Id1的shRNA1/2干扰序列降低HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞中的Id1水平,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化。7,通过尾静脉注射Id1Ad感染HBV-TgM,在体内小鼠过表达Id1,同样应用Southern blot和qPCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA的变化,应用western blot和IHC检测肝组织细胞Id1和HBc蛋白的变化,采用ELISA检小鼠血清中HBeAg的变化。8,通过qRT-PCR和western blot筛查Id1过表达对调控HBV的经典宿主因子的影响。9,通过qRT-PCR筛查HBV复制的细胞中的mRNA水平发生改变的HLH转录因子。10,构建潜在的发生变化的HLH因子的过表达质粒,通过筛查它们对HBV Cp启动子的影响,特别是E2F4发挥了对Cp启动子活性显着的促进作用。11,进一步研究比较了E2F4在HBV复制的HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞中以及25对临床样本中癌组织和癌旁组织的各自表达情况。12,利用E2F4Ad感染HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞过表达E2F4,应用qPCR检测其中HBV DNA和pgRNA的变化。13,免疫荧光试验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验检测E2F4与Id1之间的相互作用。14,胞浆胞核蛋白分离联合western blot试验检测HBV复制和Id1对细胞中E2F4的核内外分布的影响。15,HepG2.2.15分别在过表达E2F4和干扰Id1以及过表达Id1和干扰E2F4之后,Southern blot检测HBV DNA的复制水平。16,ChIP实验检测Cp启动子是否招募E2F4蛋白,Id1对该招募的影响。17,应用体外EMSA实验检测Cp启动子和E2F4蛋白是否存在直接相互作用。18,根据E2F4的二级结构和识别位点规律,生物信息学进行分析E2F4在Cp启动子上存在的潜在识别位点,构建相应的启动子突变体,应用荧光素酶活性实验验证潜在位点的缺失是否导致E2F4对HBV的调控受阻。19,体外SPR实验和ITC实验检测E2F4截短蛋白和Cp启动子DNA链的相互结合作用。20,根据潜在位点构建相应的HBV1.3倍体突变体,通过ChIP实验检测突变的Cp启动子对E2F4的招募情况。21,在Huh7细胞中转染HBV1.3倍体突变体,qPCR检测该细胞分别感染E2F4Ad和Id1Ad后HBV DNA的变化,ELISA检测细胞上清中HBeAg的变化。22,生物信息学比对分析常见的四种HBV基因型（Gt A/B/C/D）中E2F4潜在识别位点的保守性,进而应用southern blot和qPCR检测E2F4和Id1对四种HBV复制调控作用的普适性。结果:1,在25对HBV相关的肝癌与癌旁组织样本中,癌旁样本的pgRNA整体表达水平大约是肝癌组织的两倍（P<0.05）,其中20对样本的HBc的蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织,有18对样本的Id1的蛋白表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁。2,在HBV稳定复制的细胞和HBV瞬时转染的细胞中Id1 mRNA和蛋白水平均明显低于非HBV复制的对照肝癌细胞。3,在HBV感染细胞模型中,HBV的感染导致Id1的蛋白水平明显减少,过表达HBV相关蛋白HBp和L-HBs同样导致Id1蛋白水平的降低,HBV转基因小鼠的肝组织中,Id1蛋白水平也显着低于普通C57小鼠。4,Id1过表达可显着抑制HBV复制细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体,pgRNA和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.01）,此外过表达Id1也显着下调HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的复制水平和Cp启动子的活性（P<0.05）。5,下调Id1的表达可显着促进HBV复制细胞（HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.05）。6,Id1过表达可显着抑制HBV转基因小鼠肝组织中HBV DNA复制水平和HBc的表达水平,也导致血清HBeAg分泌水平的显着下降（P<0.05）。7,在HepG2.2.15细胞中,Id1过表达没有导致经典的HBV调控因子发生明显变化,但HBV的复制导致4种HLH因子mRNA（E2F4,TCF3,E40和USF1）发生显着上调和2种HLH因子（Clock和HIF1α）的显着下调。8,E2F4过表达可以显着促进HBV Cp启动子活性和上调HBV pgRNA,HBV DNA的复制。9,在HBV复制的细胞中E2F4蛋白水平明显高于对照肝癌细胞;在HBV相关的肝癌临床样本中,E2F4的整体蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织（P<0.05）。10,通过IP和GST-pulldown实验表明E2F4和Id1存在相互作用,Id1的过表达减弱了HBV复制引起的p130和E2F4的核转移。11,过表达E2F4可以进一步促进干扰Id1导致HBV DNA的上调,相反过表达Id1并没有显着抑制干扰E2F4导致HBV DNA的下调。12,ChIP实验证实E2F4能被Cp启动子招募,Id1的过表达同样也阻止了Cp启动子对E2F4的招募作用。13,EMSA实验中,随着E2F4截短蛋白(E2F41-180)的增加,Cp启动子的迁移速率明显下降,并且Cp冷探针可以竞争结合E2F4截短蛋白。14,生物信息学表明E2F4在Cp上存在潜在的识别位点5’-1758TTAAAGGTC1766-3’,该位点的缺失导致E2F4对HBV Cp启动子活性的促进作用消失;在相应的HBV1.3突变体（HBV1.3 mut2.3）中,E2F4和Id1都失去了对HBV的调控作用。15,SPR和ITC实验表明包含5’-1758TTAAAGGTC1766-3’的Cp2短链可以直接与E2F4的DNA识别区域相互结合。16,进步分析发现5’-1758TTAAAGGTC1766-3’在HBV Gt A/B/C/D基因型中高度保守,并且E2F4和Id1对这四种基因型的HBV的调控具有普适性。结论:在本研究中,我们阐明了Id1及其相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录中的协同调控作用。研究结果显示,无论是在HBV复制背景下的细胞水平还是组织水平中,Id1表达水平均显着下调,而E2F4表达水平则显着上调;E2F4可以通过上调HBV Cp启动子活性从而促进HBV复制和相应的转录;上游Id1分子则通过与E2F4相互作用抑制其核内转移,导致HBV的复制和转录受抑制;5’-1758TTAAAGGTC1766-3’是E2F4在Cp启动子上的直接识别位点,在HBV A/B/C/D四种基因型中高度保守,是Id1和E2F4实现对四种基因型HBV调控的基础。我们的研究进一步完善了宿主因子对HBV的调控网络,为研发新的抗病毒策略提供了新的思路。
张璎[8]（2020）在《HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义》文中认为目的探讨血清原卟啉（PPⅨ）检测在乙型肝炎病毒（HBV）相关慢性肝病患者肝功能损害中的临床意义,明确血清PPⅨ能否作为慢性肝病患者肝功能损害的早期预警及病情评估的敏感参数。方法纳入2018年10月至2019年10月就诊于西安医学院第一附属医院诊断为HBV相关慢性肝病患者110例作为病例组,其中慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者50例,肝硬化（HC）患者40例,肝癌（HCC）患者20例,于同期在本院体检科征募健康人群40例作为对照组。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）,检测所有研究对象的血清PPⅨ,常规方法检测肝功、凝血等实验室指标,比较肝病患者与健康人群的血清PPⅨ;评价PPⅨ对HBV相关慢性肝病的诊断效能;分析PPⅨ与各实验室指标的相关性。结果1.（1）肝病组与对照组血清PPⅨ比较:CHB、HC、HCC三个肝病组血清PPⅨ显着高于对照组,44.29（25.99,85.36）、72.73（48.28,90.43）、91.79（68.34,121.52）vs15.43（10.87,20.16）ng/dl,差异均有统计学意义（P<0.05）;HC组虽较CHB组PPⅨ升高,但差异无统计学意义（P>0.05）;HCC组较CHB、HC组PPⅨ显着升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）CHB与HC患者组内血清PPⅨ比较:CHB患者进一步分为静止期与活动期,肝硬化患者分为代偿期与失代偿期。与代偿期HC患者相比,失代偿期HC患者血清PPⅨ显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）;而CHB患者活动期与静止期PPIX比较,差异无统计学意义（P>0.05）。HC患者代偿期与CHB患者静止期、HC患者失代偿期与CHB患者活动期PPⅨ比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;HC患者失代偿期较CHB患者静止期血清PPⅨ显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2.ROC曲线显示,PPⅨ诊断CHB的曲线下面积（AUC）为0.873,利用约登指数确定临界值为20.325 ng/dl,其敏感度为86%,特异度为77.5%;诊断HC的AUC为0.748,临界值为33.695 ng/dl,其敏感度为90%,特异度为61.1%;诊断HCC的AUC为0.812,临界值为65.26 ng/dl,其敏感度为85%,特异度为69.2%。3.（1）不同肝病组间实验室指标比较:HCC组AFP显着高于CHB和HC组,差异有统计学意义（P<0.05）,其余实验室指标与HC组相比,差异均无统计学意义（P>0.05）;与CHB组相比,HC组和HCC组TBIL、GGT、PT显着升高,PLT、CHE、ALB、PT%显着降低,差异均有统计学意义（P<0.05）;而HBV-DNA、ALT、ALP在三组间差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）CHB静止期和健康对照组的PPⅨ及肝功指标比较:CHB患者静止期PPⅨ显着高于健康对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,而肝功指标与健康对照组相比,仅CHE稍升高,其余差异均无统计学意义（P>0.05）。4.PPⅨ与各指标的相关性:CHB患者PPⅨ与各指标均不存在显着相关性（P>0.05）;HC患者PPⅨ与年龄、AFP、TBIL、AST呈正相关（P<0.05）,与PLT、CHE、ALB呈负相关（P<0.05）,仅与TBIL呈中等正相关（rs=0.587,P<0.05）,与ALB呈中等负相关（rs=-0.408,P<0.05）,其余均为弱相关（rs<0.4,P<0.05）;HCC患者PPⅨ与TBIL呈中等正相关（rs=0.470,P<0.05）,与CHE呈中等负相关（rs=-0.459,P<0.05）。结论1.HBV相关慢性肝病患者血清PPⅨ显着高于健康对照组,且与慢性肝病进展呈活动依赖性。2.血清PPⅨ可作为HBV相关慢性肝病患者肝损害的早期预警及病情评估的敏感参数。
陈彦猛[9]（2020）在《调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子鉴定及相关机制研究》文中研究表明目的:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一个严重危及人类健康的公共卫生问题,全球大约有2.57亿慢性HBV感染患者,此类患者可进展为慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）、肝硬化（liver cirrhosis,LC）和原发性肝细胞癌（hepatocellulor carcinoma,HCC）等相关疾病。我们课题组前期研究发现HBV感染肝细胞后,宿主天然免疫因子APOBEC3B在病毒复制的逆转录环节通过脱氨基作用编辑病毒颗粒中的DNA,通过尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase,UNG）介导的碱基切除修复（base excision repair,BER）途径降解病毒DNA,从而显着抑制HBV复制。但是在此过程中,参与调控APOBEC3B抗病毒功能的宿主因子研究甚少。因此本研究利用蛋白质质谱技术,结合生物信息学分析,筛选了参与调控APOBEC3B抑制病毒复制的关键宿主因子,并阐明了HSP70或DHX9调控APOBEC3B抗病毒的分子机制。研究结果有助于深入阐明宿主因子调控APOBEC3B与病毒相互作用的分子机制,理解病毒持续性感染的机制,同时,细化、区分宿主因子是否通过调控APOBEC3B脱氨酶功能或调控APOBEC3B与病毒核心蛋白/RNAs结合来调控APOBEC3B的抗病毒作用,有助于为新的抗病毒靶点确定提供理论依据。方法:第一部分:筛选参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子:首先在HEK293T细胞中分别转染HA-APOBEC3B表达质粒和/或HBV表达质粒,利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）富集和蛋白质质谱技术鉴定与APOBEC3B相互结合的宿主蛋白,基于GO功能信息构建了蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,筛选出与APOBEC3B相互作用的蛋白质家族:热休克蛋白（heat shock protein,HSP）家族和RNA解旋酶（DEAD-box RNA helicase,DDX）家族。进一步利用siRNA技术分别沉默内源性HSP家族蛋白（包括HSP70,HSP90和GRP78）和DDX家族蛋白（包括DDX3,DDX5,DHX9）的表达,筛选出参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的关键宿主蛋白HSP70和DHX9。第二部分:HSP70促进APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:首先采用Southern blot检测过表达HSP70对病毒DNA复制的影响;通过定点突变技术构建了HSP70 ATPase酶活性突变体（D10N,K71A,K77A和E175S）,研究了HSP70酶活性对APOBEC3B抗病毒功能的影响;利用HSP70特异性抑制剂VER155008,探索HSP70酶活性抑制后,APOBEC3B抑制病毒复制的变化;利用APOBEC3B催化编辑底物的特异性荧光探针,研究体外HSP70对APOBEC3B的脱氨酶活性的影响;利用3D-PCR和克隆测序在细胞模型上验证了HSP70对APOBEC3B编辑HBV DNA的变化;最后利用co-IP和GST Pulldown技术研究了HSP70与APOBEC3B直接相互作用的区段。第三部分:DHX9拮抗APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:首先应用co-IP和GST Pulldown技术研究了DHX9与APOBEC3B的直接结合作用;通过siRNA沉默内源性DHX9表达,研究了DHX9对APOBEC3B抗病毒功能的变化;在LPP-APOBEC3B-Huh7稳定表达细胞系和NTCP-HepG2的HBV感染模型中过表达DHX9,研究DHX9对APOBEC3B抗病毒作用的影响;通过荧光底物探针法和3D-PCR技术检测了DHX9在体外对APOBEC3B编辑酶活性的影响;应用co-IP方法检测了DHX9对APOBEC3B与HBc蛋白结合的影响;采用定点突变技术,构建了DHX9的3个区段缺失突变体:DHX9-△N（△3-252aa）,DHX9-△C（△1173-1260 aa）和DHX9-△N△C（△3-252 aa,△1173-1260 aa）,通过co-IP技术筛选出DHX9与APOBEC3B相互作用的关键区段,探索DHX9对APOBEC3B拮抗作用是否依赖于两者结合;通过干扰和过表达DHX9,分别在HEK293T转染-复制模型和HepAD38稳定HBV复制模型中通过RNA-IP和锚定PCR方法探索了DHX9拮抗APOBEC3B与HBV pgRNA的结合。结果:第一部分:筛选参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子:蛋白质质谱分析结果表明:HBV感染肝细胞后,有126种宿主蛋白可能与APOBEC3B相互作用。PPI分析表明,与APOBEC3B相互结合的宿主因子主要参与了蛋白质折叠、mRNA代谢和病毒复制等过程。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库分析表明,HBV感染的HCC样本中,APOBEC3B mRNA表达与HSP70 mRNA表达呈正相关性（r=0.13103,p=0.0075）,但与GRP78（r=-0.1757,p=0.1371）和HSP90（r=0.0212,p=0.8585）的表达均无相关性;特异性干扰HSP70蛋白表达后,APOBEC3B抑制病毒复制的作用减弱;特异性干扰DHX9表达后,APOBEC3B抑制病毒复制的作用增强。第二部分:HSP70促进APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:过表达HSP70后,HBV DNA水平下降,呈浓度依赖性;HSP70 ATPase酶活性丧失后,不影响APOBEC3B抗病毒作用;随着HSP70特异性抑制剂VER155008浓度逐渐升高,APOBEC3B抗病毒作用逐渐减弱;荧光底物探针法分析显示过表达HSP70后,APOBEC3B对底物探针的编辑作用明显增强,APOBEC3B敲除或加入VER155008后,HSP70丧失对APOBEC3B编辑底物的能力;3D-PCR和克隆测序结果显示,HSP70增强了APOBEC3B对病毒DNA的编辑能力;co-IP和GST Pulldown实验证实了HSP70与APOBEC3B发生了直接结合作用。第三部分:DHX9拮抗APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究:DHX9与APOBEC3B发生直接结合作用,当HBV感染后,DHX9与APOBEC3B结合作用增强;干扰内源性APOBEC3B表达后,DHX9促进HBV复制作用减弱;在LPP-APOBEC3B-Huh7的稳定表达细胞模型和NTCP-HepG2的HBV感染模型中干扰内源性DHX9表达后,APOBEC3B抑制HBV复制作用增强;过表达或干扰DHX9不改变APOBEC3B编辑HBV DNA的作用;DHX9不改变APOBEC3B与HBc的结合作用;DHX9 dsRBDs和RGG区段是其与APOBEC3B相互结合的重要区段,并且DHX9发挥拮抗APOBEC3B的功能需要两者的结合作用;干扰DHX9表达后,APOBEC3B与3.5 kb HBV RNA结合增强,过表达DHX9后,APOBEC3B与3.5 kb HBV RNA结合减弱;锚定PCR结果显示,与APOBEC3B结合的RNA为HBV pgRNA。结论:当HBV感染肝细胞时,APOBEC3B发挥抑制病毒复制的作用。同时宿主因子HSP70通过增强APOBEC3B的脱氨酶活性,正向促进APOBEC3B抗病毒功能;而HBV诱导DHX9表达上调,表达上调的DHX9通过N端dsRBDs区域和C端RGG区域结合APOBEC3B,在肝细胞核内拮抗了APOBEC3B与HBV pgRNA的结合,从而部分减弱了APOBEC3B的抗病毒功能。
梁子[10]（2020）在《HBV起源的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制及功能研究》文中进行了进一步梳理目前已发现许多真核生物编码circRNAs,越来越多的研究显示circRNAs具有miRNAs海绵体、与蛋白质相互作用、调节基因转录、翻译蛋白等功能,circRNAs在许多疾病的发生、发展过程中扮演重要的角色,并有可能成为新的药物治疗靶点。最近的一些研究发现,人类疱疹病毒EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）、卡波西肉瘤疱疹病毒（Kaposi’s Sarcoma Herpesvirus,KSHV）和人乳头瘤病毒16型（Human Papillomavirus 16,HPV16）等一些具内含子的病毒基因的转录本可以形成circRNAs。乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）是引发原发性肝癌的重要原因之一,已有一篇研究报道了1条起源于HBV前体基因组pgRNA的circRNA,并发现该circRNA并不是通过常规的反向剪接形成的,宿主的RNA解旋酶DHX9（DEx H-Box Helicase 9）参与了HBV circRNA的形成,但HBV形成circRNA的机制仍未明确,有关HBV起源的circRNA的功能研究仍没有涉及。本课题组前期的研究中发现了一个新的HBV编码的circRNA（命名为HBV＿circ＿1）,初步体外研究结果证实HBV＿circ＿1能抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖、提升HBV复制水平,并发现HBV＿circ＿1可能通过miRNA-6124/ST7轴和与细胞周期蛋白依赖性激酶-1（（Cyclin Dependent Kinases 1,CDK1））互作促进肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）的发生和发展。本研究在此基础上,深入探讨了HBV编码的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制,研究了HBV＿circ＿1对肿瘤发生与发展过程的影响、抑制细胞自噬及其作用机制,探讨了HBV＿circ＿1编码X蛋白的可能性。有关研究结果不仅能进一步加深对HBV基因组编码信息的理解,为circRNA的形成提供新的机制,也可从新的角度阐释HBV引起原发性肝癌的机制,为从RNA水平上治疗HBV感染引起的肝癌提供新靶点。1、HBV＿circ＿1来源及形成机制HBV编码的新circRNA HBV＿circ＿1长度约为2.5kb,其序列与HBV基因组（Gen Bank accession No.KU668446.1）489-2985 nt区域的序列对应,前期的研究通过PCR、Sanger测序以及Northern blotting对HBV＿circ＿1进行了初步验证。本研究在确认HBV＿circ＿1是环状RNA分子的基础上,通过序列比对和HBV＿circ＿1序列测定确认HBV＿circ＿1来源于HBV的pgRNA。HBV＿circ＿1上含有两个Junction sites（分别命名为Junction site A和Junction site B）。研究结果证实Junction site A是由位于pgRNA末端的正向重复序列通过同源重组形成,Junction site B是由切除pgRNA上对应于HBV基因组（Gen Bank accession No.KU668446.1）489-3182-2985nt区域的序列后连接形成,位于pgRNA末端的正向重复序列可促进circRNA形成,推测该过程有蛋白参与。2、HBV＿circ＿1对肿瘤发生与发展的影响前期的研究结果显示HBV＿circ＿1能抑制肝癌细胞HepG2细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖、提升HBV复制水平,暗示HBV＿circ＿1可能在肿瘤的形成和发展中发挥重要作用。本研究进一步探讨了HBV＿circ＿1对不同细胞表型特征的影响。流式细胞术检测结果显示,与转染表达circ GFP的对照质粒pLCDH-circ＿GFP相比,转染表达HBV＿circ＿1的质粒pLCDH-HBV＿circ＿1能促进正常小鼠肝细胞AML-12、人脐静脉内皮细胞HUVEC和肝癌细胞HepG2、SMMC-7721的增殖,加快AML-12、HUVEC和SMMC-7721的细胞周期进程;将转染pLCDH-HBV＿circ＿1或转染pLCDH-ciR空载的SMMC-7721细胞移植至裸鼠,结果显示,HBV＿circ＿1能促进SMMC-7721细胞在体内形成肿瘤。PCR结果显示,在转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体组织中存在HBV＿circ＿1,除在一例成瘤小鼠的肝脏组织中检测到HBV＿circ＿1外,在其他组织（心脏、肾脏、小肠、胃、肌肉以及脑）中均未检测到HBV＿circ＿1。对瘤体进行HE染色和免疫组化的结果显示,转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体的恶性程度以及瘤体中Ki67和Cyclin D1的表达水平均高于对照组。这些结果表明,HBV＿circ＿1能加快细胞周期进程,促进细胞增殖,促进肿瘤的形成与发展。3、HBV＿circ＿1抑制细胞自噬及机制研究自噬在肿瘤的发生与发展中扮演重要角色,本研究中从自噬角度探讨了HBV＿circ＿1促进肿瘤发生、发展的机制。Western blotting和细胞免疫荧光的结果显示,瞬时表达HBV＿circ＿1能促进p62的累积和聚集、抑制LC3-II形成、抵消雷帕霉素对自噬的促进作用,而敲降HBV＿circ＿1的表达促进HepG2.2.15细胞自噬的发生,说明HBV＿circ＿1可以抑制细胞自噬。免疫组化的结果显示,在注射表达HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体中p62的累积量明显高于对照组,证实了HBV＿circ＿1能够抑制自噬。qPCR结果显示,调节HBV＿circ＿1表达对自噬起始复合物关键基因的表达无明显影响,暗示HBV＿circ＿1不参与调节自噬起始过程。RNA pull down、RIP实验结果证实HBV＿circ＿1与PHB2互作。信息学分析结果显示,PHB2与HBV＿circ＿1的结合区域包含了PHB2与LC3的结合区域,暗示HBV＿circ＿1可能与LC3竞争性结合PHB2。CO-IP实验证实,HBV＿circ＿1可抑制PHB2与LC3之间的相互作用,而HBV＿circ＿1的突变体（缺失与PHB2结合区域）则不能与LC3竞争性结合PHB2,也失去了抑制细胞自噬的作用。这些结果表明HBV＿circ＿1通过与LC3竞争性结合PHB2发挥抑制自噬的作用,并由此促进肿瘤的发生与发展,研究结果为理解HBV的致癌机理提供了新的视角,也为HBV诱导的肝癌治疗提供了新的靶点。4、HBV＿circ＿1能够编码X蛋白已有研究证实部分circRNAs能以帽子结构非依赖性方式编码蛋白。对HBV＿circ＿1序列进行了信息学分析,发现HBV＿circ＿1上有HBx的完整开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）、内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）和N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,推测HBV＿circ＿1具有编码X蛋白的潜力。细胞免疫荧光检测结果显示,在转染HBV＿circ＿1表达质粒pLCDH-HBV＿circ＿1的HepG2细胞中存在少量X蛋白;用Ds Red序列替换pLCDH-HBV＿circ＿1质粒中HBx的ORF,构建pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red重组质粒,在转染pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red的HepG2细胞中也能观察到Ds Red的表达。进一步,通过免疫组化在转染pLCDH-HBV＿circ＿1的SMMC-7721细胞形成的瘤体中检测到X蛋白,而在转染pLCDH-ciR的SMMC-7721细胞形成的对照瘤体中检测不到X蛋白。以上结果说明HBV＿circ＿1能够编码X蛋白。研究结果从HBV＿circ＿1编码X蛋白的角度解释了HBV＿circ＿1促进癌症的发生、发展过程的机制。
二、HBV核心蛋白作为免疫载体的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV核心蛋白作为免疫载体的研究进展（论文提纲范文）
（1）基于TurboID邻近标记技术筛选和鉴定HBV复制相关因子（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 基于TurboID邻近标记技术筛选HBV转录相关因子 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 STAU1 调控HBV复制的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:HBV cccDNA国内外研究进展概述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表或撰写的文章 |
（2）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 背景知识 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 乙型肝炎病毒包膜蛋白 |
| 1.1.3 宿主限制性因子概述 |
| 1.1.4 SERINC家族介绍及SERINC5 抗病毒作用 |
| 1.2 论文设计 |
| 1.2.1 论文目的和意义 |
| 1.2.2 实验设计 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 菌株及培养基 |
| 2.1.2 质粒构建与载体信息 |
| 2.1.3 细胞系 |
| 2.1.4 抗体与siRNA |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.2 DNA的纯化回收 |
| 2.2.3 连接反应及感受态细胞的转化 |
| 2.2.4 质粒提取 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 HBV病毒的制备及病毒感染 |
| 2.2.8 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.2.9 HBV核心颗粒DNA(Core particle DNA)的提取 |
| 2.2.10 RNA提取 |
| 2.2.11 Southern blot检测HBV核心颗粒DNA |
| 2.2.12 Northern blot检测HBV RNA |
| 2.2.13 细胞上清中HBV完整病毒粒子纯化及DNA提取 |
| 2.2.14 实时定量PCR |
| 2.2.15 Western blot及显色 |
| 2.2.16 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation) |
| 2.2.17 免疫荧光共定位 |
| 2.2.18 统计学方法 |
| 第3章 结果与讨论 |
| 3.1 SERINC5 抑制HBV的分泌 |
| 3.1.1 SERINC5 降低HBV分泌到上清中的HBsAg水平 |
| 3.1.2 SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子的分泌 |
| 3.1.3 下调SERINC5 的表达, HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌增加 |
| 3.1.4 HepG2.2.15 细胞中,SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌 |
| 3.1.5 HepG2-NTCP细胞中SERINC5 抑制HBV完整病毒粒子及HBsAg的分泌 |
| 3.1.6 小结 |
| 3.2 SERINC5 影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.1 SERINC5 对HBx、Core蛋白表达无影响 |
| 3.2.2 SERINC5 影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.3 SERINC5 不会通过泛素蛋白酶体途径或自噬溶酶体途径影响HBV包膜蛋白表达量和糖基化修饰 |
| 3.2.4 SERINC5 不影响HIV-1 包膜蛋白Env糖基化修饰 |
| 3.2.5 SERINC1 不影响HBV包膜蛋白糖基化修饰 |
| 3.2.6 小结 |
| 3.3 SERINC5 通过影响HBV包膜蛋白糖基化修饰抑制HBV病毒粒子分泌 |
| 3.3.1 SERINC5 对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与包膜蛋白糖基化位点突变体相似 |
| 3.3.2 SERINC5 对HBV包膜蛋白糖基化修饰的影响与衣霉素对包膜蛋白糖基化的抑制作用相似 |
| 3.3.3 确认SERINC5 通过影响HBV包膜蛋白的糖基化修饰,抑制HBV病毒粒子分泌 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 SERINC5 与LHBS在细胞高尔基体共定位,并能与LHBS, MHBS和SHBS结合 |
| 3.4.1 SERINC5 与LHBs在细胞高尔基体共定位 |
| 3.4.2 SERINC5 能够分别与LHBs, MHBs和SHBs在细胞内结合 |
| 3.4.3 小结 |
| 3.5 SERINC5 抑制HBV功能区的鉴定 |
| 3.5.1 SERINC5 截短突变体对HBV分泌的抑制 |
| 3.5.2 SERINC5 截短突变体对LHBs及MHBs蛋白糖基化修饰的影响 |
| 3.5.3 SERINC5 磷酸化修饰对其抑制HBV功能的影响 |
| 3.5.4 SERINC5 糖基化修饰对其抑制HBV功能的影响 |
| 3.5.5 小结 |
| 3.6 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）猪圆环病毒的入核机制研究（论文提纲范文）
| 本研究获得以下项目资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类学地位 |
| 2 猪圆环病毒的流行 |
| 3 猪圆环病毒的基因组结构 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码蛋白及其功能 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 |
| 4.2 Cap蛋白 |
| 4.3 ORF3蛋白 |
| 4.4 ORF4蛋白 |
| 5 猪圆环病毒的起源 |
| 6 猪圆环病毒的跨种传播 |
| 7 猪圆环病毒的培养增殖和感染性克隆研究进展 |
| 第二章 HDAC6蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 HDAC6:它与其他HDACs有什么不同? |
| 2 HDAC6蛋白的结构特征 |
| 3 HDAC6蛋白的功能特异性 |
| 3.1 去乙酰化酶依赖性功能 |
| 3.2 泛素依赖性功能 |
| 4 HDAC6蛋白抑制病毒的感染(抗病毒) |
| 4.1 调节微管稳定性以抑制病毒感染 |
| 4.2 融合和入侵 |
| 4.3 核靶向运输 |
| 4.4 复制 |
| 4.5 组装和释放 |
| 4.6 调控抗病毒免疫应答 |
| 5 HDAC6蛋白促进病毒的感染(促病毒) |
| 5.1 HDAC6介导的聚集体途径有利于病毒的脱衣壳 |
| 5.2 促进病毒的致病过程 |
| 6 展望 |
| 第三章 病毒入核机制的研究进展 |
| 1 细胞的核转运过程概述 |
| 2 病毒入核与核膜 |
| 3 病毒破坏核膜或核纤层入核 |
| 4 囊膜病毒的入核 |
| 5 无囊膜病毒的入核 |
| 第四章 NPM1蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 核仁磷蛋白NPM1的结构特征和主要功能 |
| 2 在病毒感染过程中NPM1蛋白与不同病毒蛋白的相互作用 |
| 2.1 腺病毒(AdV) |
| 2.2 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) |
| 2.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) |
| 2.4 丙型肝炎病毒(HCV) |
| 2.5 乙型肝炎病毒(HBV) |
| 2.6 丁型肝炎病毒(HDV) |
| 2.7 其他病毒 |
| 3 NPM1蛋白抑制剂作为抗病毒治疗药物 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 HDAC6酶活性测定 |
| 2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.13 原核表达 |
| 2.14 GST pull-down |
| 2.15 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.16 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.17 病毒滴度测定 |
| 2.18 细胞活力检测实验 |
| 2.19 HDAC6蛋白过表达细胞系的构建 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 Cap蛋白能促进PK-15细胞中α-tubulin的乙酰化修饰水平 |
| 3.2 微管蛋白乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 |
| 3.3 PCV2感染的PK-15细胞或质粒转染的293T细胞中Cap蛋白和HDAC6的亚细胞定位分析 |
| 3.4 PCV2 Cap蛋白与HDAC6的互作关系分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白的42-100位氨基酸介导与HDAC6蛋白的相互作用 |
| 3.6 HDAC6蛋白的HD1、HD2和ZnF结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性 |
| 3.8 HDAC6蛋白抑制PCV2病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 病毒接种 |
| 2.9 蛋白样品制备 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 原核表达 |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 银染 |
| 2.15 蛋白质相互作用网络的构建与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀串联质谱方法鉴定PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白 |
| 3.2 蛋白质相互作用网络图谱的绘制与分析 |
| 3.3 GO注释与分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 验证PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 核仁磷蛋白NPM1调控PCV2病毒入核的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.15 病毒滴度测定 |
| 2.16 细胞活力检测实验 |
| 2.17 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.18 wt-和mA-PCV2突变体病毒拯救 |
| 2.19 胞浆/胞核组分抽提 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染PK-15细胞中NPM1蛋白水平的变化 |
| 3.2 NPM1的RNAi细胞系的建立 |
| 3.3 NPM1蛋白促进PCV2病毒的复制 |
| 3.4 PCV2感染或质粒转染的PK-15细胞中病毒蛋白Cap、Rep、ORF3、ORF4和NPM1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白与NPM1的互作关系分析 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白的核定位信号(NLS)介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白NLS-A的精氨酸富集区(ARM)是与NPM1蛋白互作的关键氨基酸位点 |
| 3.8 PCV2 Cap蛋白的ARM是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1-OligoD结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.10 NPM1蛋白的Ser48介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.11 NPM1蛋白Ser48的保守性和PCV2 Cap蛋白NLS-A与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.12 NPM1蛋白敲降细胞系中回补mNPM1不同突变体对PCV2复制的影响 |
| 3.13 NPM1蛋白促进PCV2病毒的入核 |
| 3.14 在PCV2感染晚期,NPM1蛋白从核仁易位至胞质 |
| 3.15 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的拯救 |
| 3.16 PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM对于PCV2的复制具有重要作用 |
| 3.17 wt-PCV2和mA-PCV2的Cap蛋白与NPM1在病毒感染细胞中的互作关系分析 |
| 3.18 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的入核能力分析 |
| 3.19 NPM1蛋白与PCV2病毒衣壳蛋白结合促进PCV2病毒入核的分子模型 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.8 蛋白样品制备 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 GST pull-down |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.12 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NPM1蛋白对于PCV3 Cap蛋白的核仁定位是必需的 |
| 3.2 PCV3 Cap蛋白与NPM1蛋白在转染细胞中的共定位分析 |
| 3.3 PCV3 Cap蛋白与NPM1在质粒转染细胞中的互作关系分析 |
| 3.4 质粒共转外源性表达蛋白的互作关系分析 |
| 3.5 体外表达纯化蛋白的互作关系分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 不同种属的圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的互作 |
| 3.8 PCV3 Cap蛋白的NLS同时也是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1蛋白与PCV3 Cap蛋白互作关键氨基酸位点的鉴定 |
| 3.10 PCV3 Cap蛋白NLS(1-34aa)与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.11 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定NPM1/PCV3 Cap的相互作用 |
| 3.12 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质影响NPM1蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 本文所用引物列表 |
| 附录B 不同种属的圆环病毒Cap蛋白的NLS序列 |
| 附录C 全文缩略词 |
| 附录D 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（5）乙肝核心抗原双抗体夹心酶联免疫方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 制备抗HBcAg单克隆抗体 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 重组兔源单克隆抗体 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（6）乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 HBV-pgRNA通过与IGF2BP3相互调控,促进HBV相关HCC的发生和进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分 IFN-α-2a通过增加pgRNA的m6A修饰降低其稳定性,阻断pg RNA-IGF2BP3 信号轴,抑制HCC的进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 乙型肝炎病毒前基因组 RNA 在乙肝相关疾病发病机制及临床应用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 Id1在HBV表达的环境中发生下调 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中pgRNA的表达水平 |
| 2.2 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中Id1和HBc的蛋白表达水平 |
| 2.3 HBV复制在细胞水平对Id1表达水平的影响 |
| 2.4 比较HBV转基因小鼠和普通C57 小鼠中Id1 蛋白表达水平 |
| 2.5 HBV感染HepG2-NTCP对 Id1 表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Id1通过抑制核心启动子的活性下调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.2 过表达Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.3 过表达Id1对HepG2-NTCP模型中HBV复制水平的影响 |
| 2.4 过表达Id1对HBV4个启动子活性的影响 |
| 2.5 沉默Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.6 沉默Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.7 过表达Id1对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 E2F4通过激活核心启动子的活性上调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1筛查对HBV转录调控的转录因子的影响 |
| 2.2 HepG2 转染HBV1.1 倍体分析HLH转录因子表达变化 |
| 2.3 过表达E2F4激活HBV核心启动子活性 |
| 2.4 过表达E2F4促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中E2F4的蛋白表达水平 |
| 2.6 沉默E2F4对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Id1 通过结合E2F4 并阻断其对HBV核心启动子的激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Id1抑制E2F4的核转移 |
| 2.2 Id1和E2F4的相互作用 |
| 2.3 E2F4介导Id1对HBV抑制作用 |
| 2.4 E2F4通过识别核心启动子促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 Id1阻断核心启动子对E2F4的招募 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 E2F4 通过识别结合Cp启动子上5'-1758TTAAAGGTC1766-3'位点对HBV表达调控中的实现促进作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选E2F4在Cp启动子上的识别位点 |
| 2.2 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'是E2F4和Cp的相互作用的基础 |
| 2.3 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的突变体导致E2F4和Id1 失去对HBV调控作用 |
| 2.4 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的保守性是E2F4和Id1对A-D基因型HBV发挥调控作用的基础 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的文章 |
（8）HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 HBX与线粒体功能障碍的相关研究 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 HBx蛋白 |
| 1.3 HBx致线粒体损害 |
| 1.3.1 参与线粒体氧化应激 |
| 1.3.2 调节胞浆Ca2+信号转导 |
| 1.3.3 引发线粒体自噬 |
| 1.3.4 促进细胞凋亡 |
| 1.4 展望 |
| 2 卟啉及血红素合成与代谢 |
| 2.1 卟啉及卟啉类化合物 |
| 2.2 血红素及其合成途径 |
| 2.3 血红素合成关键酶 |
| 2.3.1 ALAS |
| 2.3.2 FECH |
| 2.4 卟啉转运蛋白 |
| 2.5 原卟啉(PPⅨ) |
| 2.6 卟啉代谢异常相关疾病 |
| 3 卟啉代谢与慢性肝病的研究进展 |
| 3.1 卟啉代谢与慢性乙型病毒性肝炎 |
| 3.2 卟啉代谢与慢性丙型病毒性肝炎 |
| 3.3 卟啉代谢与肝硬化 |
| 3.4 卟啉代谢与肝细胞癌 |
| 3.5 慢性肝病卟啉代谢异常的治疗 |
| 3.6 展望 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入及排除标准 |
| 1.2.1 病例组 |
| 1.2.2 对照组 |
| 1.3 主要仪器试剂 |
| 1.3.1 主要仪器与设备 |
| 1.3.2 主要实验试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 一般资料收集 |
| 1.4.2 血清样品采集及保存 |
| 1.4.3 常规实验室检测 |
| 1.4.4 影像学检查 |
| 1.4.5 血清PPⅨ浓度检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肝病组和对照组基本资料比较 |
| 2.2 血清PPⅨ检测结果 |
| 2.3 PPⅨ诊断HBV相关慢性肝病的效能 |
| 2.4 不同肝病组间实验室指标比较 |
| 2.5 CHB患者静止期与健康对照组PPⅨ及肝功比较 |
| 2.6 不同患者PPⅨ与各指标的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PPⅨ与肝脏疾病的关系 |
| 3.2 HBV相关慢性肝病患者血清PPⅨ的表达及意义 |
| 3.3 PPⅨ诊断HBV相关慢性肝病的效能 |
| 3.4 PPⅨ与肝功能指标的相关性 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（9）调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子鉴定及相关机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 :筛选参与调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 :HSP70 促进APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 :DHX9 拮抗APOBEC3B的抗HBV作用的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间撰写和发表的论文 |
（10）HBV起源的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 CIRCRNA研究进展 |
| 1.1 CircRNAs简述 |
| 1.2 circRNAs的来源及环化机制 |
| 1.3 CircRNAs的功能 |
| 1.4 circRNAs与肝癌 |
| 1.5 病毒编码的circRNAs研究进展 |
| 2.自噬相关研究进展 |
| 2.1 自噬简述 |
| 2.2 HBV影响自噬的研究进展 |
| 2.3 CircRNAs与细胞自噬 |
| 2.4 自噬与肝癌 |
| 参考文献 |
| 第二章 研究目的与内容 |
| 1.研究目的意义 |
| 2.研究内容 |
| 2.1 HBV＿circ＿1 来源及形成机制 |
| 2.2 HBV＿circ＿1 对肿瘤发生与发展的影响 |
| 2.3 HBV＿circ＿1 抑制细胞自噬及机制研究 |
| 2.4 HBV＿circ＿1 能够编码X蛋白 |
| 3.研究技术路线 |
| 第三章 HBV＿CIRC＿1 来源及形成机制 |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 cDNA制备 |
| 2.4 HBV＿circ＿1的Junction site A位点及其形成方式确认 |
| 2.5 HBV＿circ＿1 序列测定 |
| 2.6 pcDNA3.1(+)-pgRNA-eGFP质粒构建 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 基因组抽提 |
| 2.9 体外制备带有T7 启动子的RS1-eGFP-RS2 |
| 2.10 PCR验证pgRNA的正向重复序列促进环状RNA分子形成 |
| 2.11 circRNA-protein pull down筛选与pgRNA末端重复序列相互作用的蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV＿circ＿1 具有2个Junction sites、来源于HBV转录产物pgRNA |
| 3.2 pgRNA的正向重复序列可以促进环状RNA分子的形成 |
| 3.3 正向重复序列相互作用蛋白的初步筛选 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 HBV＿CIRC＿1 对肿瘤形成和发展的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞表型特征检测 |
| 2.3 肿瘤动物模型的建立 |
| 2.4 外泌体提取 |
| 2.5 外泌体、成瘤裸鼠的瘤体及其他组织中HBV＿circ＿1 的检测 |
| 2.6 苏木精—伊红染色法(HE染色) |
| 2.7 免疫组化 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV＿circ＿1 促进细胞增殖 |
| 3.2 HBV＿circ＿1 促进细胞周期 |
| 3.3 HBV＿circ＿1 促进肿瘤形成与发展 |
| 3.4 HBV＿circ＿1 在瘤体及其他组织中的分布 |
| 3.5 HBV＿circ＿1 增加肿瘤的恶性程度 |
| 3.6 HBV＿circ＿1 促进瘤体中的细胞增殖和细胞周期 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 HBV＿CIRC＿1抑制细胞自噬及其机制研究 |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.0 实验试剂 |
| 2.1 调节细胞内HBV＿circ＿1 的表达 |
| 2.2 细胞蛋白收集 |
| 2.3 SDS-PAGE及 Western blotting |
| 2.4 细胞免疫荧光 |
| 2.5 MTT法检测药物毒性 |
| 2.6 免疫组化检测瘤体中p62的表达 |
| 2.7 Real-time PCR检测自噬起始复合物相关基因和PHB2 表达水平 |
| 2.8 验证HBV＿circ＿1与PHB2 的相互作用 |
| 2.9 生物信息学分析相互作用位点 |
| 2.10 pLCDH-HBV＿circ＿1-mut质粒构建 |
| 2.11 Co-IP |
| 2.12 数据分析统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 qPCR检测调节细胞内HBV＿circ＿1 表达的效率 |
| 3.2 瞬时表达HBV＿circ＿1 抑制细胞自噬 |
| 3.3 下调HepG2.2.15 细胞中HBV＿circ＿1 表达促进细胞自噬 |
| 3.4 HBV＿circ＿1 可以抵消雷帕霉素对自噬的诱导作用 |
| 3.5 HBV＿circ＿1 促进瘤体中p62 的累积 |
| 3.6 HBV＿circ＿1 对自噬起始过程相关基因的转录水平无明显影响 |
| 3.7 HBV＿circ＿1 不影响PHB2 表达 |
| 3.8 RNA pull-down和 RIP检测HBV＿circ＿1与PHB2 间相互作用 |
| 3.9 HBV＿circ＿1与LC3 竞争性结合PHB2 |
| 3.10 HBV＿circ＿1 突变体丧失对细胞自噬的抑制作用 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 HBV＿CIRC＿1 编码HBx |
| 1.引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 分析HBV＿circ＿1 编码X蛋白的潜力 |
| 2.3 细胞水平检测HBV＿circ＿1 编码X蛋白 |
| 2.4 pLCDH-HBV＿circ＿1-Ds Red重组质粒构建 |
| 2.5 瘤体中检测HBV＿circ＿1 编码X蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HBV＿circ＿1 具有编码蛋白的潜力 |
| 3.2 转染pLCDH-HBV＿circ＿1 的细胞中可检测到X蛋白 |
| 3.3 转染pLCDH-HBV＿circ＿1 细胞形成的瘤体中可检测到X蛋白 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 总结论 |
| 创新点 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 实验室常用仪器 |
| 附录三 HBV＿circ＿1序列 |
| 附录四 重组质粒序列 |
| 附录五 载体图谱 |
| 附录六 原始数据 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 致谢 |
四、HBV核心蛋白作为免疫载体的研究进展（论文参考文献）
- [1]基于TurboID邻近标记技术筛选和鉴定HBV复制相关因子[D]. 魏霞飞. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [3]宿主限制性因子SERINC5对乙型肝炎病毒的抑制作用及机制的研究[D]. 刘悦. 吉林大学, 2020(01)
- [4]猪圆环病毒的入核机制研究[D]. 周建卫. 浙江大学, 2020
- [5]乙肝核心抗原双抗体夹心酶联免疫方法的建立[D]. 郑晓文. 广州医科大学, 2020
- [6]乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究[D]. 丁文斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020
- [7]Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究[D]. 魏杰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [8]HBV相关慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ检测的临床意义[D]. 张璎. 西安医学院, 2020(08)
- [9]调控APOBEC3B抑制HBV复制的宿主因子鉴定及相关机制研究[D]. 陈彦猛. 重庆医科大学, 2020(01)
- [10]HBV起源的circRNA HBV＿circ＿1的形成机制及功能研究[D]. 梁子. 苏州大学, 2020(06)